王寬 劉慧榮 吳煥淦 張英英 翁志軍 秦秀娣 趙繼夢(mèng) 吳璐一

摘要? 目的：從維生素D參與免疫調(diào)節(jié)作用角度探討隔藥灸治療UC的作用機(jī)制。方法：采用4%葡聚糖硫酸鈉制備UC大鼠模型。將動(dòng)物隨機(jī)分為：正常組、模型組、隔藥灸組和SASP組。觀察各組大鼠DAI評(píng)分、結(jié)腸大體形態(tài)損傷評(píng)分及結(jié)腸組織病理學(xué)（HPS）評(píng)分、大鼠血清及結(jié)腸組織25（OH）D3、VDR濃度;檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織炎性細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α的表達(dá)和大鼠結(jié)腸組織VDR、RXRα mRNA的表達(dá);分析25（OH）D3與治療后DAI評(píng)分、結(jié)腸IFN-γ、TNF-α表達(dá)之間的相關(guān)性。結(jié)果：隔藥灸顯著降低UC大鼠DAI評(píng)分、結(jié)腸大體形態(tài)損傷評(píng)分及HPS評(píng)分（ P <0.05）;隔藥灸顯著升高UC大鼠血清和結(jié)腸中25（OH）D3、VDR濃度（ P <0.05），以及結(jié)腸組織中VDR、RXRαmRNA表達(dá)（ P <0.05）;隔藥灸降低UC大鼠結(jié)腸組織中IFN-γ、TNF-α表達(dá)水平（ P <0.05）。大鼠血清25（OH）D3濃度與治療后DAI評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，結(jié)腸25（OH）D3濃度分別與結(jié)腸IFN-γ、TNF-α表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。結(jié)論：隔藥灸可抑制UC大鼠結(jié)腸IFN-γ、TNF-α的表達(dá)，升高其血清和結(jié)腸中的維生素D及其受體的濃度;UC大鼠腸道炎癥與低濃度的維生素D呈負(fù)相關(guān)。

關(guān)鍵詞? 隔藥灸;潰瘍性結(jié)腸炎;25羥基維生素D3;維生素D受體;γ干擾素;腫瘤壞死因子-α

Study on the Effects of Vitamin D Participation in Herb-partitioned Moxibustion of Rats with Ulcerative Colitist

WANG Kuan1，LIU Huirong1，WU Huangan1，ZHANG Yingying1，WENG Zhijun1，QIN Xiudi1，ZHAO Jimeng1，WU Luyi2

（1 Key Laboratory of Acupuncture-Moxibustion and Immunological Effects，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China; 2 Shanghai Qigong Research Institure，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China）

Abstract Objective： From the perspective of vitamin D′s participation in immune regulation，the mechanism of herb-partitioned moxibustion in the treatment of UC was discussed. Methods： The UC rat model was prepared with 4% dextran sodium sulfate.The animals were randomly divided into：a normal group，a model group，a herb-partitioned moxibustion group and a SASP group.Observe the DAI score，gross morphological damage score of the colon，and histopathology（HPS）score of each group of rats，the concentration of 25（OH）D3 and VDR in rat serum and colon tissue; detect the inflammatory cytokine IFN-，TNF-α in rat colon tissue and the expression of TNF-α and the expression of VDR and RXRα mRNA in rat colon tissue; analyze the correlation between 25（OH）D3 and DAI score，colon IFN-γ and TNF-α expression after treatment. Results： Herb-partitioned moxibustion significantly reduced the DAI score，gross morphological damage score and HPS score of UC rats（ P <0.05）; herb-partitioned moxibustion significantly increased the concentration of 25（OH）D3 and VDR in the serum and colon of UC rats（ P <0.05），and the expression of VDR and RXRαmRNA in colon tissue（ P <0.05）; herb-partitioned moxibustion reduced the expression levels of IFN-γ and TNF-α in colon tissue of UC rats（ P <0.05）.The serum 25（OH）D3 concentration in rats was negatively correlated with the DAI score after treatment，and the colonic 25（OH）D3 concentration was significantly negatively correlated with the expression of colon IFN-γ and TNF-α. Conclusion： Herb-partitioned moxibustion could inhibit the expression of IFN-γ and TNF-α，and significantly increase the concentration of vitamin D and its receptors in the serum and colon; intestinal inflammation in UC rats is negatively correlated with low concentrations of vitamin D.

