1,2,4-丁三醇的雙水相萃取

杜宣慧，錢方圓，陸信曜，2，3，宗紅，3，諸葛斌，3

（1 江南大學(xué)糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2 非糧生物質(zhì)酶解國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530255；3 江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物工程學(xué)院，工業(yè)微生物研究中心，江蘇無錫214122）

1,2,4-丁三醇（1,2,4-butanetriol, BT）是一種重要的平臺(tái)化合物，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、軍工、化妝品等行業(yè)[1-2]。目前工業(yè)生產(chǎn)BT采用化學(xué)法[3]，環(huán)境不友好、反應(yīng)條件苛刻。2003 年，研究人員利用重組大腸桿菌首次實(shí)現(xiàn)了BT 的生物合成[1]。近年來，BT 的生物法合成技術(shù)在國內(nèi)外取得了較大進(jìn)展[4-5]，但有關(guān)BT分離提取的報(bào)道較少。BT是一種高沸點(diǎn)且高親水性化合物，傳統(tǒng)的分離方法如減壓蒸餾、吸附等，難以分離[6]。李敏[6]根據(jù)BT 的化學(xué)性質(zhì)，通過羥醛縮合反應(yīng)，建立了反應(yīng)萃取-水解耦合工藝分離發(fā)酵液中的BT，最后BT的回收率為84%±5%。

雙水相萃取法是一種新型的萃取分離技術(shù)[7]，具有提取條件溫和、界面張力低、周期短、可擴(kuò)大生產(chǎn)[8-9]等優(yōu)點(diǎn)。此外，雙水相體系中的有機(jī)溶劑和無機(jī)鹽，價(jià)格低廉、可回收利用、經(jīng)濟(jì)環(huán)保。目前雙水相萃取分離技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物制品[10]、中藥[11]和金屬離子[12]的分離，而其萃取分離BT還未有報(bào)道。本文就雙水相萃取分離技術(shù)萃取分離BT進(jìn)行研究，為發(fā)酵液中BT的分離提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

蛋白胨、酵母粉，Oxiod 公司；D-1,2,4-丁三醇標(biāo)準(zhǔn)品，阿拉丁試劑(上海)有限公司；卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

5L發(fā)酵罐BIOTECH-5BG-7000A，上海保興生物設(shè)備有限公司；高效液相色譜儀P680，美國Dionex 公司；液相色譜柱Aminex HPX-87 column，美國Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵液的制備

菌種來源：E.coliKXW3009，實(shí)驗(yàn)室保藏，構(gòu)建方法和發(fā)酵條件見文獻(xiàn)[13]。

種子培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件（g/L）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10；1×105Pa 滅菌15min，接種量為1%，溫度37℃，轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)時(shí)間8h。

發(fā)酵培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件（g/L）：酵母粉7.5，蛋白胨15，NaCl 15，葡萄糖10，木糖30；1×105Pa 滅菌15min。5L 發(fā)酵罐裝液量2.5L，10%接種量，葡萄糖初始濃度為10g/L，木糖初始濃度為30g/L，溫度37℃，攪拌轉(zhuǎn)速400r/min，通氣量為2m3/min，用10mol/L NaOH 溶液控制pH 為6.5。在發(fā)酵培養(yǎng)12h 時(shí)一次性補(bǔ)加300mL 的84g/L 葡萄糖和252g/L 木糖。發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液以4000r/min 離心20min，將離心去除菌體后的上清液保存于4℃冰箱中備用。

1.2.2 BT在不同鹽析萃取體系中的分配情況

分別用不同的有機(jī)溶劑（甲醇、乙醇、異丙醇）、無機(jī)鹽[(NH4)2SO4，K2HPO4，NaCl]兩兩組合形成雙水相體系，考察不同雙水相體系下BT分配系數(shù)和萃取效率。操作如下：體系總質(zhì)量為10g，離心去除菌體后的發(fā)酵液置于離心管中，加入無機(jī)鹽溶解后添加一定量有機(jī)溶劑，旋渦震蕩10min，靜置10h，待完全分相后，記錄上下相體積，檢測(cè)上下相中BT濃度，計(jì)算分配系數(shù)和萃取效率。

