歐晨 宋厚盼 李潔 陳向東 彭清華

〔摘要〕 目的 運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù)探究密蒙花顆粒劑治療干眼可能的作用機制。方法 通過運用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）篩選出密蒙花顆粒劑口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18的化合物作為候選藥效成分，根據(jù)TCMSP的“Related Targets”對密蒙花顆粒劑的活性成分的作用靶點進行預(yù)測，采用Cytoscape 3.6.0 軟件構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)。通過OMIM、DisGeNET數(shù)據(jù)庫查找干眼相關(guān)基因，通過STRING 數(shù)據(jù)庫進行蛋白質(zhì)相互作用分析。通過Venny圖將密蒙花顆粒劑活性成分靶點與干眼疾病靶點取交集，得到密蒙花顆粒劑有效活性成分治療干眼的關(guān)鍵靶點，構(gòu)建藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)。使用DAVID數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵靶點進行GO 功能注釋和KEGG 通路富集。運用AutoDock vina 1.1.2軟件對選取的密蒙花顆粒劑主要活性成分與關(guān)鍵靶點進行分子對接。結(jié)果 得到密蒙花顆粒劑對應(yīng)靶點的活性成分46個，預(yù)測作用靶點248個，干眼相關(guān)基因237個，密蒙花顆粒劑治療干眼的關(guān)鍵靶點18個，靶點參與的功能主要有細胞增殖調(diào)控、基因表達的調(diào)控、細胞凋亡、蛋白磷酸化、免疫反應(yīng)、衰老、調(diào)控細胞炎癥相關(guān)因子等，作用的主要通路為糖尿病、NOD樣受體、Toll樣受體、MAPK信號通路等。分子對接的結(jié)果顯示主要活性成分與獲得的有效靶點具有較好結(jié)合活性。結(jié)論 密蒙花顆粒劑可能主要通過抑制炎癥相關(guān)因子和通路，減輕淚腺組織的炎癥，從而達到治療干眼的目的。

〔關(guān)鍵詞〕 密蒙花顆粒劑;干眼;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對接;作用機制

〔中圖分類號〕R276.7 ? ? ? 〔文獻標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.07.005

〔Abstract〕 Objective To explore the possible action mechanism of Mimenghua Granule in the treatment of dry eye by using network pharmacology and molecular docking. Methods Compounds with oral bioavailability of 30% or more and drug-like ratio of 0.18 or higher in Mimenghua Granule were screened as candidate drug-effect ingredients by TCMSP database， and then predict the target of active ingredients of Mimenghua Granule according to "Related Targets" of TCMSP. The compounds-target interaction network was constructed by Cytoscape 3.6.0. The genes for dry eye was searched by OMIM and DisGeNET， and protein interaction analysis was performed through STRING database. The target of active ingredients of Mimenghua Granule intersects with the target of dry eye through the Venny diagram. The key targets of effective active ingredients of Mimenghua Granule to treat dry eye were obtained， and the drug-active component-key target-disease network was constructed. DAVID was used to perform GO function annotation and KEGG pathway enrichment on key targets. The main active components of Mimenghua Granule and the main target were performed molecular docking by AutoDock vina 1.1.2. Results Totally 46 active ingredients， 248 predicted targets， and 237 genes related to dry eye were identified. 18 key targets of Mimenghua Granule to treat dry eye were obtained. The targets were involved in regulation of cell proliferation， gene expression， cell apoptosis， protein phosphorylation， immune response， aging， regulation of cell inflammation-related factors， etc. The main pathways of action were diabetes mellitus， NOD-like receptor signaling pathway， Toll-like receptor signaling pathway， MAPK signaling pathway. The results of molecular docking showed that the main active components had good binding with the effective target. Conclusion Mimenghua Granule may reduce inflammation of lacrimal tissue through inhibiting inflammatory related factors and pathways to treat dry eye.

