魏麗榮，滕小艷，夏前林，杜玉珍,2

1.上海健康醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院東院檢驗科，上海 201306；2.上海市第六人民醫(yī)院東院檢驗科，上海201306

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，導(dǎo)致其高病死率的主要原因是局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，但目前腫瘤細(xì)胞的具體轉(zhuǎn)移機(jī)制仍未完全明確［1］。肺癌等惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的發(fā)生密切相關(guān)。斯鈣素1（stanniocalcin 1，STC1）是一種激素類糖蛋白，以自分泌/旁分泌的方式產(chǎn)生效應(yīng)。STC1的高表達(dá)與胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌等癌癥的發(fā)展和不良預(yù)后相關(guān)［2-5］。在前期工作中我們發(fā)現(xiàn)，STC1蛋白在Ⅲ～Ⅳ期肺腺癌患者的血清和組織中顯著升高，STC1過表達(dá)能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡；此外，我們還發(fā)現(xiàn)，肺癌患者組織中的STC1蛋白水平與肺癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)呈正相關(guān)［6-7］。但STC1對肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響及其作用機(jī)制，目前還未完全闡明。本研究通過檢測STC1對肺癌細(xì)胞EMT標(biāo)志物的影響，以及細(xì)胞侵襲和遷移能力的改變，探討SCT1在肺癌細(xì)胞EMT及轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

TRIzol試劑和LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；pBABE-puro反轉(zhuǎn)錄病毒載體、pUMVC和pCMV-VSV-G包裝載體購自美國Addgene公司；胰蛋白酶消化液購自美國Solarbio公司；Transwell小室購自美國Corning公司；基質(zhì)膠Matrigel購自美國BD公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和蛋白預(yù)染Marker 購自加拿大Fermentas公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計合成；SYBR Green PCR試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司；RIPA組織細(xì)胞快速裂解液和30%丙烯酰胺（29∶1）購自美國Solarbio公司；聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）購自美國Millipore公司；鼠抗人STC1抗體（ab239518，1∶1000）購自英國Abcam公司，鼠抗人上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）（14472S，1∶1 000）、鼠抗人神經(jīng)型鈣黏蛋白（N-cadherin）（14215S，1∶1 000）、鼠抗人EpCAM（2929S，1∶1 000）、鼠抗人波形蛋白（vimentin）（49636S，1∶1 000）、兔抗人磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（phosphorylated extracellular signal-regulated protein kinase，p-ERK）1/2（4370S，1∶2 000）、鼠抗人ERK1/2（4696S，1∶2 000）、兔抗人E盒結(jié)合鋅指蛋白1（zinc finger E-box-binding homeobox 1，ZEB1）（3396S，1∶1 000）、兔抗人β-連環(huán)蛋白（β-catenin）（8480T，1∶1 000）、鼠抗人鋅指轉(zhuǎn)錄因子（Snail）（3895S，1∶1 000）和兔抗人β-actin（4970S，1∶1 000）抗體均購自美國CST公司，HRP標(biāo)記羊抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）（ab6728，1∶8 000）、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG（ab6721，1∶10 000）；鼠抗E-cadherin（ab1416，1∶50）、兔抗vimentin（ab92547，1∶500）、羊抗兔IgG熒光二抗（ab150077，1∶800）和羊抗鼠IgG熒光二抗（ab150117，1∶800）均購自英國Abcam公司；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染料購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

使用實驗室內(nèi)已構(gòu)建好的穩(wěn)定過表達(dá)STC1的細(xì)胞系HLEC-STC1及其對照細(xì)胞系HLECEV，STC1沉默的A549細(xì)胞系A(chǔ)549-STC1 siRNA及對照細(xì)胞系A(chǔ)549-EV。細(xì)胞系的選擇和構(gòu)建過程詳見本課題組前期已發(fā)表的文獻(xiàn)［6］，采用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 Transwell侵襲實驗

將50 mg/L的Matrigel按1∶8比例稀釋，包被transwell小室底部膜的上室面37 ℃ 30 min形成凝膠，使用前加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃溫育1 h進(jìn)行基底膜水化，吸棄培養(yǎng)基。將細(xì)胞稀釋至2×105個/mL后接種200 μL細(xì)胞懸液到transwell小室中，24孔板下室中加入750 μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，每組設(shè)置3個重復(fù)孔。將孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，小心擦凈上室未侵襲細(xì)胞及Matrigel，4%甲醛溶液固定，0.5%結(jié)晶紫染色后，于顯微鏡下隨機(jī)選取3個不同的視野進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，取平均值，以侵襲細(xì)胞數(shù)量反映侵襲能力。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實驗