Keywords? Herb-partitioned Moxibustion; Ulcerative Colitis; 25（OH）D3; Vitamin D receptor; IFN-γ; TNF-α

中圖分類號(hào)：R245.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.14.007

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis，UC）屬炎癥性腸?。↖nflammatory Bowel Disease，IBD）范疇。UC是一種以反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹瀉，伴黏液膿血便和不同程度的全身癥狀為主要臨床表現(xiàn)的慢性非特異性炎癥性腸道疾病，主要發(fā)生在直腸、結(jié)腸黏膜和黏膜下層等部位，主要表現(xiàn)為潰瘍形成，隱窩膿腫或炎性反應(yīng)，杯狀細(xì)胞減少以及各類炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)等非特異性病理改變。該病為消化內(nèi)科常見(jiàn)疑難病，病程漫長(zhǎng)，且逐年加重，久治難愈。目前UC的病因和發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚，臨床對(duì)于UC也缺乏特異性的治療手段，而中醫(yī)針灸可有效改善UC的炎性反應(yīng)表現(xiàn)，對(duì)治療UC具有一定的優(yōu)勢(shì)[1-3]。

新近的流行病學(xué)調(diào)查研究顯示[4-5]，IBD的發(fā)生正呈現(xiàn)出全球化的變化趨勢(shì)，在亞洲及亞太地區(qū)國(guó)家，UC的發(fā)生較CD更為普遍，而且隨著人類生活水平的不斷提高，UC患者病例的報(bào)道數(shù)量也不斷增多，UC的發(fā)病率和患病率已經(jīng)呈現(xiàn)出了逐年上升的趨勢(shì)[6]。在近10年里，越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者對(duì)維生素D與免疫學(xué)的關(guān)系表現(xiàn)出了極大的科學(xué)興趣和研究熱潮， 維生素D參與治療機(jī)體免疫系統(tǒng)相關(guān)疾?。ㄈ缪装Y性腸?。┑恼n題也逐漸被人們所關(guān)注并加以深入研究[7]。維生素D除了傳統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)體鈣、磷代謝的作用外，其在炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所起到的抗感染以及免疫調(diào)節(jié)的作用也具有十分重要的地位[8-9]。因此，本研究擬從維生素D參與免疫調(diào)節(jié)作用角度探討隔藥灸治療UC的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

40只健康成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量（170±10）g，SPF級(jí)，由上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001]，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。飼養(yǎng)環(huán)境為12 h晝夜節(jié)律交替、室內(nèi)溫度控制在（20±2）℃，室內(nèi)濕度控制在50% ～70%。所有實(shí)驗(yàn)流程均經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 藥物

柳氮磺砒啶腸溶片（SASP，上海信誼天平藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H31020557）。

1.1.3 試劑與儀器

葡聚糖硫酸鈉（DSS）（分子量：36 000～50 000，MP Biomedicals公司，美國(guó)，貨號(hào)：9011-18-1），液體石蠟（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào)：30139828），戊巴比妥鈉（Sigma公司，美國(guó)，貨號(hào)：P3761），蘇木素-伊紅（南京建成科技有限公司， 貨號(hào)：D006），中性樹(shù)膠（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào)：10004160），大鼠VDR ELISA試劑盒（上海源葉生物科技有限公司，貨號(hào)：S0000-96T），大鼠25（OH）D3 ELISA試劑盒（上海源葉生物科技有限公司，貨號(hào)：S0000-96T），IFN-γ抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：bs-0480R），TNF-α抗體（武漢博士德生物工程有限公司，貨號(hào)：BA14901），二抗[基因科技（上海）有限公司，貨號(hào)：GP016029]，Trizol（Invitrogen公司，美國(guó)，貨號(hào)：15596026），RNase-free Water（QIAGEN公司，德國(guó)，貨號(hào)：129112），隨機(jī)引物（Invitrogen公司，美國(guó)，貨號(hào)：48190011），RNA酶抑制劑（Invitrogen公司，美國(guó)，貨號(hào)：AM2684），RT-PCR試劑盒（AMV）（Invitrogen公司，美國(guó)，貨號(hào)：12594100），2×Sybrgreen PCR mix（QIAGEN公司，德國(guó)，貨號(hào)：330520），TBE緩沖液（上海威奧生物科技有限公司，貨號(hào)：WH1183），6×上樣緩沖液（上海威奧生物科技有限公司，貨號(hào)：RT201），多功能酶標(biāo)儀（BioTek公司，美國(guó)，型號(hào)：Synergy H4 Hybrid），高速冷凍離心機(jī)（Thermo Fisher公司，美國(guó)，型號(hào)：ST16R），通用臺(tái)式離心機(jī)（Thermo Fisher公司，美國(guó)，型號(hào)：ST16），凝膠圖像分析系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國(guó)，型號(hào)：ChemiDocTM XRS+），酶標(biāo)儀數(shù)據(jù)獲取及分析軟件（BioTek公司，美國(guó)），Real-time檢測(cè)儀（Applied Biosystems，美國(guó)，型號(hào)：ABI-7300）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

