基于生物信息學的疏肝利膽和胃方組方特點及治療反流性食管炎機制分析

彭艷紅，吳東寧，滕丹，白光，王慶峰

1.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032；2.北京豐臺右安門醫(yī)院，北京 100069；3.遼寧何氏醫(yī)學院，遼寧 沈陽 110163；4.遼寧中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，遼寧 沈陽 110032

反流性食管炎（reflux esophagitis，RE）是消化內科常見疾病，為胃及十二指腸內容物反流入食管，最終引起的食管炎癥性病變[1]。RE 可發(fā)生于任何年齡人群，成人發(fā)病率隨年齡增長而升高。其發(fā)病機制有反流屏障受損、反流物侵蝕作用、胃排空障礙、幽門螺桿菌感染，以及炎癥介導因子等。RE 中醫(yī)病機可概括為肝膽失于疏泄，胃失和降，導致胃氣上逆，上犯食管，其臨床常見證型為肝胃不和[2]。疏肝利膽和胃方由半夏、黃芩、柴胡、枳實、蒲公英、砂仁、浙貝母、白及、白芷、茯苓組成，乃國醫(yī)大師周學文所創(chuàng)，宗半夏瀉心湯、小柴胡湯、四逆散、參苓白術散、烏貝散之義，辛苦同進，升降并用，補瀉兼施，共奏疏肝理氣、健脾和胃、降逆止嘔之功。但其作用機制尚不明確。

目前，中藥復方作用機制分析已由單一靶點或信號通路過渡到以網絡藥理學為代表的系統(tǒng)生物學和多向藥理學研究[3]。通過生物信息學手段，可對復方的物質基礎及作用分子靶點進行網絡融合，并進一步應用數(shù)據庫工具探索復方的起效機制。然而，網絡藥理學研究大多通過分析多成分-多靶點網絡作用關系探討復方的整體作用[4-5]，雖然符合中醫(yī)的整體觀念及辨證論治特性，但對復方中重要藥對的配伍關系分析不足。因此，如何應用現(xiàn)有技術對復方內的藥物組成關系進行深入研究，并進一步考察組方的配伍關系，是網絡藥理學處理復雜復方的難題之一。為此，本研究除采用網絡藥理學方法對疏肝利膽和胃方進行數(shù)據挖掘外，應用主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA）考察方中藥味之間的相互關系，并進一步分析復方作用的核心分子靶點，預測疏肝利膽和胃方治療RE 的物質基礎及機制，以期為同類研究提供方法學參考。

1 資料與方法

1.1 疏肝利膽和胃方相關數(shù)據集采集與處理

通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據庫與分析平臺（TCMSP，http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）檢索疏肝利膽和胃方中各藥物的化學成分及對應分子靶點。遵照Lipinski 規(guī)則對所獲得的化學成分進行篩選，篩選條件[6]:①分子量（MW）＜500；②脂水分配系數(shù)（Alog P）≤5；③氫鍵供體數(shù)目（Hdon）≤5；④氫鍵受體數(shù)目（Hacc）≤10。獲得疏肝利膽和胃方的主要化學成分。利用Excel2016 整理上述有效成分對應的分子靶點信息，建立藥物（橫坐標）-分子靶點（縱坐標）數(shù)據集，該數(shù)據集內的數(shù)值為藥物作用不同分子靶點的重復值。

1.2 疏肝利膽和胃方藥物聚類描述

①采用 Omicshare3.0 軟件（ https://www.omicshare.com）對所得數(shù)據集進行PCoA:依據方中各藥物對應的分子靶點重復值，統(tǒng)計各分子靶點的集中度。②采用Omicshare3.0 軟件對所得重復值信息制作關系距離熱圖（bray 算法），并根據熱圖色塊的變化情況分析方中各藥物分子靶點的集中度關系。③以Omicshare3.0 軟件對獲得的各藥物集中度差異情況制作PCoA 圖，最終確定各藥物之間的相互關系。④對“1.1”項下全部藥物作用的分子靶點重復總值排序，取前50，將其定義為核心分子靶點。應用TBtools V0.66 軟件的Heatmap 包對上述靶點的重復值做均一化處理后，制作熱圖，以考察上述核心分子靶點在各藥物內的分布情況，確定各味藥在疏肝利膽和胃方內的權重。

