李文鵬，陶 冶，趙素雅，牛秋紅

(南陽師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南 南陽 473061)

棉花是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，全國播種面積約333.3萬hm2，年產(chǎn)量500多萬t，經(jīng)濟(jì)總值近400億元[1]。近年來，棉花黃萎病(Verticilliumwilt)在我國三大產(chǎn)棉區(qū)呈發(fā)展態(tài)勢，全國棉田黃萎病流行約200萬hm2，導(dǎo)致棉田常年減產(chǎn)15%～20%，造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)十億元，嚴(yán)重危及我國棉花產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2-4]。

棉花黃萎病為土傳性維管束型病害，其致病菌為大麗輪枝菌(VerticillumdahliaeKleb)，具有分布廣、危害重、傳播途徑廣泛的特點(diǎn)。大麗輪枝菌在土壤中通過根系損傷部位侵入棉花[5]，引起棉花葉片黃化枯萎、維管束褐化、蕾鈴脫落，甚至整株死亡，嚴(yán)重影響棉花的纖維品質(zhì)和產(chǎn)量[6]。目前，生產(chǎn)上主要通過種植抗(耐)病品種、調(diào)控土壤微生物群落結(jié)構(gòu)等途徑防控棉花黃萎病。

國內(nèi)外防治棉花黃萎病的主要方法有抗性育種、農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治、生物防治技術(shù)等。近年來，我國棉花抗黃萎病新品種的選育取得一定進(jìn)展，但西北內(nèi)陸棉區(qū)的多數(shù)品種仍表現(xiàn)為低耐或感病水平，不能滿足生產(chǎn)需求[7]。在實(shí)際生產(chǎn)中，由于糧棉爭地、耗時費(fèi)力等因素，輪作倒茬很難實(shí)施?；瘜W(xué)防治方面，傳統(tǒng)農(nóng)藥溴甲烷等因其對生態(tài)環(huán)境和人類健康產(chǎn)生威脅，已經(jīng)被逐漸淘汰，而新的化學(xué)農(nóng)藥防治譜不足，且對環(huán)境仍然存在潛在的不良影響[8]，棉花黃萎病的防控任重而道遠(yuǎn)。生物防治主要是通過部分微生物及微生物代謝產(chǎn)物的作用，對農(nóng)作物病蟲害進(jìn)行防治的技術(shù)和方法[9-10]，因其具有持續(xù)時間長、安全、殘留少等優(yōu)勢，越來越受到人們的重視，被公認(rèn)為是最具發(fā)展?jié)摿Φ姆乐畏椒╗11]。近年來，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，部分芽孢桿菌、放線菌和真菌對植物病原菌具有較好的拮抗作用[12-15]。但生物防治存在生防制劑效果不穩(wěn)定的短板，由于不同地區(qū)的微生物種群不同，生防菌株能否在土壤中或者植株內(nèi)很好地定殖是其發(fā)揮抗病作用的前提[16-17]。劉海洋等[18]從土壤中篩選出1株芽孢桿菌AL7，發(fā)現(xiàn)其不但對大麗輪枝菌有較好的抑制效果，而且在土壤中也有較強(qiáng)的定殖能力，其極強(qiáng)的定殖和殺菌能力，為該生防菌的普及提供更大的可能性。李社增等[19]研發(fā)的枯草芽孢桿菌NCD-2，對黃萎病的防效超過50%。該菌株已被開發(fā)為防治棉花黃萎病的微生物農(nóng)藥。

我國棉花栽培品種以陸地棉為主，雖然其產(chǎn)量可觀但其抗黃萎病能力較差，而海島棉黃萎病抗性突出而持久[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)，根際微生物以及內(nèi)生菌也參與了棉花對黃萎病的抵抗[22-23]。目前，對棉花根際黃萎病菌拮抗菌的研究多集中在菌種篩選和防效測定方面，對其拮抗機(jī)制以及相應(yīng)基因、蛋白質(zhì)資源挖掘的研究較少。鑒于此，以黃萎病抗性棉(海島棉，海7124)根部土壤為材料篩選黃萎病拮抗菌株，并利用盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證其生防效果。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步深入挖掘拮抗菌株對黃萎病菌的拮抗機(jī)制，分離出其主要的毒力蛋白并對其抗菌性能進(jìn)行檢測，為生防菌防治棉花黃萎病提供理論支持和基因資源，并為下一步開發(fā)棉花黃萎病生防工程菌株奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試大麗輪枝菌V991，由河南大學(xué)植物逆境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室蔡應(yīng)繁教授惠贈。供試棉花品種為感病棉品種TM-1。供試土樣采自南陽師范學(xué)院西區(qū)黃萎病抗性棉品種海7124棉田。

