張盛楠,賈 琰,瞿炤珺,楊 亮,李 曉,張 妍,王 喆,趙宏偉
(1.寒地糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與生理生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,東北農(nóng)業(yè)大學(xué),哈爾濱 150030;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,哈爾濱 150030)
水稻作為中國主要的糧食作物,對(duì)保證國內(nèi)糧食安全發(fā)揮著重要作用[1]。黑龍江省是主要的粳稻產(chǎn)區(qū),但其位于中國最北端,年平均氣溫較低,導(dǎo)致低溫冷害現(xiàn)象頻繁發(fā)生,對(duì)黑龍江省糧食生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響。因此,低溫冷害已經(jīng)成為影響寒地粳稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的氣象災(zāi)害之一。
水稻是喜溫作物,在孕穗期對(duì)溫度十分敏感[2]。水稻在孕穗期遭受低溫冷害脅迫會(huì)影響正常生理代謝過程,表現(xiàn)出結(jié)實(shí)率低,產(chǎn)量下降[3]。Kuk等[4]研究表明,冷脅迫顯著增加水稻苗期功能葉片抗氧化酶的活性,其中CAT活性增加最為顯著。朱珊等[5]研究發(fā)現(xiàn),在孕穗期低溫脅迫下水稻內(nèi)源激素發(fā)生顯著性變化。Taylor等[6]研究表明,低溫脅迫會(huì)對(duì)葉綠體超微結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重影響。目前大量研究集中于低溫脅迫對(duì)水稻苗期生長(zhǎng)發(fā)育及生理代謝過程等方面[7-8],而對(duì)水稻孕穗期相關(guān)生理指標(biāo)、葉綠體超微結(jié)構(gòu)及產(chǎn)量的研究還相對(duì)較少。因此本試驗(yàn)采取冷水灌溉方式,大田模擬自然條件下低溫冷害,以粳稻品種‘東農(nóng)428’和‘松粳10’為試驗(yàn)材料,研究孕穗期冷水灌溉對(duì)寒地粳稻耐冷相關(guān)指標(biāo)、葉綠體超微結(jié)構(gòu)及產(chǎn)量的影響,為解決寒地粳稻孕穗期低溫冷害問題提供參考。
選用經(jīng)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所前期篩選出的生育期相近的耐冷型品種‘東農(nóng)428’(‘DN428’)和冷敏感型品種‘松粳10’(‘SJ10’)為試驗(yàn) 材料[9]。
試驗(yàn)于2018年在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)阿城實(shí)驗(yàn)基地(東經(jīng)127.04°,北緯45.52°)進(jìn)行。4月13日播種,5月20日移栽。采用裂區(qū)試驗(yàn)設(shè)計(jì),以不同時(shí)間冷水灌溉處理為主區(qū),在孕穗期(幼穗長(zhǎng)約1 cm)進(jìn)行0(正常灌溉)、5、10和15 d的冷水灌溉處理,分別記為CK、D5、D10、D15。以粳稻品種為副區(qū),設(shè)置3次重復(fù),每個(gè)副區(qū)面積為18 m2。插秧規(guī)格為30 cm×10 cm,行長(zhǎng)6 m,每3株為1穴。在2018年7月12日進(jìn)行冷水灌溉,采用自動(dòng)冷水灌溉系統(tǒng)進(jìn)行冷水灌溉處理,冷水灌溉溫度為17 ℃(為黑龍江省孕穗期低溫冷害溫度)。灌水深度在20 cm[9]左右。冷水灌溉的時(shí)間為6:00-20:00。以正常灌溉為對(duì)照,處理結(jié)束后恢復(fù)正常灌溉,正常灌溉為曬水池中水(22~24 ℃)。其他同一般大田管理。采用田間氣候自動(dòng)測(cè)定儀測(cè)定大田氣溫、土壤溫度(深度10 cm)、光照輻射量,具體信息見表1。
表1 孕穗期冷水灌溉期間田間試驗(yàn)條件Table 1 Field test conditionunder cold water stress at booting stage
生理指標(biāo):選取各處理生長(zhǎng)整齊一致的植株進(jìn)行標(biāo)記,孕穗期開始進(jìn)行冷水灌溉處理,處理結(jié)束當(dāng)天8:00-10:00取樣,取水稻植株最上面的完全展開葉,3次重復(fù),放在-80 ℃冰箱保存,備用。
葉綠體超微結(jié)構(gòu):選取各處理生長(zhǎng)整齊一致的植株進(jìn)行標(biāo)記,孕穗期開始進(jìn)行冷水灌溉處理,處理結(jié)束當(dāng)天8:00-10:00取樣,選取水稻植株最上面的完全展開葉進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察,葉片剔除中間葉脈,切割成1 mm×3 mm的切片若干,放入戊二醛固定液中保存,在H-760型透射電子顯微鏡下觀察拍照。
