劉生財(cái),李漢生,楊曦晨,賴鐘雄

(福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002)

龍眼(DimocarpuslonganLour.)又名桂圓，屬于無(wú)患子科(Sapindaceae)龍眼屬(Dimocarpus)，富含類黃酮等次生代謝物質(zhì)，具有重要的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[1-3]。類黃酮廣泛存在于植物體內(nèi)，如菊花[3]、大豆[4]、山楂葉[5]等，其合成受到多種因素的影響，如溫度、光照、傷害等，類黃酮的生物合成已經(jīng)成為植物次生代謝基因工程、代謝工程的主要目標(biāo)。表兒茶素是類黃酮化合物中重要一種類型，具有較強(qiáng)的抗氧化能力，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值更高[6-7]。

光是植物的生長(zhǎng)發(fā)育及次生代謝產(chǎn)物形成的重要影響因子[8-10]。在單色光處理中，藍(lán)光有利于銀杏葉片[9]、迷迭香[11]和龍眼胚性愈傷組織[12]中類黃酮含量的積累。紅光和藍(lán)光是植物吸收的主要光源，有利于促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的合成與累積，紅藍(lán)復(fù)合光更有利于次生代謝產(chǎn)物的累積，能夠改善茄皮品質(zhì)并促進(jìn)類黃酮合成[13]，提高韭菜類黃酮含量[14]。

植物體內(nèi)類黃酮的生物合成是一系列酶促反應(yīng)過(guò)程。查爾酮合成酶(CHS)是類黃酮物質(zhì)生物合成途徑的關(guān)鍵酶，介導(dǎo)黃酮類化合物合成的第1步[15-16]。無(wú)色花色素還原酶基因(LAR)是類黃酮生物合成途徑中下游的一個(gè)重要基因，LAR蛋白能夠催化兒茶素、無(wú)色花青素和相關(guān)的黃烷-3-羥基阿福豆素與沒(méi)食子兒茶素等植物聚合型原花青素或者濃縮單寧合成起始物質(zhì)的合成。研究已證實(shí)，CHS和LAR基因表達(dá)都受到光調(diào)控[17-18]。

HY5是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)促進(jìn)光形態(tài)建成的轉(zhuǎn)錄因子,它能編碼1個(gè)bZIP類型的轉(zhuǎn)錄因子[19]。AKIFUMI等[20]研究表明,葡萄HY5的表達(dá)受光誘導(dǎo)。冀曉昊等[21]研究發(fā)現(xiàn)，HY5不僅參與葡萄果樹(shù)發(fā)育進(jìn)程，還與花青苷的積累成正相關(guān)。HY5誘導(dǎo)擬南芥花青苷合成轉(zhuǎn)錄因子MYB75/PAP1[22]和葡萄VvMYBA1[21]的表達(dá)，調(diào)控花青苷合成途徑結(jié)構(gòu)基因表達(dá)，導(dǎo)致花青苷積累的差異。而且有研究發(fā)現(xiàn)，COP1可泛素化降解HY5進(jìn)而影響CHS轉(zhuǎn)錄[23-24]。光質(zhì)調(diào)控龍眼胚性愈傷組織類黃酮的研究雖有報(bào)道[12]，但紅藍(lán)復(fù)合光對(duì)龍眼胚性愈傷組織的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，探討不同紅藍(lán)復(fù)合光配比對(duì)龍眼胚性愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)及類黃酮代謝產(chǎn)物含量的影響，分析轉(zhuǎn)錄因子DlHY5及其與類黃酮結(jié)構(gòu)基因DlCHS、DlLAR之間的聯(lián)系，為揭示紅藍(lán)復(fù)合光調(diào)控龍眼胚性愈傷組織類黃酮代謝的機(jī)制提供線索。