將40只SD大鼠完全隨機(jī)分為2部分：正常大鼠（ n =10）和UC模型大鼠（ n =30）。根據(jù)國(guó)際公認(rèn)的方法[10-11]來(lái)制備UC大鼠模型，具體方法為：將DSS（MPBIO，美國(guó)）溶于大鼠每日的飲用水中，配置成4% DSS（wt/vol）溶液，自由飲用7 d。造模過(guò)程中模型組大鼠先后有2只死亡，造模結(jié)束后隨機(jī)抽取2只模型組和2只正常組，觀察大鼠體質(zhì)量及大便性狀，觀察大鼠DAI及大體形態(tài)損傷評(píng)分，并做HE染色觀察結(jié)腸組織病理學(xué)變化，以確認(rèn)模型是否制備成功，待UC大鼠模型制備成功后，依據(jù)大鼠DAI評(píng)分及體質(zhì)量、便血情況，對(duì)模型組大鼠進(jìn)行篩選處理（棄掉2只），確保24只UC模型大鼠后再繼續(xù)下一步實(shí)驗(yàn)。

在成功制備實(shí)驗(yàn)性UC大鼠模型的基礎(chǔ)上，采用隨機(jī)設(shè)計(jì)方法，將模型大鼠隨機(jī)分成模型組、隔藥灸組和SASP組，同時(shí)設(shè)立正常組，每組8只。1）正常組：與隔藥灸組同樣抓取固定，不做其他處理。2）模型組：繼續(xù)以1%DSS溶液維持大鼠UC的狀態(tài)。與隔藥灸組同樣抓取固定，不做其他處理。3）艾灸組：采用隔藥灸，取天樞穴（雙）和氣海穴，具體定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[12]及相關(guān)文獻(xiàn)[13-14]。神闕穴定位在腹正中線上，劍突與恥骨聯(lián)合上緣連線的上2/3與下1/3交點(diǎn)處。天樞穴定位在臍中旁開(kāi)約0.5 cm。氣海穴定位在臍下約1.0 cm。4）SASP組：參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[15]，每日稱量大鼠體質(zhì)量，并根據(jù)體質(zhì)量按27 mg/100 g計(jì)算SASP劑量，通過(guò)大鼠灌胃的方式補(bǔ)充SASP，1次/d，共治療7 d。

1.2.2 干預(yù)方法

選擇天樞穴（雙）和氣海穴實(shí)施隔藥灸，詳細(xì)治療方案參考有關(guān)文獻(xiàn)[23-25]制定。藥餅是將含有附子、肉桂、丹參、紅花、木香、黃連等中藥成分的藥粉配以適量的黃酒，調(diào)和均勻，用相同規(guī)格的模具做成直徑1.0 cm，厚0.5 cm大小的藥餅備用。艾炷以精制艾絨（南陽(yáng)漢醫(yī)艾絨有限責(zé)任公司）制成，直徑0.6 cm、高0.6 cm，重約90 mg，呈圓錐狀。施灸時(shí)，先將藥餅置于大鼠穴位上，再將艾炷放置于藥餅上，點(diǎn)燃施灸。灸治1次/d，每次每穴各灸2壯，共治療7 d。