1.3 反流性食管炎背景網絡構建

①通過CTD 數(shù)據庫（http://ctdbase.org/）[7]篩選RE 相關的分子靶點:在“Diseases”搜索框中輸入“reflux esophagitis”，獲得RE 的分子靶點信息，并將其定義為RE 背景網絡。②考慮到RE 背景網絡內的靶點信息較多，以相關性系數(shù)（inference score）＞20及參考文獻數(shù)量（reference count）＞10 對RE 的背景網絡進行篩選，獲得RE 核心背景網絡。

1.4 疏肝利膽和胃方治療反流性食管炎潛在靶點及功能富集

①以“1.1”項下疏肝利膽和胃方對應的分子靶點對“1.3”項下RE 背景網絡及RE 核心背景網絡分別進行映射，獲得疏肝利膽和胃方治療RE 的潛在靶點，綜合“1.1”項下方中各藥物有效化學成分信息，應用Cytoscape3.7.2 軟件對映射所得靶點構建“藥物-有效成分-分子靶點”網絡及“藥物-有效成分-核心分子靶點”網絡。②以“1.2”項下核心分子靶點對上述網絡進行映射，獲得疏肝利膽和胃方治療RE 的潛在核心靶點。③應用 WebGestalt 數(shù)據庫（http://www.webgestalt.org）[8]及Cytoscape3.7.1 軟件的ClueGO 包，對①中獲得的核心分子靶點分別進行GO 功能富集和KEGG 通路富集，以確定疏肝利膽和胃方治療RE 的分子機制。

2 結果

2.1 疏肝利膽和胃方主要成分作用靶點

經TCMSP 數(shù)據庫檢索及數(shù)據篩選，共獲得疏肝利膽和胃方中10 個藥物的369 個有效成分，刪除重復值后，共獲212 個唯一有效成分。有效成分及靶點分布情況見表1。

以相關性系數(shù)＞20、參考文獻數(shù)量＞10 對RE 背景網絡進行篩選，獲得73 個靶點。以上述73 個分子靶點及“2.1”項下獲得的藥物、有效成分及分子靶點數(shù)據庫的分布情況，構建“藥物-有效成分-核心分子靶點”網絡，見圖4?？芍韪卫懞臀阜阶饔糜赗E 核心分子靶點的藥物仍以半夏有效成分最多（38個），另有蒲公英（2 個）、砂仁（1 個）、枳實（1 個）及黃芩（1 個），其他藥物并未出現(xiàn)在該網絡中，提示這5 種藥物為疏肝利膽和胃方治療RE 的核心藥物，其中以半夏最為重要。該網絡內17 個分子靶點的平均度值為5.65，共有11 個分子靶點大于平均度值。同時，以上述靶點對“2.2”項下篩選出的50 個核心靶點進行映射，最終得出疏肝利膽和胃方治療RE 的核心靶點為PTGS2 及BCL2L1。

2.4 疏肝利膽和胃方對反流性食管炎的治療機制

對圖4 篩選出的17 個靶點進行GO 功能富集和KEGG 通路分析，結果見圖5、圖6?？芍?，疏肝利膽和胃方對RE 的治療機制主要集中于炎癥反應抑制，涉及NF-κB 通路、TNF 通路、IL-17 通路、花生四烯酸代謝通路、FoxO 通路和PI3K-Akt 通路等多條炎癥通路；而AMPK 信號通路主要調節(jié)食管的能量代謝。上述結果表明，疏肝利膽和胃方可通過一系列信號通路，多角度、多靶點緩解RE 的發(fā)生和發(fā)展。