1 材料和方法

1.1 植物材料和光照處理

龍眼胚性愈傷組織為福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所長(zhǎng)期繼代保存的紅核子龍眼胚性愈傷組織LC2細(xì)胞系[25]。取大小相一致的龍眼胚性愈傷組織接種于MS+2,4-D 1.0 mg/L培養(yǎng)基中。然后將相同接種量的龍眼胚性愈傷組織置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，設(shè)計(jì)9種紅藍(lán)復(fù)合光配比，分別為紅∶藍(lán)=1∶9、紅∶藍(lán)=2∶8、紅∶藍(lán)=3∶7、紅∶藍(lán)=4∶6、紅∶藍(lán)=5∶5、紅∶藍(lán)=6∶4、紅∶藍(lán)=7∶3、紅∶藍(lán)=8∶2、紅∶藍(lán)=9∶1。光照總強(qiáng)度為32 μmol/(m2·s)，光照時(shí)間為12 h/d，藍(lán)光中心波長(zhǎng)為457 nm，紅光中心波長(zhǎng)為660 nm。以黑暗條件作為對(duì)照。研究不同光照條件對(duì)龍眼胚性愈傷組織生長(zhǎng)的影響。通過(guò)倒置電子顯微鏡(Leica)進(jìn)行龍眼胚性愈傷組織細(xì)胞觀察。每個(gè)處理25瓶，處理周期為25 d。每個(gè)處理設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 胚性愈傷組織生長(zhǎng)率測(cè)定

取出龍眼胚性愈傷組織測(cè)定鮮質(zhì)量，計(jì)算其生長(zhǎng)率[26]，生長(zhǎng)率=(終鮮質(zhì)量-接種鮮質(zhì)量)/接種鮮質(zhì)量×100%。

1.3 類黃酮含量測(cè)定

黃類酮提取方法參照李琨等[27]的方法并適當(dāng)改良。將龍眼胚性愈傷組織進(jìn)行凍干處理2 d，天平稱取0.2 g材料，首先加入60%乙醇溶液10 mL，通過(guò)超聲波清洗器(KQ-200SPDE)提取1 h(60 ℃，功率300 W)，冷卻靜置20 min，再通過(guò)離心機(jī)(TGL-15B)離心10 min(8 000×g，20 ℃)。然后吸取5 mL上清液于新試管中，并稀釋至10 mL。最后取龍眼胚性愈傷組織提取液5 mL，精確加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻后放置6 min，加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻后放置 6 min，加入4 mL 20%氫氧化鈉溶液，加入10 mL 60%乙醇溶液定容至10 mL刻度線，搖動(dòng)均勻并靜置15 min。通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(T6)檢測(cè)吸光度，波長(zhǎng)設(shè)置為510 nm，根據(jù)所建立標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算龍眼胚性愈傷組織的類黃酮含量。

1.4 表兒茶素提取和UPLC分析

龍眼胚性愈傷組織表兒茶素的提取方法參照類黃酮提取方法。然后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液蒸干，再用5 mL甲醇溶液溶解。最后，將提取液通過(guò)0.22 μm有機(jī)膜，待上機(jī)測(cè)定。色譜條件[28]：Waters ACQUITY HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm) 色譜柱;流動(dòng)相為甲醇(A)-0.1%甲酸溶液(B)，梯度洗脫(0～12 min，5%～20%A;12～30 min，25%～55%A);流速:0.2 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣體積:1 μL。

1.5 紅藍(lán)復(fù)合光配比對(duì)龍眼胚性愈傷組織中DlLAR、DlCHS、DlHY5基因表達(dá)影響試驗(yàn)

根據(jù)龍眼基因組數(shù)據(jù)庫(kù)及轉(zhuǎn)錄組信息，篩選DIHY5、DlCHS、DlLAR基因序列。取不同光照處理后的龍眼胚性愈傷組織總RNA，RNA質(zhì)量檢驗(yàn)合格后采用PrimeScript? RT reagent Kit(TaKaRa)試劑盒進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)。參照LIN等[29]方法，以龍眼EIF4a、EF-la和FSD作為內(nèi)參基因，采用羅氏LightCyclers 480和SYBR Prumix EXTaqTM Ⅱ進(jìn)行不同光照處理下HY5、DlCHS、DlLAR基因qPCR分析。龍眼基因qPCR引物信息見(jiàn)表1。

