許丹妮，許良玲，陸翠，廖承譜

（1.廣西民族師范學院化學與化工學院，廣西崇左532200；2.廣西高校桂西南特色植物資源化學重點實驗室培育基地，廣西崇左 532200；3.崇左市食品藥品檢驗所，廣西崇左532200）

枸杞是茄科、枸杞屬植物，是我國一種珍貴的藥食同源植物[1-2]。枸杞富含人體所需的18種氨基酸和32種微量元素，且其中獨特的枸杞多糖、甜菜堿等生物活性物質(zhì)具有抗氧化、降血糖、促進造血功能、抗脂肪肝、抗腫瘤、延緩衰老等作用[3-5]。枸杞含有豐富的色素類物質(zhì)，其主要成分為脂溶性類胡蘿卜素類化合物，如游離類胡蘿卜素、類胡蘿卜素脂肪酸酯[6-8]。以枸杞為原料的食品，營養(yǎng)價值高，具有廣闊的應(yīng)用前景。

面醬又稱甜醬或甜面醬，是一種別具風味的傳統(tǒng)特色發(fā)酵制品，可直接食用，也可作為調(diào)味品使用，深受人們喜愛[9]。目前，傳統(tǒng)面醬產(chǎn)品種類單一，特色產(chǎn)品的開發(fā)較少[10-12]。在面醬發(fā)酵過程中，諸多因素會對面醬中氨基酸態(tài)氮含量造成影響，比如原料的配比、發(fā)酵劑接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間等均會影響面醬中氨基酸態(tài)氮含量，從而影響產(chǎn)品的品質(zhì)[13]。

本研究以枸杞與面粉為原料共同發(fā)酵，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以面醬中氨基酸態(tài)氮的含量為響應(yīng)值進行響應(yīng)面試驗，得到枸杞面醬制備的最優(yōu)工藝，為制備特色面醬提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞：福建省安溪縣昱霖茶葉有限公司，試驗前干燥、粉碎，過80目篩備用；面粉：五得利面粉集團有限公司；米曲霉（滬釀3.042）：濟寧玉園生物科技有限公司。

甲醛、氫氧化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BKQ-B100II型高壓蒸汽滅菌鍋：濟南博鑫生物技術(shù)有限公司；FW200型多功能粉碎機：常州金壇友聯(lián)儀器研究所；FD-1B-50型真空冷凍干燥機：北京博醫(yī)康儀器有限公司；MJX-280HM型霉菌培養(yǎng)箱：寧波萊?？萍加邢薰?；YP20002電子天平：上海光正醫(yī)療儀器有限公司；PHS-2F型pH計：上海精科電子有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點

面醬的制備參考文獻[14-17]并作修改。

1）面料拌和：將500 g面粉和160 g水充分拌和，試驗組用枸杞替代部分面粉，使其成為蠶豆大小的面團。

2）蒸料：將和好的面料置于高壓滅菌鍋121℃蒸煮10 min，蒸好后攤開冷卻至35℃。

3）接種：將米曲霉菌粉接種在面料表面，混合均勻。

4）制曲：控制曲料溫度在32℃～35℃，相對濕度＞80%，制曲 10 h～13 h第一次翻曲；制曲 18 h～20 h后進行第二次翻曲，使曲料溫度維持在30℃～32℃，保持該溫度至制曲結(jié)束。

5）發(fā)酵：向制曲完成的曲料中，按曲料與食鹽水1∶1的質(zhì)量比加入溶度為14°Bé的食鹽水，于50℃條件下發(fā)酵20 d。

6）磨醬：將發(fā)酵好的枸杞面醬，用膠體磨磨細，過磨5次。

7）滅菌：將磨細的枸杞面醬在80℃下殺菌10 min，冷卻后即為成品。

1.3.3 理化指標檢測

采用國標GB 5009.235-2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態(tài)氮的測定》中的甲醛值法測定氨基酸態(tài)氮含量[18]。

1.3.4 單因素試驗

1）分別以枸杞添加量為0%、3%、6%、9%、12%，發(fā)酵劑接種量為0.3%，發(fā)酵溫度為50℃，發(fā)酵20 d，考察枸杞添加量對產(chǎn)品氨基酸態(tài)氮含量的影響。

2）分別以發(fā)酵劑接種量為0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%，枸杞添加量為9%，發(fā)酵溫度為50℃，發(fā)酵20 d，考察發(fā)酵劑接種量對產(chǎn)品氨基酸態(tài)氮含量的影響。

3）分別以發(fā)酵溫度為 35、40、45、50、55 ℃，枸杞添加量為9%，發(fā)酵劑接種量為0.3%，發(fā)酵20 d，考察發(fā)酵溫度對產(chǎn)品氨基酸態(tài)氮含量的影響。

