陳露，嵇晶，金佳穎，鄭麗杰，韓威，王欣之,3*，劉睿,3，吳皓,3*

1(南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京， 210023) 2(江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京， 210023)3(江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京， 210023)

海藻是我國出口創(chuàng)匯的重要海產(chǎn)品，深受國內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛，含有豐富的碘、膳食纖維、蛋白質(zhì)、多糖、多酚、甾醇等營養(yǎng)物質(zhì)和活性物質(zhì)[1-3]，具有潛在的經(jīng)濟(jì)開發(fā)價(jià)值[4-6]。海藻由于細(xì)胞壁的多孔結(jié)構(gòu)及自身機(jī)制極易富集水中的砷，被稱為海洋生態(tài)系統(tǒng)的“砷庫”。砷在自然界存在著不同的形態(tài)，毒性由大到小依次為：亞砷酸根(As3+)>砷酸根(As5+)>一甲基砷(monomethylated arsenic,MMA)>二甲基砷(dimethylated arsenic,DMA)>砷甜菜堿(arsenobetaine,AsB)[7]，無機(jī)砷毒性(As3+和As5+)大于有機(jī)砷(MMA和DMA)，AsB則無毒[8]。因此分析海藻中砷的存在形式及有機(jī)砷、無機(jī)砷的比例，是評(píng)價(jià)海藻是否可食用或藥用的重要參照依據(jù)。

目前砷形態(tài)的分析技術(shù)有很多[9-12]，高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry,HPLC-ICP-MS)具有檢出限低、靈敏度高和線性范圍寬的優(yōu)勢(shì)，已成為目前最常用且有效的方法之一，被廣泛應(yīng)用于不同基質(zhì)[13-16]的砷形態(tài)分析。在分析前需對(duì)樣品進(jìn)行提取，常用提取方法為水[17]、不同比例的甲醇-水[18]、鹽酸[19]、硝酸[20]、酶試劑[21]等提取液結(jié)合超聲提取、微波消解、熱浸提等方法，對(duì)不同的樣品選擇合適的提取方式,保證較高的提取率。不同的方法均有優(yōu)缺點(diǎn)，如酶解法適合蛋白質(zhì)含量較高的肉類；甲醇提取法若濃度過高會(huì)降低儀器的使用壽命；鹽酸中的Cl與Ar形成40Ar35Cl 從而干擾75As的測(cè)定[22],因此選擇合適的提取方法是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。

本研究采用HPLC-ICP-MS技術(shù)以銅藻中5種形態(tài)砷的提取量及總砷提取率為指標(biāo),對(duì)比GB 5009.11—2014[23]及GB/T 23372—2009[24]中規(guī)定的試樣提取方法，對(duì)提取劑濃度、溫度進(jìn)行優(yōu)化，并將優(yōu)化得到的方法對(duì)不同海藻(海帶、裙帶菜、羊棲菜、鼠尾藻)進(jìn)行分析，以期為海藻的食用安全、品質(zhì)把控及標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

各海藻信息如表1所示。亞砷酸根(As3+)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW08666)、二甲基砷(DMA)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW08669)、一甲基砷(MMA)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW08668)、砷酸根(As5+)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW08667)、砷甜菜堿(AsB)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW08670),中國計(jì)量科學(xué)研究院；甲醇(色譜級(jí)),美國天地；HNO3、NH4H2POm4(優(yōu)級(jí)純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他提取用試劑均為國產(chǎn)優(yōu)級(jí)純。

MARS微波消解儀，美國CFM公司；NEXIOH 350D電感耦合等離子體質(zhì)譜儀、Series 200高效液相，美國Perkin Elmer公司。

表1 藻樣品的采集海域、日期及來源Table 1 Sea area,date and source of seaweed samples

1.2 儀器條件

色譜柱為Hamilton PRP-X100(250 mm×4.1 mm，10 μm)陰離子交換色譜柱。體積流量1 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量50 μL；流動(dòng)相A：25 mmol/L NH4H2PO4溶液(氨水調(diào)至pH=8)；流動(dòng)相B：水；梯度洗脫：0～15 min，100%～0%水；16～19 min，0%～100%水；20～24 min，100%水。

ICP-MS條件：高頻等離子體發(fā)射功率，1 550 W；載氣為高純氬氣；同心霧化器；載氣流速0.85 L/min；氣補(bǔ)償氣流量0.15 L/min；采樣深度9.5 mm；采集75As；蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速0.3 r/min。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密稱取AsB、As3+、DMA、MMA、As5+標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，加水配制成1 000 ng/mL (以砷計(jì))的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，加水配制成一系列梯度濃度(均以砷計(jì))的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 總砷的測(cè)定方法

按照GB 5009.268—2016中[25]規(guī)定的“第一法 電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)”進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.2 海藻樣品砷形態(tài)分析