〔Keywords〕 Mimenghua Granule; dry eye; network pharmacology; molecular docking; action mechanism

干眼是以淚膜穩(wěn)態(tài)失衡為主要特征并伴有眼部不適癥狀的多因素眼表疾病，淚膜不穩(wěn)定、淚液滲透壓升高、眼表炎癥與損傷以及神經(jīng)感覺異常是其主要病理生理機制[1]。臨床表現(xiàn)為眼干燥感、異物感、燒灼感、畏光、視物模糊，嚴(yán)重者視力明顯下降，自覺癥狀重，影響工作和生活[2]。目前治療干眼的主要藥物有人工淚液、局部抗炎及免疫抑制劑、自體血清。但從藥物相關(guān)的治療效果來看，僅局限于改善臨床癥狀、延緩病情進展，且上述藥物的靶向性均較單一，因此亟需尋找新的思路解決這一問題。而中藥治療干眼以滋陰潤肺、清肝解郁、益氣養(yǎng)陰、滋補肝腎為主，在臨床上取得了較好的療效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，中藥在防治干眼方面具有獨特的優(yōu)勢和廣闊的發(fā)展前景[3]。

彭清華教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗，結(jié)合干眼的發(fā)病機制，創(chuàng)制了密蒙花顆粒劑。密蒙花為傳統(tǒng)中藥中重要的眼科用藥，具有疏風(fēng)清熱、養(yǎng)肝明目、退翳的功效，用于目赤腫痛、多淚羞明、眼生翳膜、肝虛目暗、視物昏花等癥狀。其主要含黃酮類、苯乙醇苷類和萜類等成分，具有抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等生理活性。本團隊前期臨床和實驗研究證實密蒙花對干眼有良好的治療作用[4-6]。枸杞子能滋補肝腎、益精明目，菊花有疏風(fēng)散熱、平肝明目之功。前期實驗研究證明密蒙花顆粒劑可以通過抑制淚腺組織中炎性因子IL-6、IL-12、TNF-α、IL-1β的表達減輕淚腺組織的炎癥，達到治療干眼癥的目的[7-8]。

中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在傳統(tǒng)經(jīng)驗、科學(xué)假說的基礎(chǔ)上，從實驗數(shù)據(jù)或文獻、數(shù)據(jù)庫中提取中藥成分、靶點、基因、通路、疾病等為關(guān)鍵要素，并以此關(guān)鍵要素為節(jié)點，通過計算節(jié)點間相互關(guān)系，模擬構(gòu)建機體分子關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)模型，探究生命活動的本質(zhì)、藥物與機體相互作用機制[9]。其優(yōu)勢在于可從蛋白、分子和基因等多層面揭示藥物對機體的作用及其機制，使研究具有靶向性。中藥具有多成分、多靶點的特征，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這種多靶點、多途徑和多層次的評價系統(tǒng)方法在中藥的研究中有較好的預(yù)測作用，更加切合中醫(yī)藥的學(xué)術(shù)特點和實際情況，為解決現(xiàn)代中藥研究的熱點問題發(fā)揮了巨大的作用[10]。分子對接技術(shù)是一種能快速準(zhǔn)確地預(yù)測蛋白-配體復(fù)合物結(jié)合構(gòu)象和親和力的重要研究技術(shù)，可對藥物活性成分作用于疾病靶點進行預(yù)測分析。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù)深入挖掘密蒙花顆粒劑的主要活性成分及治療干眼可能的作用靶點，闡述其作用機制。

1 資料與方法

1.1 ?藥物活性成分及靶蛋白的篩選

本研究通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）對密蒙花顆粒劑所有成分?jǐn)?shù)據(jù)庫進行了篩選。根據(jù)藥代動力學(xué)參數(shù)確定口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18作為化合物分子的篩選條件[11]。同時根據(jù)TCMSP的“Related Targets”對密蒙花、枸杞子、菊花的活性成分的作用靶點進行預(yù)測，對部分TCMSP沒有預(yù)測靶點的化合物檢索ETCM數(shù)據(jù)庫（http：//www.nrc.ac.cn：9090/ETCM/）對其靶點進行補充，最后將所有得到的靶點利用STRING進行格式轉(zhuǎn)換。使用Cytoscape 3.6.0軟件對密蒙花顆粒劑活性成分與預(yù)測靶點繪制化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 ?干眼相關(guān)基因查詢