4）分別以發(fā)酵時間為 5、10、15、20、25 d，枸杞添加量為9%，發(fā)酵劑接種量為0.3%，發(fā)酵溫度50℃，考察發(fā)酵時間對產(chǎn)品氨基酸態(tài)氮含量的影響。

1.3.5 工藝優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理[19]，選取枸杞添加量（A）、發(fā)酵劑接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）和發(fā)酵時間（D）4個因素為自變量，以枸杞面醬的氨基酸態(tài)氮含量（Y）為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法對枸杞面醬的制備工藝進行優(yōu)化，并對響應(yīng)面法得到的最佳工藝進行驗證。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert 8.0.5b軟件對響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 枸杞添加量的影響

枸杞中除了含有多糖、脂肪及微量元素外，還含有豐富的蛋白質(zhì)和氨基酸。面醬制曲中加入枸杞不僅可以改善面醬的品質(zhì)，還可以增加面醬的種類及營養(yǎng)價值。枸杞添加量對枸杞面醬中氨基酸態(tài)氮含量的影響見圖1。

圖1 枸杞添加量對枸杞面醬中氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.1 Effects of additive amount of wolfberry on the content of amino nitrogen in wolfberry flour paste

如圖1所示，在枸杞添加量為9%時，面醬中氨基酸態(tài)氮的含量最高，可達0.76 g/100 g，與不添加枸杞組相比增加了1.3倍。但當枸杞添加量12%時，面醬中氨基酸態(tài)氮的含量只比不添加枸杞組提高了39%。由此可知，枸杞添加量過大會抑制微生物的生長代謝，影響蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等各種酶的分泌，造成面醬的氨基酸態(tài)氮含量降低。故選定枸杞添加量為6%、9%和12%進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

2.1.2 發(fā)酵劑接種量的影響

發(fā)酵劑接種量對微生物產(chǎn)酶的影響較大，從而影響成品中氨基酸態(tài)氮的含量，其對枸杞面醬中氨基酸態(tài)氮含量的影響見圖2。

圖2 發(fā)酵劑接種量對枸杞面醬中氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.2 Effects of inoculated amount of starter on the content of amino nitrogen in wolfberry flour paste

根據(jù)圖2可知，在其他條件相同的情況下，隨著發(fā)酵劑接種量的不斷增大，面醬中氨基酸態(tài)氮含量逐漸增加，當發(fā)酵劑接種量為0.3%時，枸杞面醬中氨基酸態(tài)氮含量達到最高為0.76 g/100 g，而當發(fā)酵劑接種量＞0.3%時，原料的碳氮比限制了米曲霉的生長代謝，其產(chǎn)酶活性受到抑制，從而影響成品中氨基酸態(tài)氮含量。故選取發(fā)酵劑接種量為0.2%、0.3%和0.4%進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

2.1.3 發(fā)酵溫度的影響

溫度對面醬的發(fā)酵過程中各種酶的活性和次級代謝產(chǎn)物的形成都具有顯著的影響，其對枸杞面醬中氨基酸態(tài)氮含量的影響見圖3。

圖3 發(fā)酵溫度對枸杞面醬中氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.3 Effects of fermentation temperature on the content of amino nitrogen in wolfberry flour paste

由圖3可知，枸杞面醬的氨基酸態(tài)氮含量在發(fā)酵溫度35℃～55℃區(qū)間呈先增后降的趨勢。當發(fā)酵溫度為50℃時，氨基酸態(tài)氮含量達到最大。高溫會影響代謝途徑中各種酶的活力及速率，同時發(fā)酵溫度過高會產(chǎn)生不良滋味，影響面醬的口感及品質(zhì)。故選定發(fā)酵溫度為45、50、55℃進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

2.1.4 發(fā)酵時間的影響

發(fā)酵時間有助于次級代謝產(chǎn)物的積累，其對枸杞面醬中氨基酸態(tài)氮含量的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵時間對枸杞面醬中氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.4 Effects of fermentation time on the content of amino nitrogen in wolfberry flour paste

如圖4所示，枸杞面醬中氨基酸態(tài)氮含量與發(fā)酵時間呈正相關(guān)，在發(fā)酵前20 d，氨基酸態(tài)氮含量增加較快，之后發(fā)酵速度趨于平緩。故選取發(fā)酵時間為15、20、25 d進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，以枸杞面醬氨基酸態(tài)氮含量為響應(yīng)值，設(shè)計四因素三水平響應(yīng)面分析試驗，其因素與水平見表1，結(jié)果見表 2。

表1 響應(yīng)面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels response surface experiments