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以105個/mL的密度接種到6孔板中，待細(xì)胞覆蓋率達(dá)到90%時，用移液器吸嘴均勻劃痕，磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）沖洗劃下的細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)，在0、24、48 h觀察并拍照記錄。使用Image J軟件測量細(xì)胞劃痕面積，劃痕愈合率=［1-（各時間點劃痕面積/起始劃痕面積）］×100%。愈合率越高表明細(xì)胞遷移能力越強(qiáng)。

1.2.4 RTFQ-PCR檢測mRNA水平

TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA；以β-actin為內(nèi)參基因，使用SYBR Green PCR試劑盒在ABI7500上進(jìn)行RTFQ-PCR，擴(kuò)增程序：95 ℃ 10 min，（95 ℃15 s，60 ℃ 45 s）×40，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。ZEB1上游引物序列：5’-GCTGTAAGTGCCATTTCTC-3’，ZEB1下游引物序列：5’-GTCCCAGTGTTTCAGTTTC-3’，產(chǎn)物長度159bp；E-cadherin上游引物序列：5’-GAGAACGCATTGCCACATACAC-3’，E-cadherin下游引物序列：5’-AAGAGCACCTTCCATGACAGAC-3’，產(chǎn)物長度164bp；N-cadherin上游引物序列：5’-CATCATCCTGCTTATCCTTG-3’，N-cadherin下游引物序列：5’-AAGTCATAGTCCTGGTCTTC-3’，產(chǎn)物長度165bp；Vimentin上游引物序列：5’-GCGTGAAATGGAAGAGAAC-3’，vimentin下游引物序列：5’-TGGAAGAGGCAGAGAAATC-3’，產(chǎn)物長度217bp；EpCAM上游引物序列：5’-GAAGGCTGAGATAAAGGAGATGGG-3’，EpCAM下游引物序列：5’-AGATGTCTTCGTCCCACGC-3’，產(chǎn)物長度135bp；Snail1上游引物序列：5’-TCGCTGCCAATGCTCATC-3’，Snail1下游引物序列：5’-CCTTTCCCACTGTCCTCATC-3’，產(chǎn)物長度134bp；β-actin上游引物序列：5’-CATCGTCCACCGCAAATGCTTC-3’，β-actin下游引物序列：5’-AACCGACTGCTGTCACCTTCAC-3’，產(chǎn)物長度201bp。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測蛋白表達(dá)水平

收集細(xì)胞，PBS洗滌后加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，取約25 μg蛋白加入上樣緩沖液，煮沸5 min變性，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。將膜浸泡在5%的脫脂奶粉中封閉1 h后，一抗4 ℃溫育過夜。使用洗膜緩沖液（tris-buffered saline Tween，TBST）洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的二抗于37 ℃溫育1 h后，再次用TBST洗膜3次，加入配制好的電化學(xué)發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）底物工作液后置于成像系統(tǒng)中采集信號圖像，使用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.2.6 細(xì)胞免疫熒光實驗

細(xì)胞爬片用4%甲醛溶液固定30 min；PBS沖洗后滴加一抗，濕盒中4 ℃溫育過夜；PBS沖洗后，加入熒光二抗?jié)窈惺覝販赜? h；防淬滅封片劑與DAPI 1∶500稀釋封片后，使用熒光顯微鏡拍照分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 HLEC-STC1細(xì)胞系和A549-STC1 siRNA細(xì)胞系中STC1過表達(dá)和沉默效率驗證

Western blot結(jié)果見圖1，使用Image J軟件分析，結(jié)果顯示，HLEC-STC1中STC1水平顯著高于其對照細(xì)胞系HLEC-EV和HLEC細(xì)胞，HLEC-STC1中STC1水平約為HLEC-EV的4.01倍（P＜0.05）。沉默的A549細(xì)胞系A(chǔ)549-STC1 siRNA中STC1水平顯著低于對照細(xì)胞系A(chǔ)549-EV和A549細(xì)胞，較A549-EV下降約56.3%（P＜0.05）。