1.2.3 無水乙醇/K2HPO4雙水相相圖的繪制

采用濁點(diǎn)法繪制乙醇/K2HPO4相圖，考慮到BT對(duì)體系的影響，將適量BT 標(biāo)品加入鹽溶液中，根據(jù)濁點(diǎn)法[14]繪制相圖。

1.2.4 無水乙醇、K2HPO4分?jǐn)?shù)對(duì)BT 分配系數(shù)的影響

取2g K2HPO4加入到離心后的發(fā)酵液中，K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，溶解后分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%～30%的無水乙醇構(gòu)成不同的雙水相體系，考察不同的無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)BT 分配系數(shù)和萃取效率的影響。同樣，在體系中維持無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%，向體系加入不同量的K2HPO4（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%～30%），考察不同的K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)BT分配系數(shù)和萃取效率的影響。

1.2.5 pH對(duì)BT分配系數(shù)的影響

在發(fā)酵上清液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28% 的K2HPO4溶解后，用10mol/L NaOH 和5mol/L H2SO4溶液調(diào)節(jié)該溶液pH，分別調(diào)pH 為5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%的無水乙醇，構(gòu)建雙水相體系，考察不同pH對(duì)BT分配系數(shù)和萃取效率的影響。

1.2.6 放大實(shí)驗(yàn)對(duì)BT萃取效率的影響

在最佳萃取條件下[乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)28%，pH 9.5]，分別將雙水相體系質(zhì)量從10g擴(kuò)大到100g、500g，考察放大體系對(duì)BT萃取效率和分配系數(shù)的影響。

1.3 分析方法

BT測(cè)定方法見文獻(xiàn)[4]。分配系數(shù)（K）、BT萃取效率（E）和體積比分別按照式(1)～式(3)計(jì)算。

式中，K為分配系數(shù)；ρ1、ρ2為上下兩相中的BT的質(zhì)量濃度，g/L；R為相比；Vt、Vb為上下相的體積，mL；E為BT萃取效率，%。

2 結(jié)果與討論

2.1 雙水相體系的選擇

表1 不同雙水相體系下BT的分配系數(shù)和萃取效率（有機(jī)溶劑/無機(jī)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%/20%）

2.2 無水乙醇/K2HPO4雙水相相圖

相圖反映了在一個(gè)體系中水溶液兩相的形成條件及其定量關(guān)系，曲線下方是均相區(qū)，在該配比下不會(huì)得到分開的兩相，曲線上方是兩相區(qū)，在該配比下可以形成分開的兩相[19]。為了解BT 存在的情況下，無水乙醇/K2HPO4中的成相范圍，用濁度法繪制無水乙醇/ K2HPO4雙水相相圖，結(jié)果見圖1。如圖1(a)所示，無水乙醇/K2HPO4雙水相體系成相范圍廣，在K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19.83%～46.87%均可以成相，在兩相區(qū)內(nèi)，上相富含無水乙醇，下相富含K2HPO4。當(dāng)K2HPO4濃度較低時(shí)，K2HPO4的鹽析效應(yīng)較弱，導(dǎo)致其難以形成雙水相體系，隨著K2HPO4的增加，鹽析效應(yīng)增強(qiáng)，當(dāng)無水乙醇達(dá)到一定濃度既可形成雙水相體系，并且所需無水乙醇的濃度隨K2HPO4濃度的增加而減少。更多K2HPO4的加入，增加了鹽析效應(yīng)，導(dǎo)致對(duì)水的競(jìng)爭(zhēng)能力增強(qiáng)，促進(jìn)分相[20]。綜合考慮無水乙醇和K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)，實(shí)驗(yàn)點(diǎn)從曲線上方的區(qū)域選取。