表1 龍眼基因qPCR引物信息Tab.1 Primers for qPCR of longan

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS V19.0 軟件，單因素方差分析采用Duncan法，顯著性水平設(shè)為P<0.05。制圖采用GraphPad Prism 6.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅藍(lán)復(fù)合光配比對(duì)龍眼胚性愈傷組織生長(zhǎng)的影響

通過(guò)對(duì)龍眼胚性愈傷組織形態(tài)進(jìn)行觀察，與黑暗相比，紅藍(lán)復(fù)合光配比為1∶9和2∶8時(shí)，龍眼胚性愈傷組織生長(zhǎng)量較多，生長(zhǎng)率分別為1 107.5%、1 130.0%；紅藍(lán)復(fù)合光配比為9∶1和8∶2時(shí)，龍眼胚性愈傷組織生長(zhǎng)量較少，生長(zhǎng)率分別為877.5%和912.5%(圖1)。

不同小寫(xiě)字母表示各處理差異在0.05水平顯著，下同Different small letters indicate significant differences at 0.05 level，the same below圖1 紅藍(lán)復(fù)合光配比對(duì)龍眼胚性愈傷組織生長(zhǎng)率的影響Fig.1 Effect of the ratio of red-blue composite light on growth rate of longan embryonic callus(ECs)

通過(guò)對(duì)愈傷組織形態(tài)觀察(圖2A—D)也可以看出，藍(lán)光比例高時(shí)有利于愈傷組織增殖，而且顏色有些褐色，當(dāng)紅藍(lán)光配比為9∶1時(shí)，愈傷組織呈淡黃色。而對(duì)龍眼胚性愈傷組織顯微觀察時(shí)，并未發(fā)現(xiàn)紅藍(lán)復(fù)合光對(duì)其有明顯影響，但紅藍(lán)復(fù)合光配比為1∶9時(shí)，細(xì)胞中的內(nèi)含物質(zhì)更多，顏色更深(圖2E—H)。

A和E：黑暗；B和F：紅∶藍(lán)=1∶9；C和G：紅∶藍(lán)=5∶5；D和H：紅∶藍(lán)=9∶1

2.2 紅藍(lán)復(fù)合光配比對(duì)龍眼胚性愈傷組織類黃酮和表兒茶素含量的影響

由圖3可知，紅藍(lán)復(fù)合光配比對(duì)龍眼胚性愈傷組織類黃酮及表兒茶素含量有顯著影響。當(dāng)紅藍(lán)復(fù)合光配比為1∶9時(shí)，類黃酮及表兒茶素含量均為最高，分別為12.49 mg/g和2 187.54 μg/g，顯著高于其他處理；隨著復(fù)合光中紅光比例的增加，龍眼胚性愈傷組織中類黃酮和表兒茶素含量都呈下降趨勢(shì)。其中，在紅藍(lán)光配比為7∶3、8∶2和9∶1時(shí)，類黃酮含量較低，為8.38～8.73 mg/g，與黑暗處理(8.31 mg/g)差異不顯著；而在黑暗條件下表兒茶素含量最低。當(dāng)紅藍(lán)光進(jìn)行配比時(shí)，藍(lán)光對(duì)總黃酮和表兒茶素的積累效率顯著大于紅光，隨著紅藍(lán)復(fù)合光中紅光比例的增加，類黃酮和表兒茶素含量逐漸降低；隨著藍(lán)光比例的增加，類黃酮和表兒茶素總含量逐漸增加。表明紅藍(lán)光配比中藍(lán)光比例高時(shí)有利于類黃酮及表兒茶素累積。

圖3 紅藍(lán)復(fù)合光配比對(duì)龍眼胚性愈傷組織類黃酮和表兒茶素含量的影響Fig.3 Effect of the ratio of red-blue composite light on the contents of flavonoids and epicatechin of longan ECs