1.2 方法

1.2.1 土樣采集與土壤拮抗菌株的分離 采集黃萎病抗性棉(海7124)根系土壤，自然風(fēng)干，土壤微生物的分離采用梯度稀釋法[24]，稱取5 g土樣置于裝有50 mL無菌水的三角瓶中，37 ℃、220 r/min搖瓶培養(yǎng)48 h，混合液置于80 ℃恒溫水浴鍋中加熱10 min[25]，取1 mL混合液依次稀釋，分別取10-4、10-5、10-6、10-7共4個梯度的稀釋液100 μL涂布LB平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，挑取形態(tài)、大小、色澤不同的單菌落，經(jīng)多次劃線純化后編號，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 拮抗細(xì)菌的篩選 采用傳統(tǒng)的對峙培養(yǎng)法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)[26]，在PDA培養(yǎng)基平板中央接種大麗輪枝菌，25 ℃倒置培養(yǎng)3 d備用。待測菌株37 ℃、220 r/min搖瓶培養(yǎng)12 h，取100 μL菌液均勻涂布LB平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，用直徑1 cm的打孔器打出細(xì)菌菌餅，在接種大麗輪枝菌PDA平板兩側(cè)對稱放置，25 ℃恒溫對峙培養(yǎng)10 d，測量抑菌直徑，設(shè)置3個平行試驗(yàn)，并按照下列公式計(jì)算抑菌率[27]。抑菌率=(對照組真菌菌落生長直徑-處理組真菌菌落生長直徑)/對照組真菌菌落生長直徑×100%。

1.2.3 拮抗菌株的鑒定 將篩選得到的拮抗菌株劃線轉(zhuǎn)接于LB平板中，觀察菌落形態(tài)，利用掃描電子顯微鏡觀察其單細(xì)胞形態(tài)。用AxyPrep細(xì)菌基因組DNA小量試劑盒提取菌株的基因組DNA，并以通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′對其16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[28]。將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T(TaKaRa公司)克隆載體連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，篩選陽性轉(zhuǎn)化子測序(北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。將得到的基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，結(jié)合序列相似性比對結(jié)果對拮抗細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定。

1.2.4 拮抗菌株對盆栽棉花黃萎病的防效測定 接種篩選得到拮抗菌株于LB液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)活化過夜，按1%的比例轉(zhuǎn)接于150 mL LB中，37 ℃、220 r/min搖瓶培養(yǎng)48 h。8 000 r/min常溫離心20 min收集菌體，無菌水重懸菌體，調(diào)節(jié)至1.0×107cfu/mL。按每100 g土壤加10 mL菌液的比例配制試驗(yàn)用土樣，分別在接菌處理(試驗(yàn)組)和未接菌處理(對照組)的土壤中播種經(jīng)消毒處理的感病棉種子。待棉花兩片子葉完全展開后，通過灌根的方式向試驗(yàn)組每盆澆灌10 mL菌液，對照組澆灌10 mL無菌水。待棉花長至二葉一心后，傷根接種大麗輪枝菌，繼續(xù)培養(yǎng)并觀察棉花的發(fā)病情況。按以下分級標(biāo)準(zhǔn)記錄黃萎病的發(fā)病級別，0級：健康植株；1級：1片以下或部分子葉變黃或壞死發(fā)?。?級：2片子葉變黃或壞死；3級：1片真葉變黃或壞死的現(xiàn)象；4級：2片或2片以上真葉變黃或壞死，并按照下列公式計(jì)算病情指數(shù)和防治效果[29]。

病情指數(shù)=∑(級值×株數(shù))/(最高級值×總株數(shù))×100；

防治效果=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100%。

數(shù)據(jù)分析使用SPSS 22.0軟件。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有顯著水平定為P<0.05，所有結(jié)果為3次獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。

