應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)建立IGF-ⅡR基因定點(diǎn)整合的SKBR3細(xì)胞系

馬新宇，王瀟，曹中偉

a.甲乳疝外科；b.科研處；內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010

2018年全球新增1810萬癌癥病例，男性950萬，女性860萬。其中約210萬女性新診斷為乳腺癌，約占女性癌癥病例的1/4，遠(yuǎn)超其他癌癥所占比例[1]。乳腺癌患者中的15%～30%過表達(dá)人表皮生長因子受體2（human epidermal growth fac?tor receptor 2，HER-2）[2]。這類乳腺癌浸潤性強(qiáng)、分化差、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高，且對(duì)常規(guī)放化療方法不敏感，預(yù)后不良，導(dǎo)致患者總生存率降低，被認(rèn)為是最危險(xiǎn)的乳腺癌亞型[3]。曲妥珠單抗是目前用于治療HER-2陽性乳腺癌最有效的靶向藥物，能夠極大地提高患者的生存率。但在臨床上，大多數(shù)接受曲妥珠單抗的患者會(huì)在治療初期表現(xiàn)出原發(fā)性耐藥，或者即使最初對(duì)藥物有反應(yīng)，最終也會(huì)在治療一年內(nèi)產(chǎn)生獲得性耐藥[4]，嚴(yán)重影響了治療效果，致使疾病進(jìn)展。因此，急須探究曲妥珠單抗耐藥性的機(jī)制，為提高靶向藥物治療效果、改善乳腺癌患者的預(yù)后提供研究基礎(chǔ)，最終使乳腺癌患者獲得最大化的生存獲益。

目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)曲妥珠單抗的耐藥機(jī)制主要包括PIK3CA和PTEN突變或缺失、PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路失調(diào)、HER家族受體成員共表達(dá)，以及其他受體酪氨酸激酶的激活等[5-8]。胰島素樣生長因子受體2（insulin-like growth factor re?ceptor 2，IGF-ⅡR）是胰島素樣生長因子家族（in?sulin-like growth factor，IGF）成員，可與胰島素樣生長因子2（insulin-like growth factor 2，IGF-Ⅱ）結(jié)合。IGF-ⅡR缺少酪氨酸激酶活性，可以通過降解IGF-Ⅱ減少其與胰島素樣生長因子受體1（IGF-ⅠR）的結(jié)合而發(fā)揮抗增殖和促凋亡活性，作為一種抑癌基因存在[9]。另一方面，IGF-ⅡR可與含有6-磷酸甘露糖糖基的蛋白質(zhì)結(jié)合，參與溶酶體酶轉(zhuǎn)運(yùn)。過表達(dá)的IGF-ⅡR基因可增加MCF-7乳腺癌細(xì)胞中溶酶體酶組織蛋白酶D的分泌，增加乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，降低患者的無病生存期[10]。但I(xiàn)GF-ⅡR對(duì)HER-2陽性乳腺癌預(yù)后的影響至今尚不清楚。

我們應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)IGF-ⅡR基因在AAVS1安全位點(diǎn)定點(diǎn)敲入，擬構(gòu)建IGF-ⅡR過表達(dá)的HER-2陽性乳腺癌細(xì)胞系SKBR3，為檢測IGF-ⅡR過表達(dá)對(duì)SKBR3細(xì)胞生物學(xué)的影響提供細(xì)胞模型，并為進(jìn)一步探究HER-2陽性乳腺癌對(duì)曲妥珠單抗的耐藥性提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

SKBR3細(xì)胞系購自北納生物公司；大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司；hAAVS1-KI載體、UCA CRISPR/Cas9快速構(gòu)建及活性檢測試劑盒載體購自北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司；FlexiGene DNA提取試劑盒購自GIAGEN公司；GeneRuler 1kb plus DNA Ladder、T4DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶購自Thermo公司；細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑購自GIBCO公司。

1.2 Cas9/sgRNA質(zhì)粒構(gòu)建

利用NCBI的Primer-BLAST功能，在AAVS1位點(diǎn)上、下游各400 bp處設(shè)計(jì)上游引物（5'-GCA TCAAGCTTGGTACCGAT-3'）、下游引物（5'-ACTT AATCGTGGAGGATGAT-3'）。 用 FlexiGene DNA提取試劑盒提取HER-2陽性乳腺癌細(xì)胞SKBR3的基因組，以其為模板擴(kuò)增靶位點(diǎn)序列，測序確認(rèn)靶序列與GenBank中的AAVS1基因參考序列是否一致。從GeneBank獲得人AAVS1全長基因組序列（Gene ID：54776），用麻省理工學(xué)院的小向?qū)NA（sgRNA）設(shè)計(jì)網(wǎng)站（http://crispr.mit.edu/），在AAVS1靶位點(diǎn)的1號(hào)內(nèi)含子設(shè)計(jì)6對(duì)互補(bǔ)sgRNA序列，命名為sgRNA1～6（表1），其中斜體小寫字母為退火后產(chǎn)生的粘性末端。采用UCA CRISPR/Cas9快速構(gòu)建及活性檢測試劑盒，將sgRNA經(jīng)變性-退火后形成雙鏈，連入線性化pCS質(zhì)粒載體，測序驗(yàn)證正確后分別命名為pCS-sgRNA1～pCS-sgRNA6，檢測活性，選取活性最高的sgRNA用于后續(xù)基因編輯實(shí)驗(yàn)。

