四種中藥對(duì)臨床常見酵母樣真菌的抑菌效果

宋伶俐 張琰 張春媚

(1北華大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林 吉林 132011；2吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院急診重癥監(jiān)護(hù)病區(qū))

真菌感染已然成為一個(gè)全球的新問題，而在絕大多數(shù)的侵襲性真菌感染(IFI)中以念珠菌病和念珠菌血癥為主，原因包括近年免疫抑制治療(如放療、化療)大量增加，侵入性治療和新免疫抑制修飾藥物的應(yīng)用等。另外，在過去10年，菌種從白色假絲酵母向非白色假絲酵母逐漸變遷，不斷出現(xiàn)對(duì)唑類藥物的耐藥〔1〕。最近1年，多重耐藥的耳念珠菌在幾大洲同時(shí)出現(xiàn)，導(dǎo)致醫(yī)院爆發(fā)流行，尤其是在危重患者之間〔2〕。

苦參：清熱燥濕，利尿殺蟲，煎劑對(duì)真菌、細(xì)菌均有抑制作用〔1，3〕。浮萍：發(fā)汗解未見表，透疹祛風(fēng)止癢，涼血解毒利水，其抗真菌活性未見報(bào)道。蒼耳子：有明顯的抑真菌活性，但殺菌活性不明顯〔4〕。土茯苓：解毒除濕、通利關(guān)節(jié)，有利濕之功效，性味甘平〔5～9〕。中醫(yī)理論認(rèn)為，人體感染真菌多與溫濕相蒸有關(guān)，故將中藥采用中醫(yī)傳統(tǒng)煎制方式，制成湯劑〔1，4〕。本文分別研究了單體及復(fù)方的體外抗真菌活性。浮萍的抗真菌活性尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

IFI治療失敗可能與抗真菌藥物在相應(yīng)組織內(nèi)未達(dá)到適宜濃度相關(guān)。另外，抗真菌藥肝腎毒副作用大，耐藥時(shí)有發(fā)生?，F(xiàn)多學(xué)科融合的治療措施，為解決耐藥問題帶來新希望，中醫(yī)中藥毒副作用小，本研究旨在降低真菌感染的發(fā)生率，抵抗耐藥株的出現(xiàn)，從而降低高死亡率〔2〕。

1 材料與方法

1.1一般材料 藥品：苦參、土茯苓、蒼耳子、浮萍，河南省安國市安興中藥飲片有限公司，批號(hào)：190602。菌種：白色假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌，均來自北華大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科的臨床分離株，共4株。

1.2方法 苦參20 g、土茯苓20 g、蒼耳子20 g、浮萍20 g，加入1 ml水中，煎成湯劑，過濾殘?jiān)?，最后制成藥液濃度均?00 mg/ml，4℃冰箱保存。將白色假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌接種至SDA平皿上，35℃培養(yǎng)24 h，挑取菌落配制0.5 Mcfarland菌懸液，取20 μl菌懸液至11 ml真菌藥敏接種肉湯中，得到接種液密度為1.5×103～8.0×103cfu/ml。

1.3體外抑菌活性實(shí)驗(yàn)方法 根據(jù)美國國家臨床試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)提出的酵母樣真菌的藥物敏感方案，用RPMI1640稀釋中藥湯劑，加入96孔板，采用微量稀釋法，第一孔加入200 μl藥液，接下10孔倍比稀釋，第11孔加入200 μl RPMI1640為陰性對(duì)照孔，第12孔加100 μl菌懸液+100 μl RPMI1640培養(yǎng)基為陽性生長孔。聯(lián)合藥敏板第2～9行，1～8列分別加入兩種藥液，向右向下稀釋。其余陰陽性對(duì)照孔同單藥藥敏板的配制。每孔加入100 μl菌液，測定苦參、土茯苓、蒼耳子、浮萍對(duì)4種酵母真菌的最低抑菌濃度(MIC)及兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用的聯(lián)合抑菌指數(shù)(FICI)。