1.2.5 拮抗菌株發(fā)酵濾液對大麗輪枝菌孢子萌發(fā)的影響 收集拮抗菌株的發(fā)酵上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾制成無菌發(fā)酵濾液備用。取3 mL無菌發(fā)酵濾液與3 mL 1.0×106～1.0×107cfu/mL的大麗輪枝菌孢子懸液混合均勻(試驗(yàn)組)，另取3 mL LB液體培養(yǎng)基與3 mL 1.0×106～1.0×107cfu/mL的大麗輪枝菌孢子懸液混合均勻(對照組)，25 ℃、180 r/min振蕩混合培養(yǎng)12 h，設(shè)置3個平行試驗(yàn)，鏡檢觀察大麗輪枝菌孢子萌發(fā)及菌絲生長情況[30]，計(jì)算孢子萌發(fā)率。

孢子萌發(fā)率=萌發(fā)孢子數(shù)/總孢子數(shù)×100%。

1.2.6 拮抗菌胞外代謝產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性檢測 取拮抗菌株無菌發(fā)酵濾液各1 mL置于2支1.5 mL的EP管中，1支置于100 ℃水浴鍋中加熱10 min，另1支置于25 ℃水浴鍋中加熱10 min備用。制備1.0×106～1.0×107cfu/mL的大麗輪枝菌孢子懸液，按5%的比例將孢子懸液加到PDA培養(yǎng)基中混合均勻，制備大麗輪枝菌孢子固體培養(yǎng)基平板，待平板完全冷卻凝固后，在距離培養(yǎng)基邊緣等距處打孔，每孔中分別加200 μL備用的2組無菌發(fā)酵濾液，并設(shè)置對照(CK，等量LB液體培養(yǎng)基)，25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，設(shè)置3個平行試驗(yàn)，觀察真菌孢子萌發(fā)的情況，并測量抑菌圈直徑。

1.2.7 胞外蛋白抑菌活性檢測及毒力蛋白的確定 收集500 mL拮抗菌株發(fā)酵上清液，設(shè)置300、500、700、900 g/L硫酸銨對拮抗菌株胞外蛋白進(jìn)行分級鹽析，溶解收集梯度鹽析粗蛋白溶液，將鹽析的粗蛋白溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后備用。另取200 μL 1.0×106～1.0×107cfu/mL大麗輪枝菌孢子懸液，均勻涂布于PDA平板中，在距離培養(yǎng)基邊緣等距處打孔，每孔中分別加100 μL備用粗蛋白濾液，25 ℃恒溫共培養(yǎng)5 d，觀察大麗輪枝菌孢子萌發(fā)情況，并對不同梯度鹽析蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳檢測，將潛在的活性蛋白切膠，送至上海顥澤生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行質(zhì)譜鑒定、比對分析，確定毒力蛋白的種類。

1.2.8 毒力蛋白的基因克隆 采用AxyPrep細(xì)菌基因組DNA小量試劑盒提取拮抗菌株的基因組DNA。從GenBank數(shù)據(jù)庫中調(diào)取與拮抗菌株同源性較高已有細(xì)菌的毒力蛋白(經(jīng)1.2.7確定)基因序列，根據(jù)基因序列的保守區(qū)用DNAMAN嘗試設(shè)計(jì)引物，對拮抗菌株毒力蛋白基因進(jìn)行擴(kuò)增。其上游引物P1∶5′-ATGTTTTATCGTATGAAACG-3′,下游引物P2∶5′-TTTTTTTGTATAGCGCACCC-3′。反應(yīng)體系30 μL：基因組1 μL、上下游引物各1 μL、2×Taqplus Master Mix 15 μL、去離子水12 μL。PCR擴(kuò)增條件：97 ℃預(yù)變性5 min，97 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)。將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T(TaKaRa公司)克隆載體連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，篩選陽性克隆提取質(zhì)粒并進(jìn)行測序。用含有酶切位點(diǎn)BamHⅠ和HindⅢ的上下游引物對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒。

1.2.9 毒力蛋白的表達(dá)、純化及抗菌活性測試 用內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ對重組克隆質(zhì)粒和pET-32a(+)質(zhì)粒雙酶切，并構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒PET-β，轉(zhuǎn)化宿主菌E.coliBL21，探索最佳的IPTG誘導(dǎo)條件。8 000 r/min常溫離心20 min，收集表達(dá)后菌體，進(jìn)行超聲波破碎，破碎上清進(jìn)行Ni-NTA介質(zhì)金屬螯合親和層析，對目標(biāo)蛋白梯度洗脫，洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。收集重組毒力蛋白探究其抗菌活性，將重組毒力蛋白與大麗輪枝菌孢子懸液混合培養(yǎng)，探究重組毒力蛋白對孢子萌發(fā)的影響，利用平板對峙試驗(yàn)研究重組毒力蛋白對大麗輪枝菌菌絲生長的影響。并以昆布多糖為底物，采用DNS法對重組毒力蛋白活性進(jìn)行測定，以每分鐘反應(yīng)生成相當(dāng)于1 μg葡萄糖的量為1個酶活單位(U,QB 2583—2003)。