圖4 疏肝利膽和胃方治療RE 的藥物-有效成分-核心分子靶點網絡

圖5 疏肝利膽和胃方治療RE 核心靶點KEGG 通路富集

圖6 疏肝利膽和胃方治療RE 核心靶點GO 功能富集

3 討論

疏肝利膽和胃方舒肝利膽、降逆止嘔?，F(xiàn)代藥理學研究表明，方中半夏可抑制嘔吐中樞[9]，黃芩、柴胡可抗炎鎮(zhèn)痛[10-11]。目前針對該方組成藥物治療RE的研究多集中于半夏。郭震浪等[12]關于半夏瀉心湯治療RE 的Mate 分析顯示，與西藥比較，半夏瀉心湯可有效提高RE 的臨床療效。另外，半夏厚樸湯、小半夏湯等方劑治療RE 效果也較佳[13-14]。然而，現(xiàn)有研究多集中于療效觀察，對其治療機制研究較少。

為理清疏肝利膽和胃方的作用機制，本研究嘗試應用PCoA 考察組方藥物之間的配伍關系。由分析結果可知，君藥半夏與臣藥白芷、砂仁關系較為密切，而另一君藥黃芩與臣藥柴胡、枳實關系較為密切。推測上述兩君藥分別與四臣藥構成不同的功能模塊。半夏模塊以消痞散結為主，白芷、砂仁理氣效果好，可配合半夏消痞；黃芩清胃經、膽經濕熱，配合柴胡、枳實入肝經，進一步疏肝解郁。茯苓利水滲濕，加速肝膽濕熱排出，與其他藥物的功效有較大差異，因此在PCoA 圖中距離其他藥物的聚類靶點較遠。由上述結果可知，PCoA 配合網絡藥理學對復雜方劑進行研究從技術上是可行的。

本研究獲得的“藥物-有效成分-分子靶點”網絡中，黃芩素、沒食子酸、6-姜烯酚、β-欖香烯及咖啡酸等自由度較高，然而，上述幾個潛在有效成分并無針對RE 的相關報道。黃芩素作為自由度最高的有效成分，其有較好的抗炎活性。高東等[15]研究表明，黃芩素可直接降低胃潰瘍模型大鼠血清丙二醛、三葉因子1、三葉因子2 及胃黏膜前列腺素E2、表皮生長因子的表達，可將其視為疏肝利膽和胃方的重要有效成分。與黃芩素類似，沒食子酸[16]、6-姜烯酚[17]等成分多以抗炎作用起效。

在“藥物-有效成分-核心分子靶點”網絡中，自由度較高的分子靶點分別為PTGS2（前列素內環(huán)氧化物合成酶2）、TP53（腫瘤蛋白53）、CASP3（半胱氨酸蛋白酶3）、CASP9（半胱氨酸蛋白酶9）、BCL2L1（人BCL2 樣蛋白1）、RELA（細胞核因子κp65）、BCL2（B 淋巴細胞瘤2）、BAX（促凋亡因子）、TNF（腫瘤壞死因子）等14 個靶點。其中，PTGS2 及BCL2L1 被定義為疏肝利膽和胃方治療RE 的核心分子靶點。PTGS2 也稱為環(huán)氧合酶-2（COX-2），其過表達可增加局部組織前列腺素的合成，刺激炎癥反應。作為炎癥疾病，RE 患者食管黏膜PTGS2 表達水平與食管遠端酸暴露呈正相關[18]。作為重要的抑癌因子，TP53 與食管癌的關系被廣泛報道[19]，其下游蛋白p53 與RE 的發(fā)病關系極為密切:p53 往往與食管黏膜暴露、細胞增生加速相關，而過度的酸堿刺激會進一步上調p53 的表達[20]，因此，抑制TP53 可有效阻遏下游蛋白的表達，起到緩解細胞增生的作用。Casp9 及Casp3 是疏肝利膽和胃方治療RE 的重要調節(jié)分子靶點，Casp9 是Casp3 重要的上游蛋白。程靜等[21]研究表明，Casp3 下調與胃黏膜的損傷程度密切相關。隨RE 誘發(fā)的炎癥反應，Casp3 下調會抑制凋亡通路，導致食管上皮鱗狀細胞異常增殖（癌變的前兆）[22]。另一方面，RE 的炎癥損傷會介導Casp3 過表達，誘導胃黏膜細胞的凋亡。作為Caspase 通路的上游信號因子，靶點Bax、Bcl2 及Bcl2L1 的分子功能主要是通過調控下游的Casp3 介導后續(xù)的細胞凋亡程序[23]。與上述3 個靶點類似，TNF 可通過TNF→TNFR1 的結合，激活FADD 形成Casp8 和Casp10 的前體，并進一步激活下游的Casp8 和Casp10；通過AKT→Bad 通路生成Casp9，并與Casp8 和Casp10 生成Casp3 前體，介導后續(xù)的凋亡程序[24]。RELA 是重要的炎癥調控蛋白，雖然尚無其與RE 相關性的報道，但RELA 在多種炎癥疾病中的上調趨勢與炎癥的病變程度正相關[25-26]，提示RELA 是抑制RE 炎癥反應的重要靶點。綜上可知，疏肝利膽和胃方可通過調節(jié)上述分子靶點實現(xiàn)對RE 的治療作用。