2 結(jié) 果

苦參、土茯苓、蒼耳子、浮萍單劑對(duì)白色假絲酵母菌(MIC值分別為25、25、50、25 mg/ml)、光滑假絲酵母菌(MIC值分別為200.000、200.000、200.000、3.125 mg/ml)、克柔假絲酵母菌(均抑制生長)均有抑菌作用，無殺菌作用。根據(jù)FICI計(jì)算方法得出，4種中藥無論單劑還是合劑對(duì)熱帶假絲酵母菌都無效，對(duì)克柔假絲酵母菌效果最明顯。蒼耳子和浮萍聯(lián)合用藥時(shí)，對(duì)白色假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌顯示出相加作用；苦參和蒼耳子、土茯苓和蒼耳子聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)光滑假絲酵母菌表現(xiàn)出協(xié)同作用，土茯苓和浮萍，對(duì)光滑假絲酵母菌表現(xiàn)出相加作用；苦參和土茯苓試驗(yàn)濃度均未對(duì)白色假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌產(chǎn)生抑制作用，表現(xiàn)出明顯拮抗。見表1。

表1 4種中藥兩兩聯(lián)合用藥對(duì)酵母樣真菌的抑制作用

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)中浮萍表現(xiàn)出非常強(qiáng)的抗真菌活性，甚至優(yōu)于現(xiàn)國內(nèi)已經(jīng)公認(rèn)的苦參中藥，值得關(guān)注。目前國內(nèi)研究的主要抗真菌中藥包括：苦參、土槿皮、黃柏、百部、黃連、虎杖、黃芩、大黃、藿香和五倍子，另有許多中藥成分單體〔5〕。相關(guān)中藥醫(yī)典中藥理作用為浮萍生于水，其氣清輕，走肌膚，祛風(fēng)濕邪，又長盛于暑夏之時(shí)，對(duì)濕邪效果最好〔7～9〕。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，浮萍具體的抗真菌成分，藥物代謝作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究，填補(bǔ)空白。

中藥復(fù)方湯劑提取中，水煎煮法為最常用的方法。體外藥敏實(shí)驗(yàn)一般情況都是研究單劑藥物的療效，聯(lián)合用藥很少被研究，單一制劑的研究無法反映聯(lián)合用藥的差異〔6〕，中藥通常都是聯(lián)合應(yīng)用，中醫(yī)認(rèn)為人體是一個(gè)整體，陰陽調(diào)和不可分割，復(fù)方中藥的研究更符合中醫(yī)的治療理念，而體外藥物聯(lián)合應(yīng)用的研究為臨床中藥的復(fù)方制劑的藥物選擇提供理論基礎(chǔ)，MIC的研究可為中藥劑量的選擇提供理論依據(jù)。但目前國內(nèi)甚至國際上對(duì)于3種甚至3種以上藥物的聯(lián)合應(yīng)用效果如何評(píng)價(jià)，還沒有明確的方法，中藥的藥代動(dòng)力學(xué)研究還有待進(jìn)一步發(fā)展。4種中藥無論單劑還是合劑對(duì)熱帶假絲酵母菌都無效，對(duì)克柔假絲酵母菌效果全為敏感，原因有可能跟臨床選取的致病菌株單一有關(guān)，或者與選取的用藥劑量有關(guān)，后續(xù)可以考慮加大樣本量或改變藥物劑量做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

綜上，同樣的中藥對(duì)不同的菌種，藥物敏感性上存在差異，MIC也存在差異，這可以解釋臨床藥效為何存在差異，為后續(xù)進(jìn)一步研究藥物機(jī)制、藥代動(dòng)力學(xué)提供基礎(chǔ)，為開發(fā)新型抗真菌藥物及中西藥聯(lián)合的多學(xué)科融合治療提供依據(jù)。