2.2 STC1促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移

Transwell侵襲實驗結(jié)果見圖2，STC1過表達(dá)的HLEC-STC1細(xì)胞侵襲數(shù)量較空載體對照細(xì)胞HLEC-EV明顯增加（473±17vs646±12，P＜0.05），STC1沉默的A549-STC1 siRNA細(xì)胞侵襲較空載體對照細(xì)胞A549-EV明顯減少（702±11vs502±18，P＜0.05）。細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果見圖3，HLEC-STC1細(xì)胞劃痕愈合率顯著高于空載體對照細(xì)胞HLEC-EV［（38.4±1.9）%vs（18.4±6.8）%，P＜0.05］，A549-STC1 siRNA細(xì)胞劃痕愈合率顯著低于空載體對照細(xì)胞A549-EV［（7.8±4.2）%vs（41.4±4.7）%，P＜0.05］。

圖1 Western blot實驗檢測HLEC、HLEC-EV、HLEC-STC1、A549、A549-EV和A549-STC1 siRNA細(xì)胞系中STC1蛋白表達(dá)水平Fig.1 Protein levels of STC1 in HLEC,HLEC-EV,HLEC-STC1,A549,A549-EV and A549-STC1 siRNA cell lines were examined by Western blot analysis

圖2 Transwell實驗檢測HLEC-STC1和A549-STC1siRNA細(xì)胞系的侵襲能力Fig.2 STC1-overexpressed HLEC cells,STC1-silenced A549 cells and their respective control cells were examined by transwell invasion assay

圖3 細(xì)胞劃痕實驗檢測HLEC-STC1和A549-STC1siRNA細(xì)胞系的遷移能力Fig.3 The migration potentials of STC1-overexpressed HLEC cells,STC1-silenced A549 cells and their respective control cells were examined by wound healing assay

2.3 STC1促進(jìn)肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT

RTFQ-PCR檢測結(jié)果見圖4A，與空載體對照細(xì)胞相比，過表達(dá)STC1的HLEC-STC1細(xì)胞中上皮樣細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)水平下調(diào)，間質(zhì)樣細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin和vimentin表達(dá)上調(diào)，EpCAM表達(dá)下調(diào)；STC1細(xì)胞沉默的A549-STC1 siRNA細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)水平上調(diào)，N-cadherin、vimentin及EpCAM表達(dá)水平下調(diào)。Western blot結(jié)果見圖4B，EMT相關(guān)基因的蛋白水平變化與RTFQ-PCR檢測結(jié)果變化一致。進(jìn)一步使用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測A549-STC1 siRNA細(xì)胞及其對照細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白的變化，STC1沉默的肺癌細(xì)胞A549-STC1 siRNA中，E-cadherin含量升高，vimentin含量下降（圖5），表明SCT1沉默抑制EMT過程。

圖4 HLEC-STC1和A549-STC1 siRNA細(xì)胞及其對照細(xì)胞中EMT相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的變化Fig.4 Relative expressions of EMT-related genes in STC1-overexpressed HLEC cells,STC1-silenced A549 cells and their respective control cells

圖5 細(xì)胞免疫熒光檢測A549-STC1siRNA細(xì)胞系及其對照細(xì)胞系中E-cadherin和vimentin的蛋白水平，使用DAPI進(jìn)行核染Fig.5 E-cadherin and vimentin levels in STC1-silenced A549 cells and control A549 cells were analyzed by confocal microscopy,nuclei were stained with DAPI

2.4 STC1影響EMT相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和轉(zhuǎn)錄因子

RTFQ-PCR檢測結(jié)果見圖6A，HLEC-STC1中EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail1和ZEB1的表達(dá)水平上調(diào)，A549-STC1 siRNA中Snail1和ZEB1的表達(dá)水平下調(diào)。Western blot結(jié)果見圖6B，HLECSTC1細(xì)胞相較于HLEC-EV對照細(xì)胞，p-ERK1/2和β-catenin水平升高，同時EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail1和ZEB1的表達(dá)水平也明顯升高，而A549-STC1 siRNA中p-ERK1/2、β-catenin、Snail1和ZEB1的表達(dá)水平則明顯下降。