1.3 IGF-ⅡR打靶載體構(gòu)建

將IGF-ⅡR CDS片段分2段（A1，A2）合成，用Bstz17Ⅰ+KpnⅠ+ScaⅠ酶切A1，酶切半小時(shí)后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收約3104 bp的小條帶；用AsiSⅠ+KpnⅠ酶切A2，電泳回收約4386 bp的條帶；用AsiSⅠ+Bstz17Ⅰ酶切hAAVS1-KI載體，電泳回收約11232 bp的條帶，用T4DNA連接酶連接各回收片段（圖1A），連接完成后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)挑菌、培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，EcoRⅠ+ScaⅠ、NcoⅠ、BglⅡ酶切鑒定并測序。

表1 sgRNA設(shè)計(jì)

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮中取出SKBR3細(xì)胞，37℃水浴鍋內(nèi)迅速融化后移入15 mL離心管，1500 r/min離心3 min，棄上清液，沉淀中加入McCoy's 5A+10% FBS+1% L-G+1% NEAA+1% PS+1% HEPES完全培養(yǎng)基1 mL，吹打混勻，接種至含10 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗1次，加入0.25%胰酶消化，輕輕吹打，轉(zhuǎn)至15 mL離心管，1500 r/min離心5 min，棄上清，加入1 mL培養(yǎng)基，吹勻后接種至培養(yǎng)皿中，傳代培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及篩選

設(shè)置4組電轉(zhuǎn)參數(shù)（1050 V、30 ms、1個(gè)脈沖；1000 V、40 ms、1個(gè)脈沖；1100 V、30 ms、2個(gè)脈沖；1200 V、20 ms、2個(gè)脈沖），分別電轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白質(zhì)粒，流式細(xì)胞術(shù)分析不同條件下的轉(zhuǎn)染效率。分別用濃度為 0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/mL的嘌呤霉素處理細(xì)胞，以7 d殺死全部細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)，確定SKBR3的抗生素篩選濃度。選擇最佳轉(zhuǎn)染條件，將IGF-ⅡR打靶載體和pCS-sgRNA質(zhì)粒按質(zhì)量比1∶2電轉(zhuǎn)至SKBR3細(xì)胞中，加入最佳濃度的抗生素，藥物篩選7 d后，進(jìn)行PCR鑒定和單克隆細(xì)胞篩選。

1.6 混合克隆基因型的鑒定

提取混合細(xì)胞的基因組，以其為模板進(jìn)行PCR鑒定，鑒定方法如圖1B。一條引物（IGR-ⅡR-L-GT-F）位于LR上游，另一條引物（CAG-127R）位于CAG啟動(dòng)子處，利用此對(duì)引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為2307 bp；同理，引物（Ai3-2737F）位于敲入基因IGF-ⅡR處，另一引物（LscKO-CK-F）位于ployA處，利用此對(duì)引物鑒定外源基因IGF-ⅡR是否定點(diǎn)整合，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為8555 bp；引物（Puro-F）位于嘌呤霉素抗性基因處，另一引物（IGR-ⅡR-R-GT-R）位于RR下游，利用此對(duì)引物鑒定右側(cè)同源臂的重組，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為2789 bp。引物序列見表2。經(jīng)PCR鑒定正確，確認(rèn)重組成功后，挑取單細(xì)胞克隆。

圖1 打靶載體構(gòu)建策略和混合克隆鑒定示意圖

1.7 單細(xì)胞克隆

收集混合克隆鑒定正確的細(xì)胞，加入培養(yǎng)基，輕打混勻成細(xì)胞懸液，采用半固體和有限稀釋法制備單克隆。將半固體培養(yǎng)基于4℃過夜解凍，室溫靜置預(yù)熱 10～15 min，加入 400 μL 完全培養(yǎng)基，渦旋振蕩4～5 s，取出部分鋪種到6孔板中，剩余部分加入細(xì)胞懸液，混勻后加到上一步的6孔板中培養(yǎng)。挑取單克隆時(shí)，向96孔板中加入胰酶，每孔50 μL。挑取克隆結(jié)束后，將96孔板放于37℃培養(yǎng)箱中消化，每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基終止消化，吹打，培養(yǎng)。有限稀釋法將細(xì)胞懸液用完全培養(yǎng)基稀釋為1/100 μL，混勻后將細(xì)胞分裝至96孔板，每孔100 μL，進(jìn)行單克隆培養(yǎng)。

