李媛媛,宮小勇,代引海,楊文婷,鄭鵬生

(1.陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院,陜西 咸陽 712000;2.西安交通大學第一附屬醫(yī)院,陜西 西安 710061)

宮頸癌(CC,cervical cancer)是一種嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤。目前,宮頸癌的發(fā)病率及死亡率在全球婦女惡性腫瘤中僅次于乳腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌,居第四位[1]。據(jù)2015年數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示,我國宮頸癌大約有11.1萬新生病例,3.4萬死亡病例,且呈現(xiàn)年輕化趨勢[2]。人乳頭瘤病毒(HPV,human papillomavirus)持續(xù)感染作為宮頸癌的首要病因已得到肯定,但是其發(fā)病的原因及機制尚不明確[3]。Huang等[4]假設宮頸癌是由感染HPV的宮頸口過渡區(qū)的類干細胞形成的,連接/過渡區(qū)可能是宮頸癌干細胞的一個可能生態(tài)區(qū)。目前使用的或潛在的宮頸癌干細胞候選標記物有ABCG2、ALDH1、CD49f、OPN、CD133、OCT4、SOX2等[4-6]。

BMX(bone marrow X-linked kinase,也稱Etk)是Tec家族非受體酪氨酸激酶的一種,Tec家族激酶在哺乳動物中有5個組成成員:Btk、Bmx、Itk、Tec和Txk。BMX主要在大動脈內(nèi)皮組織、胎兒心內(nèi)膜、成人左心室心內(nèi)膜、骨髓、肺、淋巴造血細胞等中表達,在炎癥、心血管及惡性腫瘤等疾病中起到重要作用[7]。BMX的異常表達參與腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲與轉(zhuǎn)移、血管生成等方面的調(diào)控,與腫瘤細胞惡性生物學行為密切相關[8-10]。Guryanova等[11]證實BMX可以在惡性膠質(zhì)瘤干細胞(GSCs,glioblastoma stem cells)中特異性表達,通過激活STAT3來維持惡性膠質(zhì)瘤細胞的自我更新和致瘤潛能,有望作為惡性膠質(zhì)瘤治療的新靶點。但是BMX對宮頸癌腫瘤細胞的干性特征還未見報道,研究通過成球?qū)嶒炋剿鰾MX對宮頸癌C-33 A細胞干性特征的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

DMEM培養(yǎng)基(GIBCO,美國),胎牛血清(FBS,HyClone,美國),青霉素、鏈霉素(Sigma,美國),胰酶(Amresco,美國),DMSO(Sigma,美國),培養(yǎng)皿(10 mm,BD,美國),牛血清白蛋白(BSA,Sigma,美國),Transwell小室(Corning,美國),基質(zhì)膠(BD,美國),N2和B27添加劑(Invitrogen,美國)、人重組表皮生長因子(EGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)(PeproTech公司,美國),脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(Invitrogen,美國),G418(Calbiochem,德國),限制性內(nèi)切酶(Takara,日本),T4連接酶(Promega,美國)。

1.2 研究方法

(1) 細胞培養(yǎng) 宮頸癌細胞株HeLa、SiHa、C-33 A均購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC,american type culture collection)細胞庫,采用DMEM高糖培養(yǎng)基,加10%胎牛血清(FBS),放入37 ℃,含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(2) BMX過表達克隆株的篩選 從pcDNA3.1-BMX wt(黃奇英教授贈送,陽明大學)質(zhì)粒中提取BMX cDNA片段;利用引物進行PCR擴增,引物片段包括BMXF:5′-CGCGTCGACATGGATACAAAATCTATTCTA-3′;BMXR:5′-CTAGGTACCTCAATGCTTGTCTTTTTCCCG-3′;1%瓊脂糖凝膠鑒定,膠回收,獲得BMX cDNA片段;將BMX cDNA片段插入pCAG-IRES2-AcGFP1-neo載體中,T4連接酶連接,轉(zhuǎn)化,挑單克隆,DNA測序,正確質(zhì)粒載體標記為pCAG-BMX-IRES2-AcGFP1-neo,-80 ℃保存。

參照LipofectamineTM2000說明書,將BMX過表達DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至C-33 A細胞,24 h后,按照1∶10比例接種到10 cm培養(yǎng)皿中,500 μg/mL G418完全培養(yǎng)基進行陽性克隆篩選,10～14 d后,挑單克隆,Western blot鑒定。