圖6 RTFQ-PCR及Western blot檢測HLEC-STC1和A549-STC1 siRNA細(xì)胞系及其對照細(xì)胞系中p-ERK1/2、ERK1/2、β-catenin、ZEB1、Snail1及STC1的表達(dá)水平Fig.6 The mRNA and protein levels of p-ERK1/2,ERK1/2,β-catenin,ZEB1,Snail1 and STC1 were examined by RTFQ-PCR and Western blot in STC1-overexpressed HLEC cells,STC1-silenced A549 cells and their respective control cells

3 討 論

轉(zhuǎn)移是肺癌相關(guān)死亡的主要原因，EMT被認(rèn)為在腫瘤轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用［8-9］。腫瘤細(xì)胞的EMT信號激活可增強(qiáng)細(xì)胞侵襲、遷移和抗凋亡能力，改變腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)其轉(zhuǎn)移至其他器官［10-11］。在EMT過程中，細(xì)胞中EMT相關(guān)的上皮標(biāo)志物E-cadherin等表達(dá)水平降低，而間質(zhì)標(biāo)志物如N-cadherin和vimentin的表達(dá)水平上調(diào)，導(dǎo)致上皮細(xì)胞逐漸失去極性，細(xì)胞間的黏附連接被破壞，最終轉(zhuǎn)化為具有間充質(zhì)表型的細(xì)胞［12］。細(xì)胞發(fā)生EMT需要外源性或內(nèi)源性的誘因，外源性的誘因包括吸煙、乏氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-beta，TGF-β）等，內(nèi)源性的誘因包括某些基因突變或過表達(dá)［13］。

STC1是一種旁分泌蛋白，其在癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，與腫瘤的生長和癌癥轉(zhuǎn)移有關(guān)［14-15］。本研究發(fā)現(xiàn)，STC1可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移；同時，STC1可抑制肺癌細(xì)胞E-cadherin等上皮標(biāo)志物的表達(dá)，提高N-cadherin、vimentin等間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)水平，提示STC1可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT；此外，STC1還能夠促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物EpCAM地表達(dá)，已有研究［16-17］報道，腫瘤中EpCAM表達(dá)與vimentin和N-cadherin的表達(dá)呈正相關(guān)，還可通過破壞E-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞間黏附性下降，誘發(fā)EMT。因此，我們推測STC1可能是EMT的一種誘因，通過誘導(dǎo)EMT而促進(jìn)肺癌細(xì)胞發(fā)生侵襲和遷移。

對于STC1如何作用于肺癌細(xì)胞誘導(dǎo)發(fā)生EMT，其內(nèi)在機(jī)制目前尚未完全闡明。EMT是一個涉及許多信號通路和多種轉(zhuǎn)錄因子的動態(tài)復(fù)雜的過程［18-19］。本研究發(fā)現(xiàn)，STC1能夠提高肺癌細(xì)胞中p-ERK1/2、β-catenin水平，促進(jìn)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail1和ZEB1蛋白水平的升高；STC1水平的下調(diào)則抑制p-ERK1/2、β-catenin水平，并且Snail1和ZEB1蛋白水平下調(diào)。有研究［20］發(fā)現(xiàn)，肺癌骨轉(zhuǎn)移過程中，Wnt/β-catenin信號通路激活，上調(diào)Snail1和ZEB1，下調(diào)E-cadherin，誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。Chiu等［21］等研究發(fā)現(xiàn)，肺癌細(xì)胞A549中p-ERK1/2水平升高可上調(diào)ZEB1，而ZEB1又下調(diào)E-cadherin并上調(diào)纖連蛋白，誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。據(jù)此，我們猜測STC1能夠激活肺癌細(xì)胞的ERK和Wnt/β-catenin信號通路，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Snail1和ZEB1的表達(dá)，而轉(zhuǎn)錄因子Snail1和ZEB1作為E-cadherin的重要阻遏蛋白直接抑制E-cadherin基因的表達(dá)，誘導(dǎo)vimentin基因的表達(dá)，從而促進(jìn)EMT的發(fā)生。

綜上，本研究初步闡明了STC1促進(jìn)肺癌細(xì)胞EMT的分子機(jī)制。STC1可能通過激活ERK和Wnt/β-catenin信號通路，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子ZEB1和Snail1的表達(dá)水平，從而誘導(dǎo)EMT促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移。