產(chǎn)量:于成熟期,各處理選取2 m2實(shí)割,3次重復(fù),收獲后自然風(fēng)干,脫粒測(cè)定每公頃的實(shí)際 產(chǎn)量。
1.4.1 抗氧化系統(tǒng) 稱取0.5 g水稻葉片,加入5 mL(pH=7.8)的磷酸緩沖液,冰浴研磨成勻漿,在10 000 r/min、4 ℃下離心10 min,取上清液用于抗氧化酶活性測(cè)定。超氧化物歧化酶(SOD)的活性采用氮藍(lán)四唑法[10]測(cè)定,過氧化物酶(POD)的活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[10]。過氧化氫酶(CAT)活性采用高錳酸鉀滴定法[10]測(cè)定。
1.4.2 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì) 可溶性糖(SS)采用蒽酮-硫酸比色法[13],稱取0.5 g水稻葉片,加入4 mL 80%酒精研磨成勻漿,倒入離心管中,80 ℃水浴鍋中水浴30 min,在5 000 r/min離心機(jī)下離心10 min,收集上清液,其殘?jiān)? mL 80%酒精重復(fù)提取1次,合并上清液,上清液中加入適量活性炭,80 ℃水浴鍋中脫色20 min,過濾后吸取濾液進(jìn)行測(cè)定。
可溶性蛋白(SP)采用考馬斯亮藍(lán)法[14],稱取0.5 g水稻葉片,加入5 mL(pH=7.8)的磷酸緩沖液,冰浴研磨,在10 000 r/min、4 ℃下離心10 min,取上清液用于可溶性蛋白含量測(cè)定。
1.4.3 內(nèi)源激素 采用酶聯(lián)免疫測(cè)定法[15]測(cè)定脫落酸(ABA)、吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3)、玉米素核苷(ZR)含量。
以3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值為試驗(yàn)數(shù)據(jù)。Microsoft Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖,SPSS 22.0進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和方差分析,使用RStudio進(jìn)行相關(guān)性分析作圖。
如表2所示,所測(cè)指標(biāo)處理間和品種間均差異顯著。處理和品種互作間方差分析表明,CAT、GA3和產(chǎn)量之間差異不顯著,其余指標(biāo)均差異顯著。
表2 處理和品種之間的方差分析Table 2 Analysis of variance between treatment and variety
在孕穗期冷水灌溉下,水稻啟動(dòng)保護(hù)酶系統(tǒng),通過消除體內(nèi)多余的自由基來減輕冷水脅迫造成的傷害。由圖1可知,與對(duì)照相比,‘DN428’和‘SJ10’在冷水灌溉下,功能葉片中SOD、POD、CAT活性顯著上升,均隨冷水灌溉時(shí)間增加而呈上升趨勢(shì),上升幅度也隨冷水灌溉時(shí)間而增加,在D15處理下達(dá)到最大值,具體表現(xiàn)為D15處理下‘DN428’功能葉片SOD活性增幅為32.11%,POD活性增幅為31.81%,CAT活性增幅為 27.69%,‘SJ10’增幅分別為28.40%、20.86%、 27.15%?!瓺N428’在冷水灌溉處理下,SOD、POD、CAT活性在各處理中差異顯著。‘SJ10’功能葉片CAT活性在冷水灌溉各處理下差異顯著,而SOD、POD活性在D10和D15處理下差異不顯著。‘DN428’功能葉片在冷水灌溉處理下抗氧化酶系統(tǒng)增幅大于‘SJ10’,說明‘DN428’功能葉片抗氧化酶系統(tǒng)比‘SJ10’能更快速的響應(yīng)冷水脅迫。
顯著性分析中同一品種不同處理和對(duì)照之間一起比較,不同字母之間表示差異顯著(P≤0.05)。下同。
圖2 孕穗期冷水灌溉下寒地粳稻含量變化Fig.2 Changes of H2O2 contents in japonica rice under cold water irrigation at booting stagein cold region
由圖3可知,與對(duì)照相比,‘DN428’和‘SJ10’在冷水灌溉下,SS和SP含量顯著上升。在孕穗期冷水灌溉下,‘DN428’和‘SJ10’功能葉片中SS和SP含量隨著冷水灌溉時(shí)間的增加呈上升趨勢(shì),增幅也隨冷水灌溉時(shí)間而增加,均在D15處理下達(dá)到最大值,具體表現(xiàn)為D15處理下‘DN428’功能葉片SS含量增幅為34.83%,SP含量增幅為 48.97%,‘SJ10’功能葉片SS含量增幅為44.69%,SP含量增幅為29.39%。‘DN428’功能葉片SS和SP含量在各冷水處理下差異顯著,‘SJ10’功能葉片SS含量在各冷水處理下差異顯著,而SP含量在D10和D15處理下無顯著差異。