酶活力(U/mL)=葡萄糖生成量(mg)×1 000/時間(min)×酶液加入量(mL)。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的分離及篩選

利用稀釋涂布平板法分離得到56株待測菌株，采用對峙平板法對得到的56株待測菌株進(jìn)行抗菌活性檢測，其中，編號為HT-7的菌株對大麗輪枝菌菌絲生長的抑制效果較為顯著，抑菌率高達(dá)56%(圖1)，故對其進(jìn)行更深一步的研究。

圖1 菌株HT-7對大麗輪枝菌的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of strain HT-7 against V.dahlia

2.2 拮抗菌株的分類鑒定

經(jīng)革蘭氏染色確定菌株HT-7為革蘭氏陽性菌，菌落形態(tài)呈圓形凸起，表面光滑濕潤，掃描電子顯微鏡觀察其單細(xì)胞形態(tài)為無鞭毛的桿狀細(xì)菌，細(xì)胞大小為(1.2～2.0)μm×(0.5～0.7)μm(圖2)。對其16S rDNA序列同GenBank數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，菌株HT-7與BacillusvanilleaXY18T的同源性高達(dá)到99.86%，初步鑒定其為芽孢桿菌屬。

圖2 菌株HT-7的細(xì)胞形態(tài)

2.3 菌株HT-7對盆栽棉花黃萎病的防效

未經(jīng)菌株HT-7處理的對照組棉花，傷根接種大麗輪枝菌2周后出現(xiàn)典型的棉花黃萎病發(fā)病性狀，葉片泛黃、葉片邊緣出現(xiàn)燒焦?fàn)罡煽?，植株萎蔫，部分葉片用手輕觸即掉落。經(jīng)拮抗菌株HT-7處理后的試驗(yàn)組棉花在傷根接種大麗輪枝菌2周后長勢較好，未出現(xiàn)染病現(xiàn)象。4周后，對照組棉花出現(xiàn)大量死亡的現(xiàn)象，部分棉花植株葉片全部脫落，而試驗(yàn)組棉花僅有少部分出現(xiàn)葉片脫落的現(xiàn)象。采集部分試驗(yàn)組正常棉花的葉片觀察，未發(fā)現(xiàn)葉柄變黑的發(fā)病癥狀(圖3)。

圖3 拮抗菌株HT-7 對棉花黃萎病的拮抗效果(傷根接種4周后)

分別對試驗(yàn)組和對照組棉花的發(fā)病情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表1)，經(jīng)菌株HT-7處理的棉花傷根接種大麗輪枝菌后發(fā)病率和病情指數(shù)顯著低于對照組，其發(fā)病率降低58.33%，病情指數(shù)降低82.64%，防治效果高達(dá)82.58%。結(jié)果表明，拮抗菌株HT-7能有效防治大麗輪枝菌對棉花的侵害。

表1 拮抗菌株HT-7對棉花黃萎病的拮抗效果

2.4 菌株HT-7發(fā)酵濾液對大麗輪枝菌孢子萌發(fā)的影響

將菌株HT-7的無菌發(fā)酵濾液與大麗輪枝菌孢子混合培養(yǎng)12 h后鏡檢觀察，經(jīng)菌株HT-7處理的試驗(yàn)組大麗輪枝菌孢子短粗膨大，且有聚集現(xiàn)象，大部分孢子無法正常萌發(fā)，菌絲較少。未經(jīng)菌株HT-7處理的對照組大麗輪枝菌孢子萌發(fā)正常，菌絲生長旺盛(圖4)。

統(tǒng)計(jì)大麗輪枝菌孢子萌發(fā)情況，結(jié)果表明，與HT-7無菌發(fā)酵濾液混合培養(yǎng)的大麗輪枝菌孢子(試驗(yàn)組)不能正常萌發(fā)，萌發(fā)率僅為12.1%，遠(yuǎn)低于對照組(37.9%)，表明菌株HT-7發(fā)酵濾液對大麗輪枝菌孢子萌發(fā)有明顯的抑制作用。

