蔡如玉 常世敏 宋春麗

(1. 河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056038；2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001)

“鳳丹”牡丹既是常見的藥用品種，也是重要的油用品種[1]，在中國各地廣泛種植。目前有關(guān)牡丹籽油提取工藝[2]、成分分析[3]、抗氧化活性分析[4]，牡丹籽黃酮提取工藝[5]等方面的研究較多，而關(guān)于牡丹籽多酚的提取工藝及其抗氧化活性尚未見報(bào)道。

多酚是高等植物中含有多元酚結(jié)構(gòu)的次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物根、皮、葉以及果實(shí)中[6]。研究[7-8]表明，多酚具有抗菌、抗病毒、抗氧化、降血糖、降血脂、抗動(dòng)脈硬化、抗衰老及預(yù)防心血管疾病等作用。王彥陽等[9]采用超聲波輔助對(duì)腰果葉多酚進(jìn)行了提取，其得率為10.29%；魏春紅等[10]研究了酶法輔助提取小米多酚，最佳提取條件下總酚含量為4.83 mg/g；呂蒙蒙等[11]采用響應(yīng)面法優(yōu)化了超聲波—微波協(xié)同萃取杉木球果鱗片多酚，其提取率相較于索氏提取法提高了76.58%，且縮短了提取時(shí)間；朱素英[12]、陳程等[13]分別采用超聲波輔助對(duì)牡丹花和牡丹籽粕中多酚提取進(jìn)行了研究，其提取率分別為130.627 mg/mL和17.42 mg/g。試驗(yàn)擬對(duì)牡丹籽多酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并采用體外抗氧化試驗(yàn)評(píng)價(jià)其抗氧化活性，為牡丹籽的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

“鳳丹”油用牡丹籽：河北國福牡丹科技開發(fā)有限公司；

沒食子酸標(biāo)品、Folin-Ciocalteu試劑：分析純，北京索萊寶科技有限公司；

1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基：分析純，梯希(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；

2,2- 聯(lián)氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽：分析純，生工生物工程(上海)股份有限公司；

抗壞血酸、無水乙醇：分析純，天津歐博凱化工有限公司；

過硫酸鉀：分析純，山東西亞化學(xué)股份有限公司；

無水碳酸鈉：分析純，天津市紅巖化學(xué)試劑廠；

搖擺式高速中藥粉碎機(jī)：F-1000型，1 000 g，新昌縣德科機(jī)械有限公司；

高速臺(tái)式離心機(jī)：TGL-10B型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

高功率數(shù)控超聲波清洗器：KQ-200KDB型，昆山市超聲儀器有限公司；

恒溫磁力攪拌器：85-2型，上海司樂儀器有限公司；

紫外—可見分光光度計(jì)：MAPADA型，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 牡丹籽多酚提取 牡丹籽粉碎，過50目篩，稱取5 g，按相應(yīng)的液料比、乙醇濃度、提取溫度、超聲時(shí)間、超聲功率進(jìn)行多酚提取，5 000 r/min離心10 min， 收集上清液，冷藏備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照文獻(xiàn)[14]，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=7.298 8X+0.015 7，R2=0.997 7。

1.2.3 多酚含量的測定 采用福林酚試劑法[15]。按式(1) 計(jì)算多酚提取率。

(1)

式中：

R——多酚提取率，mg/g；

C——提取液多酚濃度，mg/mL；

V——提取液體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，g。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

(1) 料液比：精準(zhǔn)稱量5 g牡丹籽粉于錐形瓶，分別按料液比1∶10，1∶14，1∶18，1∶22，1∶26 (g/mL)加入60%乙醇，用磁力攪拌器攪拌30 min，于提取溫度55 ℃、超聲功率160 W下提取100 min，考察料液比對(duì)多酚提取率的影響。

(2) 超聲時(shí)間：精準(zhǔn)稱量5 g牡丹籽粉于錐形瓶，按料液比1∶18 (g/mL)加入60%乙醇，用磁力攪拌器攪拌30 min，于提取溫度55 ℃、超聲功率160 W下分別提取60，80，100，120，140 min，考察超聲時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響。

(3) 提取溫度：精準(zhǔn)稱量5 g牡丹籽粉于錐形瓶，按料液比1∶18 (g/mL)加入60%乙醇，用磁力攪拌器攪拌30 min，于提取溫度分別為45，50，55，60，65 ℃，超聲功率160 W下提取100 min，考察提取溫度對(duì)多酚提取率的影響。

(4) 超聲功率：精準(zhǔn)稱量5 g牡丹籽粉于錐形瓶，按料液比1∶18 (g/mL)加入60%乙醇，用磁力攪拌器攪拌30 min，于提取溫度55 ℃、超聲功率分別為120，140，160，180，200 W下提取100 min，考察超聲功率對(duì)多酚提取率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以料液比、超聲時(shí)間、提取溫度、超聲功率為試驗(yàn)因素，以多酚提取得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化牡丹籽多酚提取工藝條件[16]。

1.2.6 體外抗氧化活性

(1) DPPH 自由基清除能力測定：參照文獻(xiàn)[17]并略有改動(dòng)，精確稱取1.0 mg DPPH，加入20 mL無水乙醇，避光放置，3.5 h內(nèi)用完。取2 mL DPPH溶液，加入1 mL 無水乙醇，混勻，室溫避光反應(yīng)30 min，測定517 nm處吸光度。以抗壞血酸為對(duì)照，每組重復(fù)3次，取平均值。按式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率。

(2)

