張煊承，李航，謝素珠，趙少偉，王浩，張爽，賈立軍

(東北寒區(qū)肉牛科技創(chuàng)新教育部工程研究中心，延邊大學(xué)，吉林 延吉 133002)

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種專性胞內(nèi)機會性致病原蟲，呈世界范圍流行，廣泛感染幾乎所有的溫血動物，能夠引起嚴重的人畜共患傳染病[1-2]。貓科動物既是其終末宿主，也是其中間宿主之一，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)弓形蟲的中間宿主無選擇性，涵蓋了各種動物和人[3]。弓形蟲基因型分類主要為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型和非典型基因型，并且每種基因型之間差異較大[4]。Ⅰ型蟲株的毒性最強，如RH株；Ⅱ、Ⅲ型的致病能力則較弱，如PLK株和PRU株[5-7]。弓形蟲其生活史的各個階段的抵抗力大不相同，滋養(yǎng)體的抵抗力最弱，卵囊的抵抗力則最強，但其每個階段均具有感染性，對人類的生命健康和畜牧業(yè)的發(fā)展造成嚴重的威脅[8]。

微線體蛋白MIC可根據(jù)是否具有跨膜結(jié)構(gòu)分為兩類，其中微線體蛋白MIC10屬于不具有跨膜結(jié)構(gòu)的蛋白。TgMIC10異于其他的MIC蛋白，在蟲體的速殖子期和緩殖子期都存在表達，在前者中的含量約為后者的3倍。成熟的MIC10的分子量為18 kD，它的前導(dǎo)肽序列十分長，由58個氨基酸構(gòu)成，而成熟的誘導(dǎo)肽序列是由9個二谷氨酸重復(fù)和1個不完全的重復(fù)序列組成，且誘導(dǎo)肽不含有半胱氨酸[9]。針對重組MIC10制造的抗體可以識別天然MIC10，通過間接免疫熒光試驗等對MIC10基因蛋白進行定量，可以幫助區(qū)分急性感染和慢性感染[10]。本試驗對MIC10基因進行克隆和表達，以期為該基因及其轉(zhuǎn)錄蛋白的結(jié)構(gòu)、功能分析及臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲株與血清

Vero細胞、弓形蟲RH株由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室保存；小鼠抗弓形蟲陽性血清、弓形蟲陰性血清均由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室制備、保存。

1.2 試劑

ExTaq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA marker等均購自大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司；BL21感受態(tài)購自于北京全式金生物技術(shù)有限公司；蟲體DNA提取試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank上登錄的弓形蟲基因序列(XM_002367312.2)，使用Premier 5.0軟件設(shè)計合成特異性引物，預(yù)期597 bp。2條引物5′端分別引入了BamHⅠ和XhoⅠ限制酶切位點。引物由上海英濰捷基有限公司合成。上游引物F1：5′-CGCGGATCC-ATGGCGCTTTCTTCTTTGAACA-3′；下游引物F2：5′-CCGCTCGAGCTACATCGATTTCCTGCGTCT-3′。

1.4 MIC10基因PCR擴增

將獲得的弓形蟲DNA作為模版，用于PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系25 μL：模板DNA 1.5 μL，dNTP 1 μL，上下游引物各1 μL，10×Buffer 2.5 μL，Taq酶0.3 μL，去離子水17.7 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃進行預(yù)變性5 min，94 ℃進行變性1 min，54 ℃退火90 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸7 min后，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.5 MIC10基因重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建及測序

將PCR產(chǎn)物與pMD-18T載體連接后，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞，提取重組質(zhì)粒，進行PCR鑒定和XhoⅠ、BamHⅠ雙酶切鑒定，并將鑒定正確的重組克隆質(zhì)粒進行測序分析。

1.6 MIC10基因原核表達質(zhì)粒構(gòu)建

用XhoⅠ、BamHⅠ雙酶切PGEX-4T-1原核表達載體，膠回收載體片段。將重組質(zhì)粒的酶切膠回收產(chǎn)物與PGEX-4T-1載體的酶切膠回收的產(chǎn)物，連接16 ℃過夜。轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞，提取重組質(zhì)粒并進行PCR鑒定和XhoⅠ、BamHⅠ雙酶切鑒定，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定結(jié)果。

1.7 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達分析

將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，IPTG 37 ℃誘導(dǎo)表達。每隔2 h取菌液，離心沉淀，并裂解后，進行SDS-PAGE電泳分析表達產(chǎn)物。以小鼠抗弓形蟲陽性血清作為一抗，以辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG作為二抗進行Western blot分析。

2 結(jié)果

2.1 弓形蟲MIC10基因PCR擴增結(jié)果

以弓形蟲的DNA為模板，PCR后得到MIC10基因的目的片段。將產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳后得到597 bp目的條帶，擴增條帶與預(yù)期大小相同。見圖1所示。