運用OMIM（https：//omim.org/）、DisGeNET （http：//www.disgenet.org/）數(shù)據(jù)庫檢索“dry eye”，獲取干眼的相關(guān)基因。將這些基因靶點導(dǎo)入STRING 11.0 （http：//string-db.org/），獲得蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。

1.3 ?獲取密蒙花顆粒劑治療干眼的關(guān)鍵靶點

將密蒙花顆粒劑活性成分靶點與干眼疾病靶點取交集，得到密蒙花顆粒劑有效活性成分治療干眼的關(guān)鍵靶點。

1.4 ?構(gòu)建藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

使用Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，其中節(jié)點的類型有中藥、成分、靶點、疾病。

1.5 ?GO功能富集分析

GO是注釋基因及其表達產(chǎn)物的常用方法，由生物過程（BP）、細胞組成（CC）和分子功能（MF）3部分組成[11]。運用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對得到的密蒙花顆粒劑治療干眼的關(guān)鍵靶點進行GO功能分析，說明其在基因功能中的作用。

1.6 ?KEGG通路富集分析

運用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對得到的密蒙花顆粒劑治療干眼的關(guān)鍵靶點進行KEGG通路富集分析，從而了解密蒙花顆粒劑治療干眼可能發(fā)生改變的關(guān)鍵信號通路。

1.7 ?密蒙花顆粒劑主要活性成分與干眼主要靶點分子對接

通過pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索獲取密蒙花顆粒劑主要活性成分的3D結(jié)構(gòu)，從Protein Data Bank（http：//www.rcsb.org/pdb）中檢索獲得關(guān)鍵靶點的受體蛋白，利用PYMOL 2.3.4軟件對受體蛋白進行去水、去配體等操作，采用AutoDock 4.2.6軟件對受體蛋白進行加氫以及計算電荷處理，設(shè)置受體蛋白對接格點參數(shù)將小分子配體可能結(jié)合的活性口袋位點包含，利用AutoDock Vina 1.1.2對受體蛋白與配體小分子分別進行分子對接，對接獲取構(gòu)象并進行結(jié)合能打分，取結(jié)合能最好的進行作圖分析，采用PyMOL作三維圖顯示受體蛋白與配體小分子之間的相互作用。

2 結(jié)果

2.1 ?密蒙花顆粒劑活性成分及相應(yīng)的靶蛋白

初步篩選出密蒙花化學(xué)成分46種，枸杞子化學(xué)成分188種，菊花化學(xué)成分359種。其中OB≥30% 的成分共有270種，DL≥0.18的成分共有288種。通過OB、DL條件共篩選，刪除重復(fù)的5個化學(xué)成分，共有46個活性成分有良好的口服利用度和類藥性。其中OB值最大的為柚皮素，有59.29%;DL值最大的為環(huán)桉烯醇、（24r）-馬尾藻甾醇，為0.79。運用Cytoscape 3.6.0軟件對密蒙花顆粒劑活性成分與預(yù)測靶點繪制化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。刪除重復(fù)靶點后剩余靶點248個，密蒙花顆粒劑活性成分與靶點間存在867條互相作用關(guān)系。分析得出密蒙花顆粒劑中主要的化學(xué)成分為槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、柚皮素等。見表1。

2.2 ?干眼基因蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

分別通過OMIM、DisGeNET數(shù)據(jù)庫檢索到RP相關(guān)基因182個和61個。使用STRING 11.0繪制干眼蛋白相互作用關(guān)系圖（見圖2）。該網(wǎng)絡(luò)圖中包含237個表示靶蛋白的節(jié)點和853條表示相互作用關(guān)系的線，平均每個蛋白節(jié)點有7.2條互相作用的關(guān)系線。