干預(yù)結(jié)束后，以2%戊巴比妥鈉腹腔注射（0.2 mL/100 g）麻醉大鼠，待大鼠麻醉完全后，迅速剖開(kāi)大鼠腹腔并充分暴露腹主動(dòng)脈，用10 mL注射器取血，取血量在5～8 mL，緩慢移至10 mL離心管中，室溫靜置2 h后移至4 ℃離心機(jī)中，按3 000 r/min離心20 min，取上清液并分裝至EP管中，統(tǒng)一轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存;大鼠取完血之后，馬上截取大鼠回盲部至肛門上3 cm處的全結(jié)腸，并沿腸系膜縱行剖開(kāi)，用冰生理鹽水清洗，觀察結(jié)腸大體形態(tài)，并拍照記錄;在結(jié)腸大體形態(tài)評(píng)分完成后，將取下的結(jié)腸平均切成長(zhǎng)1 cm的結(jié)腸段，除距肛門4～5 cm結(jié)腸段放于4%多聚甲醛溶液中固定外，其余結(jié)腸段均分別放于凍存管中，編號(hào)保存至-80 ℃冰箱中備用。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）

每天觀察大鼠的精神狀態(tài)、體質(zhì)量、活動(dòng)情況、毛發(fā)光澤度、食欲、大便性狀等，并依據(jù)Lagishetty V等[16]制定的DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，每日測(cè)量大鼠的體質(zhì)量，大便性狀和潛血情況（肉眼血便），并記錄。見(jiàn)表1。

1.2.3.2 組織學(xué)觀察和病理學(xué)評(píng)分

1）結(jié)腸大體形態(tài)損傷評(píng)分：大鼠處死后，截取大鼠回盲部至肛門上3 cm處的全結(jié)腸，并沿腸系膜縱行剖開(kāi)，用冰生理鹽水清洗，依據(jù)Wallace JL等[17]制定的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)結(jié)腸進(jìn)行大體形態(tài)損傷評(píng)分。見(jiàn)表2。

2）結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分（HPS）：大鼠結(jié)腸組織經(jīng)4%多聚甲醛固定液固定24 h后，脫水，進(jìn)行石蠟包埋及石蠟切片，切片厚4 μm，進(jìn)行HE染色，觀察結(jié)腸組織的病理學(xué)改變，并按照Cooper HS等[18]制定的組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分記錄。見(jiàn)表3。

1.2.3.3 蘇木精-伊紅染色法（Hematoxylin-eosin Staining，HE）

結(jié)腸組織切片常規(guī)脫蠟至水;蘇木素（南京建成生物有限公司）染色90 s;流水沖10 min;鹽酸乙醇分化2 s;流水沖洗5 min;伊紅（南京建成生物有限公司）染色5 min;梯度乙醇脫水;二甲苯透明;中性樹(shù)膠封片;Olympus-BX53顯微鏡下觀察，采集圖片。

1.2.3.4 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）

分別將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品 依次加入微孔酶標(biāo)板（96孔）中（50 μL）;除空白孔外，酶標(biāo)板樣本孔中依次加入待測(cè)樣本各10 μL，再加入樣本稀釋液各40 μL;然后，依次加入HRP標(biāo)記的一抗25（OH）D3和VDR（上海源葉生物科技有限公司），空白孔不加;將酶標(biāo)板置于37 ℃恒溫箱中溫育60 min后，將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上適當(dāng)拍打，直至拍干;每孔中加入稀釋好的洗滌液，靜置1 min后棄去洗滌液，拍干，如此重復(fù)5次;每個(gè)孔中依次加入試劑盒底物A、B，將酶標(biāo)板置于37 ℃恒溫箱中避光孵育15 min;最后加入終止液50 μL，置于酶標(biāo)儀中檢測(cè)每孔的OD值（波長(zhǎng)450 nm），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本濃度。

1.2.3.5 RT-PCR

結(jié)腸組織總RNA抽提，組織勻漿，采用Trizol法提取總RNA，檢測(cè)濃度、純度、完整性，取相等量的總RNA，采用SYBRGreen PCR試劑盒（QIAGEN，德國(guó)，貨號(hào)：208052）、cDNA synthesis試劑盒（Invitrogen，美國(guó)）逆轉(zhuǎn)錄cDNA，所用引物序列如下：GAPDH-F，GGCAAGTTCAACGGCACAGT;GAPDH-R，ATGACATACTCAGCACCGGC;VDR-F，AAGCTGGTGGAAGCCATTCA;VDR-R，TCGGCCAGTTTCTGGATCAT;RXRα-F，TCGCTGTTGAGCCCAAGACT;RXRα-R，GGCCCACTCCACAAGAGTGA。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 2 min，94 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.3.6 免疫組織化學(xué)法（Immunohistochemistry，IHC）