2.3 紅藍(lán)光復(fù)合配比對(duì)龍眼DlCHS、DlLAR和DlHY5基因表達(dá)的影響

通過(guò)對(duì)龍眼胚性愈傷組織類黃酮合成關(guān)鍵基因DlCHS和DlLAR在紅藍(lán)光配比中的表達(dá)量分析，DlCHS和DlLAR相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)一致(圖4a—b)。在黑暗培養(yǎng)時(shí)，DlCHS和DlLAR的相對(duì)表達(dá)量都是最低。隨著紅藍(lán)復(fù)合光配比變化，DlCHS和DlLAR基因相對(duì)表達(dá)量也發(fā)生顯著變化。隨著紅光比例降低，DlCHS和DlLAR基因相對(duì)表達(dá)量呈先上升后下降趨勢(shì)，在紅藍(lán)光配比為3∶7時(shí)，DlCHS和DlLAR相對(duì)表達(dá)量最高。而且，還可以看出，有光存在時(shí)DlCHS和DlLAR基因相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照，說(shuō)明紅藍(lán)光配比可以影響龍眼胚性愈傷組織類黃酮代謝產(chǎn)物合成。

同時(shí)，DlHY5的相對(duì)表達(dá)量在黑暗培養(yǎng)條件下最低(圖4c)。當(dāng)復(fù)合光配比為紅∶藍(lán)=1∶9時(shí)，DlHY5的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高值，其他復(fù)合光配比處理的相對(duì)表達(dá)量均低于紅∶藍(lán)=1∶9處理，但是也高于黑暗處理。可知紅藍(lán)復(fù)合光比黑暗條件更適合轉(zhuǎn)錄因子DlHY5的表達(dá)。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)DlHY5基因的表達(dá)量趨勢(shì)與類黃酮代謝產(chǎn)物含量趨勢(shì)基本一致。因此，推測(cè)紅藍(lán)復(fù)合光可能通過(guò)調(diào)控DlHY5基因表達(dá)量進(jìn)而影響類黃酮代謝產(chǎn)物的合成。

圖4 紅藍(lán)復(fù)合光配比對(duì)DlCHS、DlLAR和DlHY5基因表達(dá)的影響Fig.4 Effect of the ratio of red-blue composite light on the expression levels of DlCHS，DlLAR and DlHY5 of longan ECs

3 結(jié)論與討論

3.1 紅藍(lán)復(fù)合光有利于龍眼胚性愈傷組織生長(zhǎng)及類黃酮和表兒茶素積累

光質(zhì)是調(diào)節(jié)控制植物生長(zhǎng)及代謝的基本因素之一，可以調(diào)控大多數(shù)生物合成過(guò)程，不僅影響植物的初生代謝和生長(zhǎng)狀態(tài)，也會(huì)影響植物的次生代謝過(guò)程。紅藍(lán)復(fù)合光有利于次生代謝產(chǎn)物的累積，能夠改善茄皮品質(zhì)并促進(jìn)類黃酮合成[13]，提高韭菜類黃酮含量[14]。不同藍(lán)光和紅光配比能顯著地影響櫻桃番茄果實(shí)的品質(zhì)，藍(lán)光比例增大可促進(jìn)櫻桃番茄果實(shí)番茄紅素、游離氨基酸和類黃酮的形成，增加糖酸比；紅光比例增大有利于可滴定酸的形成[30]。本研究也得到相似結(jié)論，紅藍(lán)復(fù)合光有利于龍眼胚性愈傷組織中類黃酮及表兒茶素合成，且藍(lán)光比例越大越有利于次生代謝物質(zhì)的合成。