圖3 孕穗期冷水灌溉下寒地粳稻SS和可SP含量變化Fig.3 Changes of soluble sugar and soluble protein content in japonica rice under cold water irrigation at booting stagein cold region
由圖4可知,‘DN428’和‘SJ10’功能葉片中,內(nèi)源激素ABA在各冷水處理下與對(duì)照相比顯著上升,經(jīng)過冷水灌溉后,‘SJ10’功能葉片中ABA含量隨冷水灌溉時(shí)間的增加而顯著上升,在D15處理下達(dá)到最大值,在D15處理下增幅為 30.96%。而‘DN428’功能葉片ABA含量在D5處理下最大,D10和D15處理差異不顯著,在D5處理下增幅為24.87%。從圖4中IAA、GA3、ZR含量表明,除‘DN428’的D5處理與對(duì)照差異不顯著外,‘DN428’和‘SJ10’各處理中功能葉片IAA、GA3、ZR含量均顯著小于對(duì)照,且隨著冷水灌溉時(shí)間的增加呈下降趨勢(shì),具體表現(xiàn)為‘DN428’功能葉片IAA、GA3、ZR含量在D15處理下降幅為10.98%、25.64%、35.09%,‘SJ10’降幅分別為20.87%、36.49%、46.39%。兩品種中功能葉片IAA含量在D10和D15處理下無顯著差異?!瓺N428’功能葉片中GA3和ZR含量在D10和D15處理下差異不顯著,而‘SJ10’各冷水處理下差異顯著。
圖4 孕穗期冷水灌溉下寒地粳稻內(nèi)源激素含量變化Fig.4 Changes of endogenous hormones in japonica rice under cold water irrigation at booting stagein cold region
如圖5-A、5-E,在CK下,‘DN428’和‘SJ10’葉綠體結(jié)構(gòu)完好,呈橢圓形或者紡錘形緊貼在細(xì)胞壁上,類囊體片層均很清晰,‘SJ10’葉綠體內(nèi)部有少量的淀粉粒存在。研究表明,葉綠體在遭受低溫冷害脅迫后,會(huì)表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)混亂,膨大,內(nèi)部類囊體片層結(jié)構(gòu)解體或消失[16]。在D5處理下(圖5-B、5-F),‘DN428’和‘SJ10’葉綠體均出現(xiàn)少量的嗜鋨粒,兩品種中葉綠體結(jié)構(gòu)與對(duì)照并未出現(xiàn)明顯差異,‘DN428’葉綠體內(nèi)部出現(xiàn)少量淀粉粒。在D10處理下(圖5-C、5-G),‘DN428’和‘SJ10’葉綠體和類囊體腫脹或變細(xì)長(zhǎng),出現(xiàn)大量的嗜鋨粒,且‘SJ10’出現(xiàn)質(zhì)壁分離現(xiàn)象。在D15處理下(圖5-D、5-H),葉綠體結(jié)構(gòu)不規(guī)則且與細(xì)胞壁之間存在明顯空隙,可觀察到葉綠體和類囊體腫脹,葉綠體類囊體片層模糊,‘SJ10’葉綠體內(nèi)部呈現(xiàn)空泡化,嗜鋨粒明顯增多。
由表3可知,與對(duì)照相比,孕穗期冷水灌溉下寒地粳稻的產(chǎn)量均顯著下降,各處理之間差異顯著,且隨著冷水灌溉時(shí)間的增加下降幅度逐漸增大。‘DN428’在D5、D10、D15處理下產(chǎn)量較CK分別下降15.81%、25.64%、37.87%。‘SJ10’在D5、D10、D15處理下產(chǎn)量較CK分別下降 19.27%、33.58%、47.94%?!瓺N428’各冷水處理下產(chǎn)量CRI為62.13%~84.19%,‘SJ10’各冷水處理下產(chǎn)量CRI為52.06%~80.73%。由此可見孕穗期冷水灌溉處理對(duì)‘SJ10’產(chǎn)量影響比‘DN428’大。
A.‘DN428’-CK;B.‘DN428’-D5;C.‘DN428’-D10;D.‘DN428’-D15;E.‘SJ10’-CK;F.‘SJ10’-D5;G.‘SJ10’-D10;H.‘SJ10’-D15
由圖6可知,內(nèi)源激素ABA與抗氧化酶、活性氧物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)呈極顯著正相關(guān)關(guān)系,與其他3種內(nèi)源激素呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。IAA與抗氧化酶、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。GA3與活性氧物質(zhì)呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,ZR與活性氧物質(zhì)、SOD、POD、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系或顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。從整體上來看,ABA是與耐冷相關(guān)生理指標(biāo)相關(guān)性最大的內(nèi)源激素。