2.3 ?密蒙花顆粒劑治療干眼的關(guān)鍵靶點

將密蒙花顆粒劑活性成分對應(yīng)的248個有效靶點與通過STRING 11.0得出的237個疾病有效靶點取交集。得出了18個密蒙花顆粒劑治療干眼的關(guān)鍵靶點，分別是TGFB1、IL1A、AR、IL1B、CASP8、EGFR、CXCL8、IL6、CCL2、IFNG、PTGS2、ICAM1、MMP9、SELE、ESR1、CHRM3、SOD1、SOAT1。

2.4 ?藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

圖3中紅色代表中藥密蒙花、枸杞子、菊花，黃色代表干眼，藍色代表密蒙花顆粒劑的活性成分，紫色代表中藥-疾病共同作用靶點。中藥密蒙花顆粒劑主要通過19種活性成分作用于18個靶點來治療干眼疾病，其中與活性成分連接較多的靶點為PTGS2、AR。

2.5 ?GO功能富集分析

運用DAVID 數(shù)據(jù)庫對密蒙花顆粒劑治療干眼的18個關(guān)鍵靶點進行GO 功能富集分析，共收集到44條。其中包括生物過程34條，分子功能6條、細胞組成4條。主要涉及細胞增殖調(diào)控、基因表達的調(diào)控、細胞凋亡、蛋白磷酸化、免疫反應(yīng)、衰老、調(diào)控細胞因子（NF-？資B、白介素6、白介素1、蛋白激酶B）等生物學(xué)過程，主要富集于細胞外、細胞質(zhì)、細胞核等區(qū)域，分子功能包括細胞因子活性、酶結(jié)合、相同蛋白結(jié)合、鋅離子結(jié)合等。通過Omicshare平臺對結(jié)果進行可視化處理，氣泡圖見圖4。

2.6 ?KEGG通路富集分析

運用DAVID 數(shù)據(jù)庫對密蒙花顆粒劑治療干眼的18個關(guān)鍵靶點進行KEGG 通路富集分析，得到了23條信號通路。包括類NOD樣受體、Toll樣受體、糖尿病、MAPK信號通路。氣泡圖見圖5。

2.7 ?密蒙花顆粒劑主要活性成分與干眼主要靶點分子對接

選取密蒙花顆粒劑中5個最主要的化學(xué)成分quercetin、kaempferol、luteolin、beta-sitosterol、naringenin，與“2.4”中得出的密蒙花顆粒劑治療干眼的關(guān)鍵靶點PTGS2（PDB ID： 5F1A）、AR（PDB ID： 5V8Q）進行分子對接。PTGS2與主要化學(xué)成分的結(jié)合能分別為-9.7、-9.5、-9.8、-8.5、-9.5 kcal/mol，AR與主要化學(xué)成分的結(jié)合能分別為-8.3、-8.7、-9.8、-8.9、-7.9 kcal/mol。luteolin與兩個受體蛋白的結(jié)合能最好，均為-9.8 kcal/mol。圖6為luteolin配體小分子和受體蛋白AR之間的結(jié)合模式，氨基酸殘基Asn705、Arg752與luteolin配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Met787、Leu873、Met780、Thr877、

Leu880、Leu701、Leu704、Leu707、Gln711、Phe764、Val746、Met749與luteolin配體小分子形成疏水相互作用，圖7為luteolin配體小分子和受體蛋白PTGS2之間的結(jié)合模式，氨基酸殘基Arg125、Arg44、Glu465、His39與luteolin配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Thr130、Val46、Pro153、Cys41、Gln461、Leu152、Arg469與luteolin配體小分子形成疏水相互作用。