表2 PCR鑒定引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計(jì)Cas9/sgRNA質(zhì)粒的活性檢測，重復(fù)3次，用方差檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法，計(jì)算每組的x±s，分析所得數(shù)據(jù)，以對(duì)照（Con）組為1作為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算各組的相對(duì)sgRNA活性。

2 結(jié)果

2.1 Cas9/sgRNA質(zhì)粒構(gòu)建及活性檢測

以SKBR3基因組為模板擴(kuò)增靶序列AAVS1，條帶大小為634 bp（圖2A）。經(jīng)測序鑒定，確認(rèn)與GenBank中的參考序列一致，因此可根據(jù)此序列設(shè)計(jì)sgRNA?；趕gRNA的設(shè)計(jì)原則，針對(duì)AAVS1基因序列設(shè)計(jì)了6個(gè)長20 bp的sgRNA（表3），分別與pCS質(zhì)粒載體連接，經(jīng)測序確認(rèn)構(gòu)建成作用于AAVS1基因靶序列的Cas9/sgRNA質(zhì)粒。用UCA CRISPR/Cas9活性檢測試劑盒檢測sgRNA活性，顯示sgRNA2效率最高（圖2B）。

2.2 IGF-ⅡR打靶載體酶切鑒定

將IGF-ⅡR打靶載體用EcoRⅠ、ScaⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳觀察到5條帶，大小分別為7280、4913、3003、2124、1402 bp；NcoⅠ酶切，電泳后觀察到5條帶，大小分別為6537、5174、3216、2388、1407 bp；BglⅡ酶切，電泳后觀察到3條帶，大小分別為 10 473、5324、2925 bp，片段大小符合預(yù)期（圖2C）。將4號(hào)和5號(hào)打靶載體質(zhì)粒測序，結(jié)果正確。

表3 sgRNA序列

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及混合克隆基因型鑒定

流式細(xì)胞術(shù)檢測不同電轉(zhuǎn)參數(shù)下綠色熒光蛋白質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果見圖3。參數(shù)為1200 V、20 ms、2個(gè)脈沖時(shí)，轉(zhuǎn)染效率為27.1%，為最佳轉(zhuǎn)染參數(shù)。用不同濃度的嘌呤霉素處理細(xì)胞7 d，確定最佳嘌呤霉素篩選濃度為0.5 μg/mL。將活性最高的pCS-sgRNA2質(zhì)粒和IGF-ⅡR打靶載體以1200 V、20 ms、2個(gè)脈沖電轉(zhuǎn)SKBR3細(xì)胞，經(jīng)0.5 μg/mL嘌呤霉素篩選后收集細(xì)胞，提取基因組，以其為模板，用引物IGF-ⅡR-L-GT-F與CAG-127R擴(kuò)增的電泳條帶大小為2307 bp，用引物Puro-F與IGF-ⅡR-R-GT-R擴(kuò)增的電泳條帶大小為2789 bp，用引物Ai3-2737F與LscKO-CK-F擴(kuò)增的電泳條帶大小為8555p，符合預(yù)期（圖4）。挑取單細(xì)胞克隆進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 單克隆制備

在半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)19 d，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)較小，細(xì)胞生長緩慢，細(xì)胞狀態(tài)差；有限稀釋法制備的單克隆細(xì)胞培養(yǎng)22 d時(shí)，細(xì)胞生長極其緩慢，形成克隆細(xì)胞數(shù)約為20個(gè)，狀態(tài)差，不再繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。