M. DL 2000 DNA Marker;1、2. MIC10目的基因擴增片段;3. 陰性對照圖1 MIC10基因片段PCR擴增結(jié)果

2.2 重組克隆質(zhì)粒鑒定與測序分析

重組質(zhì)粒pMD18-T-MIC10經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定，PCR擴增出597 bp的目的片段，見圖2所示。經(jīng)XhoⅠ與BamHⅠ雙酶切后，獲得約597 bp的目的條帶與2 692 bp的載體片段，見圖3所示。序列測定分析的結(jié)果表明，獲得的弓形蟲MIC10基因序列與GenBank上弓形蟲基因序列(XM_002367312.2)同源性為100%。

M. DL 2000 DNA Marker; 1、2. pMD18-T-MIC10 PCR產(chǎn)物; 3. 陰性對照圖2 pMD18-T-MIC10 PCR鑒定

M. DL 5000 DNA Marker; 1、2. pMD18-T-MIC10酶切片段圖3 pMD18-T-MIC10雙酶切鑒定

2.3 重組表達質(zhì)粒PGEX-4T-MIC10鑒定

對重組表達質(zhì)粒PGEX-4T-MIC10進行PCR鑒定和酶切鑒定，PCR擴增出597 bp的目的片段，見圖4所示。

M. DL 5000 DNA Marker; 1、2. PGEX-4T-1 PCR產(chǎn)物;3. 陰性對照圖4 PGEX-4T-MIC10 PCR鑒定

經(jīng)XhoⅠ與BamHⅠ雙酶切后，獲得約597 bp的目的條帶和4 969 bp 的載體條帶，見圖5所示。

M. DL 5000 DNA Marker; 1、2. PGEX-4T-1雙酶切片段圖5 PGEX-4T-MIC10酶切鑒定

2.4 重組蛋白表達分析

分別取IPTG誘導(dǎo)前樣品和誘導(dǎo)后每2 h的樣品，進行SDS-PAGE，在約49 kD處出現(xiàn)MIC10基因與載體共同表達蛋白的目的條帶，說明重組蛋白表達正確，見圖6所示。Western blot分析表明，該蛋白能被小鼠抗弓形蟲陽性血清所識別，具有較好的反應(yīng)原性(圖7)。

M.蛋白質(zhì) Marker; 1. 誘導(dǎo)前MIC10; 2. 誘導(dǎo)2 h MIC10; 3. 誘導(dǎo)4 h MIC10; 4. 誘導(dǎo)6 h MIC10; 5. 誘導(dǎo)8 h MIC10圖6 重組MIC10蛋白SDS-PAGE電泳鑒定

M. 蛋白質(zhì) Marker; 1. 誘導(dǎo)前MIC10; 2. 誘導(dǎo)后MIC10; 3. 陰性對照圖7 重組MIC10蛋白Western blot分析

3 討論

作為頂復(fù)體門寄生蟲，弓形蟲和肉孢子蟲等一樣為專性寄生蟲，而且弓形蟲為人獸共患病，嚴重危及人類的生命安全[1]。自弓形蟲被發(fā)現(xiàn)以來，對它的研究從未中斷過，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，弓形蟲的感染與致病機制逐漸被明確，但是如何在感染早期及時準確的發(fā)現(xiàn)機體被感染仍值得探討。

弓形蟲侵襲和附著宿主細胞靠它的3個主要細胞器產(chǎn)生的蛋白，即棒狀體蛋白、致密顆粒蛋白和微粒體蛋白。蟲體侵襲過程中最先產(chǎn)生微線體并黏附宿主細胞，隨即棒狀體釋放內(nèi)容物形成納蟲泡，最后致密顆粒蛋白進入納蟲泡形成納蟲泡膜，完成整個侵襲過程。研究較多的微線體蛋白主要有MIC2和MIC5，MIC2的主要功能是幫助蟲體黏附宿主細胞，MIC5則不具有黏附結(jié)構(gòu)，已證實MIC5具有診斷價值，而且與急性弓形蟲病患者血中分離到的診斷抗原H4序列相同。

MIC10是微線體蛋白中發(fā)現(xiàn)較晚的，但是查閱EST數(shù)據(jù)庫可以發(fā)現(xiàn)，MIC10出現(xiàn)頻率較高[9]。MIC10的全長序列為198個氨基酸，二級結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋，由于缺乏跨膜域，MIC10與宿主細胞受體綁定，因此MIC10可以從感染部位擴散形成循環(huán)抗原，而用于弓形蟲病的診斷。在速殖子快速增殖的急性感染期MIC10大量表達，蛋白水平遠高于其他階段，因此MIC10可以作為區(qū)別急性和慢性感染的主要指標。為了進一步探討MIC10的功能，制備能夠穩(wěn)定且高效表達MIC10蛋白的表達載體是研究的關(guān)鍵。本試驗從NCBI上查閱到弓形蟲MIC10基因的堿基序列，用Primer 5.0設(shè)計MIC10基因的特異性引物，并在Blast上做了驗證，確保了試驗所用引物的可靠性。本試驗成功擴增了大小為597 bp的MIC10基因片段，構(gòu)建pMD18-T-MIC10克隆質(zhì)粒和PGEX-4T-MIC10原核表達載體，經(jīng)PCR鑒定和雙酶切鑒定正確，并在大腸桿菌中成功表達，表達蛋白的分子量約為49 kD。本試驗為弓形蟲MIC10基因功能的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。