3 討論

本研究以密蒙花顆粒劑作為藥物，研究其治療干眼的作用機制。運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析密蒙花顆粒劑包含的藥物密蒙花、枸杞子、菊花的有效成分，構(gòu)建密蒙花顆粒劑活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，分析密蒙花顆粒劑活性成分與靶點之間的相互關(guān)系。其中密蒙花顆粒劑活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成分是槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、柚皮素。槲皮素是一種黃酮類化合物，具有顯著的細胞保護、抗氧化作用。柚皮素是柚皮甙的甙元，具有抗菌、抗炎、抗氧化、解痙和利膽等作用。有研究表明，槲皮素和柚皮素均可通過降低炎癥反應(yīng)來減輕神經(jīng)病理學(xué)疼痛[12-13]。木犀草素、柚皮素等在眼科領(lǐng)域中進行了大量的研究，均取得了較好的療效[14-15]。本研究得出密蒙花顆粒劑治療干眼的18個關(guān)鍵靶點，其中PTGS2被發(fā)現(xiàn)與干眼有關(guān)，有研究使用PTGS2抑制劑作用于干眼小鼠模型，顯示其通過參與免疫炎性反應(yīng)治療干眼[16]。大量研究報道AR影響眼組織的組織結(jié)構(gòu)和功能活動，可治療干眼，人淚腺、瞼板腺、角膜、球結(jié)膜、晶狀體上皮細胞、視網(wǎng)膜色素上皮細胞等多種眼組織可能是AR作用的靶部位[17]。本研究團隊證實L1B、IL6、ICAM1、CASP8、MMP9在密蒙花顆粒劑治療干眼的過程中發(fā)揮著重要作用[4-7，18]。

為了說明篩選出的關(guān)鍵靶點在基因功能和信號通路中的作用，本研究進行了GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。分析得出密蒙花顆粒劑主要通過細胞增殖調(diào)控、基因表達的調(diào)控、細胞凋亡、蛋白磷酸化、免疫反應(yīng)、衰老、調(diào)控細胞炎癥相關(guān)因子等生物學(xué)過程治療干眼疾病。大多數(shù)基因可富集到糖尿病、NOD樣受體、Toll樣受體、MAPK信號通路。糖尿病與干眼關(guān)系密切，糖尿病干眼癥是糖尿病的慢性并發(fā)癥之一，與單純的干眼相比臨床表現(xiàn)更為嚴(yán)重。NOD樣受體、Toll樣受體分別作為胞外和胞內(nèi)模式識別受體在炎癥反應(yīng)中起到重要作用。MAPK信號通路可參與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細胞凋亡等多種病理生理過程，密蒙花顆粒劑已證實可通過干預(yù)MAPK信號通路來阻斷相關(guān)炎癥反應(yīng)，從而改善眼表癥狀[5]。從分子對接結(jié)果可知，密蒙花顆粒劑中的5個最主要的活性化合物與關(guān)鍵靶點PTGS2、AR的結(jié)合能均小于-7 kJ/mol，表明這些化合物可能直接作用于PTGS2、AR，從而治療干眼。

綜上所述，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù)，初步探究了密蒙花顆粒劑多成分、多靶點、多通路的復(fù)雜機制過程。發(fā)現(xiàn)密蒙花顆粒劑發(fā)揮作用的主要生物活性成分槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、柚皮素，密蒙花顆粒劑治療干眼的作用機制涉及細胞增殖調(diào)控、基因表達的調(diào)控、細胞凋亡、蛋白磷酸化、免疫反應(yīng)、衰老、調(diào)控細胞炎癥相關(guān)因子等，作用的主要通路為糖尿病、NOD樣受體、Toll樣受體、MAPK信號通路等。分子對接的結(jié)果顯示主要活性成分與獲得的有效靶點具有較好結(jié)合活性。本研究可為密蒙花顆粒劑治療干眼提供一定的依據(jù)，為進一步實驗研究提供研究方向，也可為臨床治療干眼及新型藥物的開發(fā)提供思路。

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