硝酸-熱浸提：按GB 5009.11—2014[23]中規(guī)定的“試樣提取”方法對(duì)銅藻進(jìn)行處理后，進(jìn)HPLC-ICP-MS檢測(cè)。

水-超聲提?。喊碐B/T 23372—2009[24]中規(guī)定的“植物性固體樣品”提取方法對(duì)銅藻進(jìn)行處理后，進(jìn)HPLC-ICP-MS檢測(cè)。

優(yōu)化后提取方法：取適量海藻樣品，加入20倍體積0.30 mol/L硝酸，在100 ℃恒溫箱內(nèi)浸提2.5 h，每隔0.5 h取出振蕩1 min，冷卻至室溫，在8 000 r/min下離心15 min，取上清液過0.45 μm有機(jī)濾膜，進(jìn)HPLC-ICP-MS測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)分析處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)和方差極性檢驗(yàn)，符合兩者檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗(yàn)；不符合則采用Kruskal-Wallis 多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅藻中總砷的含量

通過ICP-MS對(duì)10個(gè)海藻樣品中總砷含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2，不同海藻對(duì)于砷的富集量有顯著差異，各個(gè)海藻中總砷的含量均超出GB 2762—2017《食品中污染物限量》[26]中規(guī)定總砷最高允許限量(0.5 mg/kg)的40～200倍。不同海域同種海藻之間總砷含量存在顯著性差異，如鼠尾藻(S)、裙帶菜(Q)，可能與不同海域受污染程度不同有關(guān)；同個(gè)海域不同采收時(shí)間的海藻中的總砷含量也存在顯著性差異，如海帶(H)、裙帶菜(Q1,Q3)，可能與海藻在海水中富集砷的時(shí)間長短有關(guān)。海藻易富集海水中的砷，砷具有多種不同的形態(tài)，若用總砷評(píng)價(jià)海藻的食用安全顯得十分局限，所以有必要對(duì)海藻中砷形態(tài)進(jìn)行分離，確定有機(jī)砷及無機(jī)砷的比例，從而為評(píng)價(jià)海藻的食用安全提供依據(jù)。

表2 不同海藻中總砷含量的測(cè)定 單位：mg/kg

2.2 提取方法的選擇

本文對(duì)比分析GB 5009.11—2014中規(guī)定的硝酸-熱浸提法和GB/T 23372—2009中規(guī)定的水-超聲提取法對(duì)銅藻中5種形態(tài)砷的提取量的影響，結(jié)果如表3所示。

表3 不同提取方法對(duì)銅藻中5種形態(tài)砷提取量的影響

由表3可知，硝酸-熱浸提對(duì)銅藻中5種形態(tài)砷的提取總量為56.61 mg/kg，其提取率達(dá)71.19%，而水-超聲提取法對(duì)應(yīng)的提取率僅為40.87%；硝酸-熱浸提法能提取得到各種砷形態(tài)，而水-超聲法不能提取得到As3+；硝酸-熱浸提所提取的AsB、As3、As5+含量均明顯高于水-超聲提取法。綜合考慮，選用硝酸-熱浸提法作為海藻砷形態(tài)分析的提取方法。

2.3 提取條件優(yōu)化

2.3.1 最佳提取溫度的確定

在HNO3濃度為0.15 mol/L時(shí)，考察提取溫度分別為70、80、90、100 ℃對(duì)銅藻中5種形態(tài)砷提取量的影響，結(jié)果表4所示。由表4可知，隨著提取溫度的升高銅藻中總砷的提取率呈上升的趨勢(shì)，100 ℃時(shí)提取率達(dá)最大為74.71%； 銅藻中DMA、MMA含量較低，當(dāng)提取溫度為70、80 ℃ 時(shí)，不能提取得到MMA，DMA提取量隨提取溫度的升高其變化趨勢(shì)不明顯，As5+提取量受提取溫度的影響不明顯；AsB和As3+的提取量隨提取溫度增加呈上升的趨勢(shì)，當(dāng)提取溫度達(dá)100 ℃時(shí)，與70 ℃相比AsB、As3+提取量分別上升了53.08%、66.26%。因此本實(shí)驗(yàn)確定最佳提取溫度為100 ℃。

表4 不同提取溫度對(duì)銅藻中5種形態(tài)砷提取量的影響

2.3.2 最佳硝酸濃度的確定

在提取溫度為90 ℃，考察濃度分別為0、0.15、0.30、0.45 mol/L的硝酸溶液對(duì)銅藻中5種形態(tài)砷提取量的影響，結(jié)果如表5所示。