2.3 無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)BT萃取效率的影響

選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的K2HPO4和不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（20%～30%）的無水乙醇分別組成雙水相體系，研究BT 的分配系數(shù)和萃取效率的影響見圖1(b)。在圖1(b)中，最初BT 的萃取效率隨無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而提高，當(dāng)雙水相體系中K2HPO4和無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20%和28%時(shí)，BT 的分配系數(shù)和萃取效率分別達(dá)到6.04 和92.82%，繼續(xù)增加無水乙醇，萃取效率降低，這與文獻(xiàn)[21]結(jié)論相似。無水乙醇/K2HPO4雙水相體系的分離過程是無水乙醇和K2HPO4爭(zhēng)奪水分子的過程，溶劑的水化能力和無機(jī)鹽的鹽析能力直接關(guān)系到萃取結(jié)果，BT 在該雙水相體系下更趨向分配于上相，而無水乙醇用量的增加，上相中水分子增加，下相中水分子減少，下相出現(xiàn)鹽析效應(yīng)，更多的BT被“排出”下相，降低了下相中BT的濃度，提高了BT的分配系數(shù)和萃取效率，但過量的無水乙醇會(huì)與水互溶，進(jìn)入下相，帶走一部分無水乙醇中的BT，上相的BT 濃度降低，分配系數(shù)和萃取效率減小，這也是當(dāng)無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到30%時(shí)，BT 分配系數(shù)和萃取效率降低的原因。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)都采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)28%的無水乙醇進(jìn)行研究。

圖1 無水乙醇/K2HPO4雙水相相圖及無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH對(duì)BT萃取效率的影響

2.4 K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)BT萃取效率的影響

考察K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)BT的分配系數(shù)和萃取效率的影響，用5 組不同的K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1(c)所示。相比于無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)BT 的分配系數(shù)和萃取效率的影響，K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加對(duì)BT萃取效率的提高影響較小，從結(jié)果可知，當(dāng)K2HPO4為28%時(shí)萃取效果最佳，當(dāng)K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于28%時(shí)，BT的分配系數(shù)隨K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而提高，但是加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的K2HPO4時(shí)，分配系數(shù)降低。因?yàn)镵2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，會(huì)增加競(jìng)爭(zhēng)締合水分子的能力，增強(qiáng)鹽析能力，導(dǎo)致更多的水分子進(jìn)入下相，使上相中BT 的濃度增加，分配系數(shù)和萃取效率提高，但是添加過多的K2HPO4，會(huì)讓BT隨水進(jìn)入下相，反而降低分配系數(shù)[22]，因此選擇K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%。

2.5 pH對(duì)BT萃取效率的影響

體系pH 的改變會(huì)影響兩相間的電位差，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致兩相帶電性質(zhì)的變化[10]。通過控制體系pH 為5.0～10.0，考察pH 對(duì)BT 萃取效率的影響，如圖1(d)所示。體系的原始pH 為9.11，在pH＜7.0 時(shí)會(huì)有大量K2HPO4析出，無法形成雙水相體系。在pH＞7.0 時(shí)，pH 對(duì)BT 的分配系數(shù)和萃取效率有較大影響，當(dāng)pH 為9.5 時(shí)，BT 的萃取效率最佳，分配系數(shù)和萃取效率分別達(dá)到了18.35 和95.87%。BT 為多元醇，電位差的改變對(duì)其影響并不大，但發(fā)酵液中其他物質(zhì)在不同pH 下，分離效果不同，越接近其等電點(diǎn)，越容易被分離出來，使得上相中BT 濃度更高，萃取效率和分配系數(shù)增加。

2.6 放大體系對(duì)BT萃取效率的影響

將原始10g雙水相體系放大至100g、500g（因500g 體系較大，震蕩方式不合適，所以換成攪拌），考察放大體系對(duì)分配系數(shù)和萃取效率的影響。從表2可知，隨著體系的放大，體系混合不充分，兩相分離效果不佳，導(dǎo)致雙水相體系萃取BT的分配系數(shù)和萃取效率有輕微降低，但是影響不大，說明該方法萃取分離BT 有一定的穩(wěn)定性，可以放大使用。

表2 放大體系對(duì)BT萃取效果的影響

3 結(jié)論

采用雙水相體系對(duì)發(fā)酵液中的BT 進(jìn)行萃取分離，篩選不同的雙水相體系，優(yōu)化有機(jī)溶劑和無機(jī)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH 后，得到最佳的雙水相體系為無水乙醇/K2HPO4，最佳的萃取條件為：無水乙醇/K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為28%/28%，pH為9.5，分配系數(shù)和萃取效率分別為18.35和95.87%。放大實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，萃取效率和分配系數(shù)所受影響不大。采用雙水相萃取技術(shù)萃取BT的萃取效率高，條件溫和，無水乙醇易于回收，可反復(fù)利用，經(jīng)濟(jì)適用，可為工業(yè)采用生物發(fā)酵法生產(chǎn)BT 以及其下游分離提供參考。