采用免疫組織化學(xué)（IHC）方法檢測(cè)大鼠結(jié)腸IFN-γ、TNF-α炎性細(xì)胞因子的表達(dá)情況。組織切片用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次5 min，室溫下暴露于3%H2O2中15 min，以抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。用0.01 m PBS洗滌3次5 min后，標(biāo)本滴加已稀釋的一抗IFN-γ（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）和TNF-α（武漢博士德生物工程有限公司），4 ℃孵育過(guò)夜。將標(biāo)本加熱30 min，用0.01 mol/L PBS洗滌3次5 min，在室溫下與二抗（基因科技（上海）有限公司）孵育30 min，用0.01 M PBS洗滌3次5 min后，加入3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液。然后，用中性膠密封切片，在光鏡下進(jìn)一步觀察，使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。若實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，則用來(lái)表示;若實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，則用M（QU-QL）表示。數(shù)據(jù)同時(shí)滿足正態(tài)性及方差齊性條件時(shí)，統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析（One-way ANOVA），并進(jìn)一步作多個(gè)樣本均數(shù)間的兩兩比較（LSD檢驗(yàn)）。數(shù)據(jù)不同時(shí)滿足正態(tài)性及方差齊性時(shí)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)中的Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，多個(gè)樣本間的兩兩比較采用Nemenyi法。（Deluca and Cantorna 2001）對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，若2個(gè)變量均為連續(xù)性變量，則用Pearson相關(guān)分析;若2個(gè)變量均為分類變量，或其中一個(gè)為分類變量，或?qū)υ紨?shù)據(jù)總體分布不明，則用Spearman相關(guān)分析。以r表示相關(guān)系數(shù)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，以 P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.8 相關(guān)性分析

經(jīng)Spearman相關(guān)分析，結(jié)果表明大鼠血清25（OH）D3濃度與治療后大鼠DAI評(píng)分之間呈負(fù)相關(guān)（r=-0.479， P =0.006）。經(jīng)Pearson相關(guān)分析，結(jié)果表明大鼠結(jié)腸25（OH）D3濃度與結(jié)腸組織IFN-γ、TNF-α表達(dá)之間均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.442， P =0.011、r=-0.362， P =0.042）。見(jiàn)圖12。

3 討論

UC是消化內(nèi)科的常見(jiàn)疾病，屬西醫(yī)病名，古代中醫(yī)典籍中并沒(méi)有明確的病名記載，亦無(wú)結(jié)腸炎稱謂。由中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)脾胃病分會(huì)于2010年審定的“潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療共識(shí)意見(jiàn)” 中指出，可將其歸屬于“休息痢”“久痢”“腸澼”等 病范疇[19]。艾灸療法是中醫(yī)特色針灸療法中的重要組成部分，灸法在臨床上的應(yīng)用甚為廣泛，而且療效顯著[20-22]。通過(guò)分析針灸干預(yù)UC的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[23-24]，指出針灸治療UC療效優(yōu)于西藥，且具有不良反應(yīng)少、安全性高等優(yōu)勢(shì)。Kim SY等[25]專門針對(duì)1998—2008年P(guān)ubMed上有關(guān)灸法的隨機(jī)對(duì)照研究進(jìn)行了系統(tǒng)的評(píng)價(jià)，明確指出艾灸治療UC的療效明顯優(yōu)于藥物治療。Wu HG等[26]將46例UC患者納入研究，并隨機(jī)分為隔藥灸組和SASP組，結(jié)果顯示，2組治愈率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.01）。宋宸宇等[27]研究中共納入脾腎陽(yáng)虛型UC患者60例，分別經(jīng)艾灸治療和口服SASP治療，結(jié)果顯示，2組間療效比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05），這些研究提示艾灸治療脾腎陽(yáng)虛型UC療效顯著。我們的研究結(jié)果提示，隔藥灸顯著降低了UC大鼠的疾病活動(dòng)指數(shù)，緩解了結(jié)腸黏膜炎性反應(yīng)，其治療效應(yīng)與SASP相當(dāng)，這與以往研究結(jié)果一致。