表2 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface analysis

通過Design Expert 8.0.5 b軟件中的Box-Benhnken Design模型對表2中數(shù)據(jù)進行二次響應(yīng)面回歸擬合，得到枸杞面醬中氨基酸態(tài)氮含量與4個因素之間的回歸方程：Y=-0.12-0.064A+0.025B+0.047C+8.7×10-3D-0.017AB+7.01×10-3AC-3.09×10-3AD-0.012BC+4.16×10-3BD+8.67×10-4CD-0.15A2-0.1B2-0.064C2-0.019D2。

對模型進行方差分析及回歸系數(shù)顯著性檢驗，結(jié)果見表3。

表3 回歸分析結(jié)果Table 3 Results of regression analysis

由表3可知，模型的P值為P＜0.000 1，表明回歸模型方差顯著，擬合度較好；失擬項的P值為0.082 4＞0.05，不顯著，說明該模型與實際試驗擬合較好，能較好地預(yù)測結(jié)果[20-21]。故響應(yīng)面方法對枸杞面醬的制備工藝的優(yōu)化合理可行。

一次項 A、B、C 以及二次項 A2、B2、C2、D2均表現(xiàn)為顯著，由此可知這些一次和二次項對枸杞面醬發(fā)酵的影響較為明顯；在模型一次項中，D的顯著性較差，說明發(fā)酵時間對枸杞面醬的發(fā)酵影響較??；而在模型交互項中，AB、AC、AD、BC、BD、CD 交互項的顯著性均較差，說明發(fā)酵與單因素并不是簡單的線性關(guān)系。方差分析可知，試驗所選因素對響應(yīng)值影響的強弱次序依次為：枸杞添加量＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵劑接種量＞發(fā)酵時間。

2.2.2 響應(yīng)面結(jié)果優(yōu)化與分析

根據(jù)Design Expert 8.0.5 b軟件，做出各因素對枸杞面醬中氨基酸態(tài)氮含量的響應(yīng)面分析圖及等高線圖，其結(jié)果見圖5?？疾焖鶖M合的響應(yīng)面形狀，分析各因素及其交互值對響應(yīng)值的影響、變化趨勢以及各因素在所選范圍內(nèi)存在的極值。

圖5 各變量互相作用對枸杞面醬中氨基酸態(tài)氮含量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface and contour plots showing the interactive effects on the content of amino nitrogen in wolfberry flour paste

圖5中響應(yīng)面上標記的最高點即為最大值，說明在所選分析的因素水平范圍內(nèi)存在極值。等高線的形狀可反映交互效應(yīng)的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則相反[22]。枸杞添加量與發(fā)酵時間比發(fā)酵劑接種量和發(fā)酵時間的交互作用顯著，而發(fā)酵劑接種量和發(fā)酵時間比枸杞添加量與發(fā)酵溫度的交互作用顯著，說明枸杞添加量、發(fā)酵時間和發(fā)酵劑接種量這3個因素對枸杞面醬中氨基酸態(tài)氮的含量影響較大。

2.2.3 驗證試驗

依據(jù)Design Expert 8.0.5b軟件對響應(yīng)面試驗進行優(yōu)化分析，得到最佳工藝條件：枸杞添加量為8.35%，發(fā)酵劑接種量為0.31%，發(fā)酵溫度為51.71℃，發(fā)酵時間為21.15 d，氨基酸態(tài)氮的理論值為0.793 g/100 g。考慮實際操作條件，將上述最佳發(fā)酵條件修正為：枸杞添加量8.5%，發(fā)酵劑接種量0.3%，發(fā)酵溫度50℃，發(fā)酵時間21 d。該條件下平行3次測得枸杞面醬中氨基酸態(tài)氮含量為0.789 g/100 g，相對誤差為0.5%，說明此次響應(yīng)面分析法優(yōu)化后所得到的枸杞面醬的發(fā)酵條件較為準確可靠，具有一定的實際應(yīng)用價值，可為制備特色面醬提供新的參考。

3 結(jié)論

本文在單因素試驗基礎(chǔ)上，以枸杞面醬的氨基酸態(tài)氮含量為考查指標，通過響應(yīng)面法結(jié)合Box-Benhnken Design模型的分析，對枸杞面醬的制備工藝進行了優(yōu)化，進一步得到最優(yōu)的工藝條件：枸杞添加量8.5%，發(fā)酵劑接種量0.3%，發(fā)酵溫度50℃，發(fā)酵時間21 d。該條件下測得枸杞面醬中氨基酸態(tài)氮含量為0.79 g/100 g，相對誤差為0.4%。利用枸杞制備的面醬，不僅具有枸杞清香，還可以增加面醬中氨基酸態(tài)氮的含量，改善面醬的風味和品質(zhì)，提高枸杞的附加值。