從分子靶點的KEGG 通路富集結果可知，疏肝利膽和胃方治療RE 涉及NF-κB 通路、TNF 通路、AMPK通路、IL-17 通路、花生四烯酸代謝通路、FoxO 通路、PI3K-Akt 通路和胃酸分泌等。NF-κB 通路是調控大量炎癥信號因子的信號中樞，可直接激活炎癥反應[27]，該信號通路廣泛參與細胞的炎癥反應、細胞增殖、分化與凋亡，以及各類免疫反應；TNF 通路是其下游通路，在炎癥反應的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[24]。FoxO通路主要通過對下游NF-κB 及TNF 等通路的抑制實現(xiàn)其功能，祁永福等[28]研究顯示，通過對FOXO4/NF-κB/TNF-α 炎癥信號通路的調控，可以有效緩解RE 的炎癥反應及食管損傷。PI3K-Akt 通路也是NF-κB 的上游通路，抑制PI3K/Akt 信號通路可減少多種炎癥因子的釋放，通過抑制該通路可有效減緩RE 進展[29]。白細胞介素（IL）-23 誘導IL-17 產生的細胞內信號傳導通路，形成IL-23/IL-17 炎癥軸[30]，其在許多慢性炎癥及免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)病過程中起關鍵作用[31]，而IL-17 信號通路也是RE 治療的重要靶點[32]。疏肝利膽和胃方對IL-17 信號通路的抑制，可視為其對炎癥反應抑制的重要機制之一。AMPK 信號通路與細胞能量代謝有關，在RE 發(fā)病過程中，隨AMPK 信號通路的阻遏，細胞內生成的ATP 被過度分解，食管組織內ATP 不足以維持食管肌肉收縮所需，降低了括約肌壓力，其抗反流的屏障作用隨之減弱[33]。由上述結果可知，疏肝利膽和胃方治療RE 的機制是對多條炎癥通路的抑制，同時可調節(jié)食管細胞的能量代謝，最終保護食管。

RE 發(fā)生是多靶點共同作用的結果，伴隨著相應的信號通路傳導，最終實現(xiàn)其炎癥反應，并導致相應的細胞損傷。本研究借助生物信息學手段對疏肝利膽和胃方進行分析，揭示了組方藥物的作用關系及核心作用靶點，并進一步應用網絡藥理學手段，對該方治療RE 的分子靶點進行分析，闡釋了疏肝利膽和胃方治療RE 的潛在作用機制。今后研究可針對上述靶點及通路進行驗證，以確定疏肝利膽和胃方作用的確切分子機制。