在艾灸治療UC相關(guān)的免疫學(xué)機(jī)制研究方面，Zhou EH等[28]研究中共納入U(xiǎn)C患者109例作為研究對(duì)象，隨機(jī)分為隔藥灸組和隔麩灸組，指出隔藥灸對(duì)IL-8、ICAM-1及其mRNA表達(dá)的抑制作用可能是艾灸改善UC腸道炎性反應(yīng)的重要途徑之一。劉慧榮等[29]觀察隔藥灸對(duì)UC患者結(jié)腸黏膜TNF-α及COX-2表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隔藥灸可通過(guò)抑制結(jié)腸黏膜中TNF-α表達(dá)，減少COX-2產(chǎn)生，進(jìn)而改善UC患者腸道炎性反應(yīng)。此外，Wu HG等[30-34]多項(xiàng)研究表明，隔藥灸治療UC可能是通過(guò)抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡， 改善結(jié)腸黏膜中促炎細(xì)胞因子與抗炎細(xì)胞因子之間的平衡狀態(tài)，調(diào)節(jié)結(jié)腸Bcl-2、Bax及Fas、FasL蛋白表達(dá)，從而修復(fù)結(jié)腸黏膜損傷，減輕或消除UC腸道炎性反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，隔藥灸顯著抑制了結(jié)腸IFN-γ、TNF-α炎性細(xì)胞因子釋放，緩解UC大鼠腸道炎性反應(yīng)。

維生素D可以通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)的發(fā)育和功能，直接或間接抑制IBD致病T細(xì)胞的功能，從而減弱或抑制IBD的進(jìn)一步發(fā)展[35]。維生素D3通過(guò)與血漿中的維生素D結(jié)合蛋白（Vitamin D Binding Protein，DBP）結(jié)合，經(jīng)肝臟轉(zhuǎn)化為25（OH）D3，后經(jīng)腎臟最終轉(zhuǎn)化為1，25-（OH）2D3[36-37]。25（OH）D3是維生素D在人體內(nèi)的主要循環(huán)形式，1，25-（OH）2D3則是維生素D在人體內(nèi)的主要效應(yīng)形式。而1，25-（OH）2D3需依賴于維生素D受體（Vitamin D Receptor，VDR）來(lái)發(fā)揮它的生物學(xué)效應(yīng)[38]。1，25-（OH）2D3可以直接作用于Th1和Th17細(xì)胞等，下調(diào)IL-17和IFN-γ等促炎性細(xì)胞因子，同時(shí)上調(diào)Th2細(xì)胞因子IL-4等[39-40]，從而抑制體內(nèi)的炎性反應(yīng)。在眾多與UC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的因素中，感染和免疫異常是目前比較公認(rèn)的可影響UC發(fā)病的關(guān)鍵因素[41]。維生素D除了可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂的功能之外，還具有一定的抗感染作用，在發(fā)揮抗感染和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫紊亂的相互作用下，維生素D可具體參與調(diào)節(jié)UC腸道炎性反應(yīng)及相關(guān)Th亞群細(xì)胞炎性因子水平，抑制疾病狀態(tài)，同時(shí)促進(jìn)腸道黏膜修復(fù)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)，從而進(jìn)一步達(dá)到緩解或治療目的。體外實(shí)驗(yàn)表明，CD4+T細(xì)胞在缺乏維生素D時(shí)，可誘發(fā)IL-17細(xì)胞的大量分泌，而1，25-（OH）2D3則可以抑制Th17細(xì)胞的功能，具體表現(xiàn)在可下調(diào)IL-17mRNA表達(dá)，IL-17細(xì)胞分泌受到抑制，炎性反應(yīng)即可得到一定的改善[42-43]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠血清及結(jié)腸組織中25（OH）D3、VDR濃度明顯低于正常組，而模型組大鼠結(jié)腸IFN-γ、TNF-α表達(dá)明顯高于正常組;隔藥灸組大鼠血清及結(jié)腸組織中25（OH）D3、VDR濃度明顯高于模型組，而隔藥灸組大鼠結(jié)腸IFN-γ、TNF-α表達(dá)明顯低于模型組。表明隔藥灸可顯著調(diào)節(jié)UC大鼠血清及結(jié)腸25（OH）D3、VDR濃度，能明顯抑制UC大鼠結(jié)腸IFN-γ、TNF-α表達(dá)，提示維生素D可能參與隔藥灸對(duì)UC大鼠結(jié)腸IFN-γ、TNF-α促炎性細(xì)胞因子的抑制作用，維生素D的免疫調(diào)節(jié)作用可能是隔藥灸對(duì)UC起效機(jī)制的重要環(huán)節(jié)。