圖4 液體環(huán)境中HT-7對大麗輪枝菌孢子及菌絲的影響

2.5 菌株HT-7拮抗因子熱穩(wěn)定性檢測

對分別經(jīng)100 ℃、25 ℃水浴加熱10 min的菌株HT-7發(fā)酵濾液進(jìn)行抗菌活性檢測，平板共培養(yǎng)5 d后觀察發(fā)現(xiàn)，25 ℃水浴加熱10 min的發(fā)酵濾液對大麗輪枝菌孢子萌發(fā)有較強(qiáng)的抑制作用，在平板中產(chǎn)生明顯的抑菌圈，其抑菌圈直徑達(dá)18 mm，而100 ℃水浴加熱10 min后的發(fā)酵濾液喪失抑菌能力，在平板中未出現(xiàn)透明圈(圖5)，證明菌株HT-7的主要毒力因子為熱不穩(wěn)定性物質(zhì)。

圖5 HT-7胞外產(chǎn)物對大麗輪枝菌孢子萌發(fā)的影響

2.6 胞外蛋白的抑菌活性檢測及毒力蛋白的確定

對不同質(zhì)量濃度硫酸銨鹽析沉淀的蛋白質(zhì)進(jìn)行抗菌活性檢測，發(fā)現(xiàn)4個質(zhì)量濃度硫酸銨鹽析沉淀的蛋白質(zhì)均有抗菌活性，其中500 g/L和700 g/L硫酸銨鹽析蛋白質(zhì)抑菌效果最佳(圖6a)。將各質(zhì)量濃度下鹽析出的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(圖6b)，對毒力蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，初步判定其為β-1,3-1,4-葡聚糖酶。

a.不同質(zhì)量濃度硫酸銨鹽析蛋白質(zhì)的抑菌結(jié)果；b.鹽析蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳結(jié)果，其中M為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量 Marker，1、2、3、4分別表示300、500、700、900 g/L硫酸銨鹽析獲得的蛋白質(zhì)條帶a.Bacteriostatic test results of protein obtained by gradient precipitation of ammonium sulfate;b.SDS-APGE results of protein obtained by gradient procipitation of ammonium sulfate,M means protein molecular weight marker,1—4 indicate protein solution obtained by gradient precipitation of 300,500,700,900 g/L ammonium sulfate respectively

2.7 菌株HT-7毒力蛋白β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆

根據(jù)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的基因序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增得到β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(圖7)，產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測定，結(jié)果顯示，該基因片段全長大小732 bp，編碼243個氨基酸。將該毒力蛋白氨基酸序列遞交至NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，該氨基酸序列與B.velezensis的糖基水解酶家族蛋白質(zhì)氨基酸序列(WP-038460387)同源性為99.59%，與B.amyloliq-uefaciens的β-1,3-1,4-葡聚糖酶(AAO43052)同源性為97.94%，說明從菌株HT-7中成功擴(kuò)增得到毒力因子β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因。

M：Marker 5000；1—3：β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因

2.8 菌株HT-7毒力蛋白的表達(dá)、純化及活性檢測

用內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ對構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-β進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠電泳結(jié)果在5 000 bp和750 bp處各出現(xiàn)1條單一明亮條帶(圖8)，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主E.coliBL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

M：Marker 5000；1—5：質(zhì)粒pET-β的雙酶切結(jié)果

通過探索，確定轉(zhuǎn)化后的宿主E.coliBL21在0.4 mmol/L IPTG條件下30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h效果最佳。超聲波破碎宿主菌細(xì)胞，上清進(jìn)行Ni-NTA介質(zhì)金屬螯合親和層析并進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，在200 μmol/L咪唑下洗脫得到1條單一蛋白質(zhì)條帶(圖9a)。在重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶的平板抑菌試驗(yàn)中，重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶有效抑制大麗輪枝菌菌絲的延伸，導(dǎo)致其無法正常生長，通過測量，抑菌率達(dá)25%(圖9b)。

a.重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶SDS-GAGE電泳結(jié)果,其中，M為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量Marber,1表示重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶；b.重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶抑菌檢測結(jié)果a.SDS-PAGE results of recombinant β-1,3-1,4-glucanase,M means protein molecular weight marker,1 indicates recombinant β-1,3-1,4-glucanase;b.Bacteriostatic test result of recombinant β-1,3-1,4-glucanase