(3) 細胞成球?qū)嶒?取對數(shù)生長期細胞,消化,用DMEM/F12培養(yǎng)基清洗一遍,棄上清,干細胞培養(yǎng)液(DMEM/F12作為基礎培養(yǎng)基,添加N2、B27、20 ng/mL EGF和20 ng/mL bFGF)重懸,按照1個細胞每孔的密度接種至96孔板中,每孔120 μL,每隔1 d添加20 μL干細胞培養(yǎng)液。記錄腫瘤球在2周內(nèi)的情況,球徑大于50 μm的球體納入計數(shù)范圍。

(4) 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析 資料經(jīng)統(tǒng)計軟件GraphPad Prism V5.01分析,結(jié)果都以均值±標準差(Mean±SEM)展示,兩組之間單因素分析采用t檢驗,P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BMX在宮頸癌細胞系中的表達

利用免疫細胞化學及Western blot方法檢測BMX在宮頸癌細胞系HeLa、SiHa、C-33 A、HT-3及CaSki中的表達。免疫細胞化學染色顯示,BMX主要在細胞漿中表達,在細胞核中也有部分表達;BMX在HeLa、SiHa、HT-3及CaSki細胞系中高表達,而在C-33 A細胞中低表達(見圖1,上一排為陰性對照,下一排為陽性染色)。Western blot檢測也得出同樣的結(jié)果(見圖2)。

圖1 免疫細胞化學檢測BMX在宮頸癌細胞系中的表達(100×)Fig.1 Immunocytochemistry was used to detect the expression of BMX in cervical cancer cell lines (100×)

2.2 過表達細胞株的獲得

在C-33 A細胞中轉(zhuǎn)染對照及過表達BMX質(zhì)粒載體,G418篩選,挑克隆,Western blot鑒定,結(jié)果見圖3。C-33 A陰性對照及陽性過表達BMX克隆細胞形態(tài)見圖4。

圖2 Western blot檢測BMX在宮頸癌細胞系中的表達Fig.2 Western blot detecting BMX expression in cervical cancer cell lines

2.3 BMX過表達對C-33 A細胞成球能力的影響

對照組(C-AcGFP)與BMX過表達組(C-BMX)的C-33 A細胞在干細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)2周后,成球形狀及大小見圖5。與對照組相比,過表達組球體較為密實,邊界較整齊,球徑較大。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示:對照組和過表達組細胞成球率無明顯差異(見圖6,P>0.05),但是過表達組球體直徑明顯大于對照組(見圖7,P<0.001)。因此,總體來講,過表達BMX可以促進宮頸癌C-33 A細胞的成球能力。

圖3 Western blot鑒定BMX過表達克隆細胞株Fig.3 Western blot detecting BMX hyoerexpression clone cell strains

圖4 BMX對照及過表達克隆株的細胞形態(tài)Fig.4 Morphology of clone cell strains in BMX control group and hyperexpression group

圖5 對照組和BMX過表達組成球形狀及大小(100×)Fig.5 Sphere shape and size in control group and BMX overexpression group (100×) Figure

圖6 統(tǒng)計分析對照組和過表達組細胞成球率(#P>0.05)Fig.6 Statistical analysis of pelletization rate of control group and overexpression group (#P>0.05)

圖7 統(tǒng)計分析對照組和過表達組細胞成球球徑 大小(***P<0.001)Fig.7 Statistical analysis of sphere diameter in control group and overexpression group (***P<0.001)

3 討論

Guryanova等[11]探討了BMX在惡性膠質(zhì)瘤干細胞(GSCs)中特異性表達,shBMX干擾及顯性負向BMX(BMX-DN)可以顯著降低膠質(zhì)瘤干細胞腫瘤球形成的數(shù)量及大小。研究中,我們探索了非受體酪氨酸激酶Etk/BMX對宮頸癌細胞C-33 A細胞成球能力的影響,對照組球體較為松散,而過表達組球體較為密實,邊界整齊,球徑較大(見圖5)。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示:對照組和過表達組細胞成球率無明顯差異(見圖6,P>0.05),主要原因可能是C-33 A轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后對照組與過表達組細胞克隆差異較大(見圖1),C-33 A親本細胞有的是梭形,有的是圓形;轉(zhuǎn)染后(見圖4),對照組細胞克隆株形態(tài)和親本相似,3個克隆株導致標準差大,而轉(zhuǎn)染過表達BMX質(zhì)粒后克隆細胞整體變小,細胞較圓,連接緊密,克隆株個體差異小,因此成球能力較為穩(wěn)定;但是過表達組球體直徑明顯大于對照組(見圖7,P<0.001)。因此,總體來講,過表達BMX后腫瘤細胞成球能力明顯提高。