機(jī)體維生素D與某些免疫系統(tǒng)紊亂性疾病之間存在較高的易感性，而維生素D缺乏在處于活動(dòng)期和緩解期的IBD患者中均普遍存在，而且維生素D缺乏與疾病的活動(dòng)程度具有一定的相關(guān)性[44]。本實(shí)驗(yàn)中，相關(guān)性分析結(jié)果表明大鼠血清25（OH）D3濃度與治療后大鼠DAI評(píng)分之間呈負(fù)相關(guān)，這說(shuō)明隨著大鼠DAI評(píng)分的升高，大鼠血清25（OH）D3濃度則會(huì)保持下降的趨勢(shì)，這與UC患者中普遍存在維生素D缺乏的結(jié)論相一致;大鼠結(jié)腸25（OH）D3濃度與結(jié)腸組織IFN-γ、TNF-α表達(dá)之間均呈負(fù)相關(guān)，IFN-γ、TNF-α均為促炎性細(xì)胞因子，可介導(dǎo)機(jī)體多種免疫反應(yīng)，參與破壞腸道黏膜屏障，加重UC的腸道的炎性反應(yīng)以及疾病活動(dòng)程度，而IFN-γ、TNF-α與25（OH）D3的負(fù)相關(guān)關(guān)系則說(shuō)明維生素D可通過(guò)抑制炎性細(xì)胞的增值分泌參與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，改善UC的疾病狀態(tài);大鼠結(jié)腸VDR mRNA水平與結(jié)腸組織IFN-γ、TNF-α表達(dá)之間也呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明維生素D與VDR均參與了上述調(diào)節(jié)IFN-γ、TNF-α炎性細(xì)胞因子的過(guò)程。

本研究主要通過(guò)研究維生素D在隔藥灸治療UC大鼠過(guò)程中對(duì)結(jié)腸IFN-γ及TNF-α炎性細(xì)胞因子表達(dá)所發(fā)揮的相關(guān)免疫調(diào)節(jié)作用，初步探討了維生素D與免疫之間的關(guān)系，證實(shí)UC大鼠中存在維生素D缺乏。因受時(shí)間、技術(shù)等因素所限，相關(guān)免疫學(xué)指標(biāo)不夠全面，維生素D相關(guān)的免疫學(xué)作用機(jī)制未能完全闡明，有關(guān)維生素D在隔藥灸治療UC過(guò)程中具體作用途徑的研究也未能深入展開(kāi)，后續(xù)可結(jié)合多種現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，交叉并借鑒多學(xué)科理論，從不同角度對(duì)維生素D的免疫調(diào)節(jié)作用加以探討，維生素D的補(bǔ)充標(biāo)準(zhǔn)及其安全性也需開(kāi)展相關(guān)研究加以規(guī)范和完善。繼續(xù)深入研究維生素D與UC之間的關(guān)系，將有助于進(jìn)一步揭示UC的發(fā)病機(jī)制，同時(shí)也將為進(jìn)一步闡釋灸法作用的起效機(jī)制提供一定的理論與實(shí)踐依據(jù)，以期提高艾灸臨床療效。

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（2020-04-30收稿 責(zé)任編輯：徐穎）

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81674074，81973955）;上海市青年科技英才揚(yáng)帆計(jì)劃項(xiàng)目（17YF1417600）;上海市青年科技啟明星計(jì)劃項(xiàng)目（16QA1403400）;上海市衛(wèi)生計(jì)生委優(yōu)秀人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YQ11）

作者簡(jiǎn)介：王寬（1989.07—），男，碩士，醫(yī)師，研究方向：針灸治療胃腸道疾病，E-mail：wangkuan271@163.com

通信作者：趙繼夢(mèng)（1986.04—），女，博士，助理研究員，研究方向：針灸治療炎癥性腸病的臨床與基礎(chǔ)研究，E-mail：zhaojm0414@163.com;吳璐一（1984.07—），女，博士，副研究員，研究方向：針灸治療胃腸疾病的臨床與基礎(chǔ)研究，E-mail：luyitcm@163.com