表3 孕穗期冷水灌溉后寒地粳稻的產(chǎn)量Table 3 Yield of japonica rice in cold region under treatment of cold water irrigation at booting stage
x,y軸代表相關(guān)生理指標(biāo),顏色代表相關(guān)系數(shù)(紅色代表正相關(guān),藍(lán)色代表負(fù)相關(guān),顏色越深代表相關(guān)性越高),* 表示在 0.05水平上顯著相關(guān)。**表示在0.01水平上顯著相關(guān)
表4 孕穗期冷水灌溉下寒地粳稻相關(guān)生理指標(biāo)CRI與產(chǎn)量CRI的關(guān)系Table 4 Relationship between CRI and yield CRI of related physiological indexes of japonica rice in cold regionunder cold water irrigation at booting stage
內(nèi)源激素是一種有機(jī)化合物,在逆境脅迫下能調(diào)節(jié)植物自身生理過程[27]。Davies[28]認(rèn)為,植物的內(nèi)源激素具有復(fù)雜的生理效應(yīng),既有協(xié)同作用,又有拮抗作用。邵怡若等[29]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)植物受到低溫脅迫的情況下,ABA含量升高。這與本研究結(jié)果一致,可能原因是在冷水灌溉下,寒地粳稻功能葉片細(xì)胞膜受到破壞,導(dǎo)致功能葉片電子滲透率增加,ABA含量的增加可以降低水稻植株生長(zhǎng)勢(shì),對(duì)低溫脅迫做出相應(yīng)的適應(yīng)性反應(yīng)[30]。在孕穗期冷水灌溉處理下,IAA、GA3和ZR含量下降,原因可能為促進(jìn)型植物激素含量下降,可以延緩植物生長(zhǎng)速度,維持體內(nèi)代謝平衡。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),冷敏感型水稻‘SJ10’內(nèi)源激素ABA在冷水灌溉下上升幅度大于耐冷型水稻‘DN428’,而冷敏感型水稻‘SJ10’內(nèi)源激素IAA、GA3和ZR含量比耐冷型水稻‘DN428’下降幅度要大,分析認(rèn)為冷敏感型水稻在受到冷水脅迫后具有較強(qiáng)合成ABA的能力,促進(jìn)植物進(jìn)入休眠狀態(tài)。同時(shí)促進(jìn)型植物激素(IAA、GA3和ZR)含量下降,降低水稻細(xì)胞伸展性,減少因冷水灌溉帶來的傷害。從抗氧化系統(tǒng)與內(nèi)源激素的相關(guān)分析可知,內(nèi)源激素ABA對(duì)抗氧化系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)相關(guān)性最大。徐新娟[31]指出ABA在低溫脅迫下會(huì)使植物產(chǎn)生較多的H2O2,促進(jìn)植物氣孔關(guān)閉,減少蒸騰作用,進(jìn)而改變植株體內(nèi)各種生理生化效應(yīng)。本研究表明ABA可以促進(jìn)植物抗氧化酶活性的增加,來抵御逆境脅迫。從可溶性糖和可溶性蛋白與內(nèi)源激素相關(guān)分析可知,在冷水灌溉下ABA含量的增加可以提高SS和SP含量,用于維持植物細(xì)胞滲透壓平衡[32]。
葉綠體是主要的光合細(xì)胞器,它含有豐富的類囊體膜。在正常灌溉下,葉綠體呈橢圓形或者紡錘型緊貼在細(xì)胞壁上,類囊體片層清晰可見[33]。在冷水灌溉下,葉綠體結(jié)構(gòu)不規(guī)則且與細(xì)胞壁之間存在明顯空隙,葉綠體和類囊體腫脹,類囊體片層模糊。從‘DN428’和‘SJ10’葉綠體超微結(jié)構(gòu)對(duì)比發(fā)現(xiàn),冷水灌溉下,‘DN428’葉綠體超微結(jié)構(gòu)損傷較輕,有少量淀粉粒出現(xiàn)。分析認(rèn)為,活性氧物質(zhì)主要的產(chǎn)出地是葉綠體,葉綠體超微結(jié)構(gòu)受損程度取決于活性氧物質(zhì)含量及抗氧化酶活性高低[34]。同時(shí)‘DN428’淀粉粒的出現(xiàn)是對(duì)冷水脅迫做出的適應(yīng)反應(yīng)。由于‘DN428’在冷水灌溉下比‘SJ10’具有高的抗氧化酶活性和低的活性氧水平,因此葉綠體超微結(jié)構(gòu)損傷程度較輕。