式中：

D——自由基清除率，%；

A0——反應(yīng)體系吸光度；

A——樣品吸光度；

(2) ABTS自由基清除能力測定：參照文獻(xiàn)[18]并略有改動(dòng)。精確稱取3.0 mg ABTS，加入0.735 mL蒸餾水超聲輔助溶解，配置7.4 mmol/L的ABTS 儲(chǔ)備液。取1 mg 過硫酸鉀，加入1.43 mL蒸餾水溶解，配置2.6 mmol/mL 的過硫酸鉀儲(chǔ)備液。ABTS儲(chǔ)備液與過硫酸鉀儲(chǔ)備液按體積比1∶1混勻，室溫避光反應(yīng)12～16 h。用無水乙醇將ABTS母液稀釋40～50倍，測定734 nm處測吸光度。取50 μL不同濃度樣品液，加入ABTS母液950 μL，振動(dòng)10 s，放置6 min， 測定734 nm處吸光值。以抗壞血酸為對(duì)照，每組重復(fù)3次，取平均值。按式(2)計(jì)算ABTS自由基清除率。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 單因素試驗(yàn)結(jié)果及體外抗氧化活性采用SPSS軟件進(jìn)行分析，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)牡丹籽多酚提取率的影響 由圖1可知，多酚提取率隨料液比的不斷增加而下降[19]。綜合考慮，選取1∶18 (g/mL)為最佳料液比。

圖1 料液比對(duì)多酚提取率的影響

2.1.2 提取溫度對(duì)牡丹籽多酚提取率的影響 由圖2可知，牡丹籽多酚提取率隨提取溫度的升高先上升后下降，當(dāng)提取溫度為55 ℃時(shí)，提取率最大，可能是提取溫度過高導(dǎo)致熱敏感的多酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化或降解，從而使提取率降低[17]。故選取55 ℃為最佳提取溫度。

圖2 提取溫度對(duì)多酚提取率的影響

2.1.3 超聲功率對(duì)牡丹籽多酚提取率的影響 由圖3可知，多酚提取率隨超聲功率的升高先增加后下降，可能是功率過大加快了物料的溫度與提取液的流動(dòng)，在提高多酚浸出的同時(shí)也加快了多酚的分解和氧化。故選取160 W 為最佳超聲功率。

圖3 超聲功率對(duì)多酚提取率的影響

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)牡丹籽多酚提取率的影響 由圖4可知，多酚提取率隨提取時(shí)間的延長先增加后下降，可能是多酚隨超聲時(shí)間的延長發(fā)生氧化、縮合及分解等反應(yīng)[20-21]。故選取100 min為最佳超聲時(shí)間。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以料液比、提取溫度、超聲功率、超聲時(shí)間為試驗(yàn)因素，以多酚提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken中心組合原理進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素與水平表見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面因素和水平設(shè)計(jì)表

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.2 模型的建立及方差分析 對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[22]，建立牡丹籽多酚提取率的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=33.28-0.066A+0.16B+0.038C-5.833D+0.038AB+0.083AC+0.013AD-0.047BC-0.023BD+0.033CD-0.090A2-0.19B2-0.082C2-0.13D2。

(3)

2.2.3 響應(yīng)面分析 進(jìn)一步對(duì)表3進(jìn)行分析可知，料液比與超聲功率的交互項(xiàng)對(duì)牡丹籽多酚提取的含量影響顯著(P<0.05)[24]。由圖5可知，在試驗(yàn)所選范圍內(nèi)，AC響應(yīng)面較為陡峭，響應(yīng)值存在極值，再次說明料液比與超聲功率交互作用影響顯著[25]。

圖5 兩因素交互作用對(duì)提取率的響應(yīng)面圖

表3 方差分析?

由響應(yīng)面建立的模型及二次回歸方程預(yù)測的最優(yōu)提取工藝條件為料液比1∶13.74 (g/mL)、提取溫度57 ℃、

超聲功率159.16 W、超聲時(shí)間98.44 min，此條件下多酚提取率為33.32 mg/g。為便于操作，將提取工藝條件修正為料液比1∶14 (g/mL)、提取溫度57 ℃、超聲功率160 W、超聲時(shí)間98 min，進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，得到牡丹籽多酚提取率為33.38 mg/g，與預(yù)測值相近，說明該提取模型預(yù)測優(yōu)化牡丹籽多酚提取工藝是準(zhǔn)確可行的。

2.3 體外抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力 由圖6可知，DPPH自由基清除能力隨多酚粗提取液濃度的增加逐漸增強(qiáng)，當(dāng)多酚粗提液濃度為100 μg/mL時(shí)，其清除能力達(dá)14.17%，低于維生素C的，表明多酚粗提液對(duì)DPPH自由基具有一定的清除能力。

圖6 牡丹籽多酚對(duì)DPPH自由基的清除能力

2.3.2 ABTS自由基清除能力 由圖7可知，ABTS自由基清除能力隨多酚粗提取液濃度的增加而顯著增強(qiáng)，當(dāng)多酚粗提取液濃度為40 μg/mL時(shí)，其清除能力明顯高于抗壞血酸的，表明多酚粗提液對(duì)ABTS自由基有較強(qiáng)的清除能力。

圖7 牡丹籽多酚對(duì)ABTS自由基的清除能力

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明，牡丹籽多酚的最佳提取工藝條件為料液比1∶13 (g/mL)、提取溫度57 ℃、超聲功率160 W、超聲時(shí)間98 min，此條件下的提取率為33.38 mg/g。體外抗氧化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，牡丹籽多酚粗提液對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基均具有一定的清除能力，且呈良好的量效關(guān)系，表明牡丹籽多酚有可能成為一種新的天然抗氧化劑。后續(xù)可對(duì)“鳳丹”牡丹籽多酚的代謝途徑、單體種類及功能特性進(jìn)行研究。