圖2 Cas9/sgRNA質(zhì)粒構(gòu)建、活性檢測及IGF-ⅡR打靶載體酶切鑒定

圖3 細(xì)胞培養(yǎng)和電轉(zhuǎn)條件優(yōu)化

圖4 混合克隆基因型鑒定

3 討論

CRISPR/Cas9技術(shù)是在古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列，因其操作簡單快速、成本較低，且相對(duì)傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)具有更高的效率，近幾年已廣泛用于各種動(dòng)物及人類細(xì)胞的基因修飾[11]。Feng等通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了PinX1過表達(dá)和敲除的MDA-MB-231細(xì)胞系，證實(shí)PinX1過表達(dá)抑制了人基底樣乳腺癌的增殖和遷移能力，PinX1低表達(dá)則與其惡性行為相關(guān)[12]。Ding等基于CRISPR/Cas9的功能喪失基因圖譜發(fā)現(xiàn)了在HER-2陽性乳腺癌中驅(qū)動(dòng)內(nèi)在抵抗HER-2抑制的分子[13]。因此，CRISPR/Cas9系統(tǒng)為研究基因功能和生物進(jìn)展提供了更為理想的方法和先進(jìn)的細(xì)胞、動(dòng)物模型，極大地促進(jìn)了各種疾病的體內(nèi)外研究。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們在靶位點(diǎn)AAVS1設(shè)計(jì)6個(gè)sgRNA，長度20 bp左右，PAM序列為NGG，通過活性檢測選擇效率最高的sgRNA，利用sgRNA特異性分析工具判斷sgRNA序列的特異性，選擇靶向特異性好的序列，減少脫靶，從而使研究數(shù)據(jù)更為可靠。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)將IGF-ⅡR基因敲入AAVS1特定位點(diǎn)，通過強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)建IGF-ⅡR基因定點(diǎn)整合載體，在電轉(zhuǎn)染前對(duì)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)置了4組不同的電轉(zhuǎn)參數(shù)，將綠色熒光蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SKBR3細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分析不同參數(shù)條件下的轉(zhuǎn)染效率，發(fā)現(xiàn)在保證細(xì)胞生存能力達(dá)90%的條件下，參數(shù)為1200 V、20 ms、2個(gè)脈沖時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)，使得大量轉(zhuǎn)染細(xì)胞更為安全，保證了實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。轉(zhuǎn)染成功后，經(jīng)嘌呤霉素篩選、PCR鑒定，構(gòu)建了IGF-ⅡR在AAVS1位點(diǎn)定點(diǎn)整合的SKBR3混合克隆細(xì)胞系。在挑取單克隆細(xì)胞方面，有限稀釋法和半固體培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞幾乎零損害，操作簡單，技術(shù)成熟，成本較低，且不需特殊抗體試劑或設(shè)備儀器，在一定程度上降低了細(xì)胞培養(yǎng)工作量以及實(shí)驗(yàn)周期[14]。因此，本實(shí)驗(yàn)選用上述2種方法制備單克隆，但發(fā)現(xiàn)單克隆細(xì)胞生長極其緩慢，狀態(tài)差，后期逐漸凋亡。

大量文獻(xiàn)表明IGF-ⅡR是一種多功能受體，IGF-ⅡR可結(jié)合有絲分裂肽IGF-Ⅱ，并通過降解IGF-Ⅱ調(diào)節(jié)其細(xì)胞外水平來抑制腫瘤生長[15]。據(jù)報(bào)道，在6q26-27基因位點(diǎn)上的IGF-ⅡR雜合性缺失可導(dǎo)致包括乳腺癌、肝細(xì)胞癌、肺鱗癌等多種類型的腫瘤發(fā)生[16-18]，證實(shí)IGF-ⅡR可能參與了抑制腫瘤生長的推測。Lee等報(bào)道，在MDAMB-231乳腺癌細(xì)胞中，IGF-ⅡR表達(dá)增加會(huì)抑制細(xì)胞的侵襲和運(yùn)動(dòng)，在體內(nèi)抑制腫瘤生長[19]。Souza等進(jìn)行的體內(nèi)外研究表明，IGF-ⅡR在乳腺癌細(xì)胞中的過表達(dá)會(huì)降低癌細(xì)胞的生長速度，同時(shí)在某些情況下會(huì)促進(jìn)細(xì)胞死亡，而IGF-ⅡR沉默會(huì)增加細(xì)胞增殖和存活[20]。Dvei等發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅱ在乳腺腫瘤中可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制凋亡，增強(qiáng)局部浸潤和轉(zhuǎn)移。但是，由于IGF-ⅡR失活導(dǎo)致被結(jié)合的IGF-Ⅱ減少，從而起著抑制腫瘤的作用[21]。這些研究表明IGF-ⅡR作為抑癌基因在乳腺腫瘤中發(fā)揮作用。因此單克隆細(xì)胞的凋可能與IGF-ⅡR在一定程度上抑制SKBR3的生長、促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)，這與上述IGF-ⅡR作為抑癌基因在乳腺腫瘤中發(fā)揮作用的觀點(diǎn)一致。

綜上所述，我們應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得了IGF-ⅡR基因在AAVS1位點(diǎn)定點(diǎn)整合的混合克隆細(xì)胞系。后續(xù)將使用這一混合克隆細(xì)胞系，在曲妥珠單抗作用下，觀察細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲等特性，并構(gòu)建曲妥珠單抗抗性細(xì)胞，研究IGF-ⅡR的差異表達(dá)對(duì)曲妥珠單抗抗性細(xì)胞的影響，探究IGF-ⅡR在曲妥珠單抗耐藥形成過程中的作用機(jī)制。