由圖10可見，重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶對大麗輪枝菌孢子萌發(fā)具有顯著的抑制效果，未經(jīng)重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶處理的對照組孢子萌發(fā)正常且菌絲生長旺盛，重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶處理的試驗(yàn)組孢子萌發(fā)受到顯著抑制，大部分孢子無法正常萌發(fā)，部分孢子出現(xiàn)孢壁破裂的現(xiàn)象?？梢?，β-1,3-1,4-葡聚糖酶是菌株HT-7發(fā)揮生防作用的重要毒力因子，由DNS法測得純化后的重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶活高達(dá)23.5 U/mL。

圖10 重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶對大麗輪枝菌孢子萌發(fā)的影響

3 結(jié)論與討論

棉花黃萎病是典型的土傳維管束病害，病原菌大麗輪枝菌寄宿植物種類繁多[31]，微菌核抗逆性強(qiáng)，能在土壤中長時間存活，輪作和倒茬很難降低土壤中微菌核的數(shù)量；再加上大麗輪枝菌的致病能力強(qiáng)、變異性大，一般的抗病棉品種又難以獲得，故很難通過物理手段來防治黃萎病[32]?；瘜W(xué)農(nóng)藥對減輕黃萎病對棉花的危害雖然有一定的效果，但帶來的環(huán)境問題也日益嚴(yán)重。近年來，以生物防治為主的綜合防治措施逐漸受到人們的重視，該方法具有綠色環(huán)保、不易產(chǎn)生抗性、發(fā)展?jié)摿Υ蟮葍?yōu)勢，在黃萎病的防治中具有非常重要的意義[33]。其利用生防菌株的競爭作用、拮抗作用和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性等機(jī)制發(fā)揮生物防治效果，是防治棉花黃萎病的重要途徑之一。

芽孢桿菌因具有耐受能力強(qiáng)、繁殖速度快、分布范圍廣等多方面優(yōu)點(diǎn)，成為防治棉花黃萎病的重要生防菌。目前發(fā)現(xiàn)多種芽孢桿菌對棉花黃萎病具有拮抗效果，金利容等[34]從棉花植株內(nèi)分離篩選出了對棉花黃萎病具有拮抗作用的惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)；翟楓[35]從棉花土壤中篩選得到的解淀粉芽孢桿菌對棉花有一定的促生作用；文雨婷等[36]從土壤中篩選得到多株酵母菌對棉花黃萎病具有拮抗作用。隨著研究的不斷深入，拮抗芽孢桿菌的部分毒力因子也不斷被發(fā)掘出來，如徐婷等[37]成功地從貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)中分離到抑制大麗輪枝菌的毒力因子。宗英等[38]在1株貝萊斯芽孢桿菌抑制禾谷鐮刀菌的研究中發(fā)現(xiàn)，其揮發(fā)性物質(zhì)對病原真菌有一定的拮抗作用。袁洪水等[39]從分離的拮抗菌株中均純化得到對大麗輪枝菌孢子萌發(fā)和菌絲生長都有較好抑制作用的毒力蛋白。此外，胡明[40]利用硫酸銨鹽析的方法成功地從棉花黃萎病拮抗細(xì)菌BDT-25的發(fā)酵液中分離純化出抗菌多肽類物質(zhì)，此抗菌多肽能明顯抑制大麗輪枝菌的菌絲生長及孢子萌發(fā)。

由于不同地區(qū)的地理環(huán)境、氣候等差異，導(dǎo)致目前發(fā)現(xiàn)的黃萎病拮抗菌株未能大面積普及并投入應(yīng)用。本研究從黃萎病抗性棉(海7124)根系土壤中分離得到1株對棉花黃萎病具有良好防治效果的菌株Bacillussp.HT-7，豐富了棉花黃萎病拮抗菌株的資源。通過平板對峙試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)，均驗(yàn)證了其對大麗輪枝菌具有較強(qiáng)的拮抗性能；通過混合孢子試驗(yàn)、毒力因子的熱穩(wěn)定性檢測及抗菌蛋白活性跟蹤等試驗(yàn)，最終確定β-1,3-1,4-葡聚糖酶是菌株HT-7發(fā)揮拮抗性能的主要毒力因子，并在重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶抗菌試驗(yàn)中取得了不錯的抑菌效果，為棉花黃萎病的生物防治提供了理論依據(jù)。