3.2 紅藍(lán)復(fù)合光對(duì)龍眼胚性愈傷組織類黃酮合成基因的影響

CHS是類黃酮物質(zhì)生物合成途徑的關(guān)鍵酶。它介導(dǎo)了黃酮類化合物合成的第1步，并且具有功能多樣性，參與不同發(fā)育階段、組織特異性和環(huán)境響應(yīng)等方面調(diào)控，對(duì)類黃酮的合成起到極為關(guān)鍵的作用，不但對(duì)調(diào)控植物體內(nèi)黃酮類化合物的生物合成具有重要意義，還對(duì)提高植物體內(nèi)類黃酮物質(zhì)的產(chǎn)量具有非常重要的意義。CHS基因的表達(dá)受到多種因素的影響，如環(huán)境脅迫、光照、傷害、誘導(dǎo)劑，甚至中間產(chǎn)物如肉桂酸，這些都能影響CHS的表達(dá)水平；CHS和苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)的表達(dá)量降低，糖和表兒茶素含量下降[31]。對(duì)擬南芥、芥菜、歐芹等植物研究表明，CHS啟動(dòng)子含有光響應(yīng)元件ACE(ACGT containing element)和MRE(MYB recognition element)，受紫外光和藍(lán)光誘導(dǎo)表達(dá)[32-33]。

CHS基因在柑橘類黃酮生物合成中具有非常關(guān)鍵的作用，CHS基因的表達(dá)水平與類黃酮含量之間表現(xiàn)出很明顯的正相關(guān)關(guān)系[34]，表明CHS基因的表達(dá)水平與類黃酮含量是十分密切的。LAR基因?qū)τ诒韮翰杷氐恼{(diào)控極為重要，在龍眼胚性愈傷組織中能對(duì)表兒茶素物質(zhì)進(jìn)行催化、轉(zhuǎn)化，對(duì)表兒茶素含量起到極大的促進(jìn)作用，對(duì)表兒茶素的合成至關(guān)重要。LAR蛋白能夠催化兒茶素、無(wú)色花青素和相關(guān)的黃烷-3-羥基阿福豆素與沒(méi)食子兒茶素這些植物聚合型原花青素或者濃縮單寧合成起始物質(zhì)的合成。本研究也發(fā)現(xiàn)，DlCHS基因和DlLAR基因受到紅藍(lán)復(fù)合光的影響，紅光在一定程度上會(huì)抑制相關(guān)基因的表達(dá)，隨著藍(lán)光在紅藍(lán)復(fù)合光中所占比例的增加，類黃酮和表兒茶素含量也提高，這說(shuō)明藍(lán)光會(huì)對(duì)龍眼胚性愈傷組織中類黃酮和表兒茶素合成基因的表達(dá)起到促進(jìn)作用，有利于類黃酮合成。

3.3 轉(zhuǎn)錄因子HY5參與紅藍(lán)復(fù)合光對(duì)龍眼胚性愈傷組織類黃酮代謝的調(diào)控

不同波長(zhǎng)的光被植物體內(nèi)不同光受體感知，并通過(guò)光信號(hào)途徑調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和次生物質(zhì)代謝。HY5能夠受到光質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)。李慧峰等[35]研究表明，蘋(píng)果HY5能夠被白光、藍(lán)光、紫外光誘導(dǎo)，而紅光對(duì)HY5表達(dá)沒(méi)有明顯誘導(dǎo)。冀曉昊等[21]研究還發(fā)現(xiàn)，HY5在葡萄果實(shí)發(fā)育過(guò)程中有2次表達(dá)高峰，分別在花青苷快速積累期與果實(shí)成熟后期，說(shuō)明HY5的表達(dá)還與發(fā)育進(jìn)程有關(guān)，且與花青苷的積累呈正相關(guān)。已有研究表明，HY5可以誘導(dǎo)擬南芥花青苷合成轉(zhuǎn)錄因子MYB75/PAP1的表達(dá)[22]。VvMYBA1是擬南芥MYB75/PAP1的同源基因，其表達(dá)規(guī)律與VvHY5基本一致，說(shuō)明紅藍(lán)復(fù)合光可能是通過(guò)光信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子VvHY5調(diào)控VvMYBA1的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控花青苷合成途徑結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，導(dǎo)致花青苷積累的差異。而在本研究中也發(fā)現(xiàn)，隨著紅光在紅藍(lán)復(fù)合光中比例的增加，DlHY5表達(dá)也受到抑制，這就表明紅藍(lán)復(fù)合光能夠誘導(dǎo)龍眼胚性愈傷組織中DLHY5基因表達(dá)，進(jìn)而影響類黃酮代謝產(chǎn)物的合成。