表5 不同硝酸濃度對(duì)銅藻中5種形態(tài)砷提取量的影響

由表5可知，隨著提取液濃度的增加，銅藻中總砷的提取率呈先上升后降低的趨勢(shì)；當(dāng)HNO3濃度為0.30 mol/L時(shí)，總砷提取率最高為86.09%，且在該濃度下，AsB、As3+、MMA提取量均最高；DMA提取量整體變化趨勢(shì)均不明顯，As5+的提取量隨濃度的升高而增加；在HNO3濃度為0.45 mol/L時(shí),As3+的提取量降低，而As5+的提取量上升，可能是HNO3濃度過高使低價(jià)的As3+氧化為高價(jià)態(tài)的As5+；綜上,選擇HNO3溶液濃度為0.3 mol/L為最佳濃度。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性關(guān)系考察

將一系列不同質(zhì)量濃度的5種形態(tài)砷的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述色譜條件取50 μL進(jìn)HPLC-ICP-MS分析，測(cè)定結(jié)果以各形態(tài)砷的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，以響應(yīng)值為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程見表6。

表6 五種形態(tài)砷的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)Table 6 Linear ranges,regression equations andcorrelation coefficients of the five arsenic species

2.4.2 精密度、重復(fù)性及加標(biāo)回收率考察

取質(zhì)量濃度為100 ng/mL各形態(tài)砷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)在HPLC上進(jìn)樣6次，計(jì)算RSD值,AsB、As3+、DMA、MMA、As5+的RSD分別為1.56%、2.22%、1.58%、1.60%、5.79%。取適量銅藻粉末，按硝酸-熱浸提的提取條件進(jìn)行處理，共6份，進(jìn)HPLC分析，計(jì)算RSD值，AsB、As3+、DMA、MMA、As5+的RSD分別為3.74%、8.42%、12.64%、8.86%、2.66%。取銅藻樣品6份，分別加入砷標(biāo)準(zhǔn)混合溶液適量，按優(yōu)化后的提取條件進(jìn)行處理，計(jì)算加標(biāo)回收率，5種形態(tài)砷的平均回收率為79.50%～115.73%，RSD均低于15%。

2.5 海藻中5種形態(tài)砷含量測(cè)定

按優(yōu)化后的方法對(duì)不同海藻中5種形態(tài)砷含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表7所示。5種海藻中DMA、MMA含量均較低，毒性較大的無機(jī)砷在5種海藻中占比各有不同。T1銅藻中以As5+含量最高，無毒性的AsB次之，DMA含量最低，其中無機(jī)砷占總砷含量的58.39%，僅次于Y1羊棲菜。海帶(H)、裙帶菜(Q)中無機(jī)砷占比較低，約占總砷含量的15%，主要以無毒性的AsB形式存在，這與常家琪[27]、高繼慶[28]的研究一致；Q2裙帶菜中無機(jī)砷的占比低于T1銅藻及Y1羊棲菜(P<0.05)；Y1羊棲菜中AsB的占比低于Q2裙帶菜及H1海帶(P<0.05)；羊棲菜(Y)砷主要以毒性較大的無機(jī)砷形式存在，占提取總砷的50%～60%，與文獻(xiàn)研究[29-30]一致；鼠尾藻中無機(jī)砷約占提取總砷的40%。按我國現(xiàn)行農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1709—2011《綠色食品 藻類及其制品》[31]中規(guī)定藻類中無機(jī)砷限量應(yīng)≤1.5 mg/kg，則所測(cè)的海藻樣品中無機(jī)砷含量均超標(biāo)，其中銅藻、羊棲菜、鼠尾藻嚴(yán)重超標(biāo)，海帶、裙帶菜超標(biāo)量較少。

表7 不同海藻中5種形態(tài)砷的含量測(cè)定

100 ng/mL的5種形態(tài)砷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)，銅藻(T1)、海帶(H2)、鼠尾藻(S1)、羊棲菜(Y1)、裙帶菜(Q3)的色譜圖見圖1。從圖1可知，各形態(tài)砷峰形尖銳且能完全分離，靈敏度較高，說明該方法滿足海藻砷形態(tài)分析的要求。

1-AsB；2-As3+；3-DMA；4-MMA；5-As5+圖1 100 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)及編號(hào)為T1、H2、S1、Y1、Q3海藻中5種砷形態(tài)色譜圖Fig.1 Chromatograms of the five arsenic species in 100 ng/mL mixed standard solution (A) and T1,H2,S1,Y1,Q3 seaweed

3 結(jié)論與討論

本研究建立了海藻中AsB、As3+、DMA、MMA和As5+等5種砷形態(tài)分析測(cè)定的HPLC-ICP-MS方法，并進(jìn)行優(yōu)化，確定以0.3 mol/L硝酸溶液為提取劑，樣品在提取溫度為100 ℃條件下提取為最優(yōu)條件，該提取方法操作簡便、快捷，總砷提取率較高；用所建立的分析方法對(duì)銅藻、海帶、裙帶菜、鼠尾藻、羊棲菜進(jìn)行分析。結(jié)果表明，銅藻中以As5+含量最高，無毒性的AsB含量次之，DMA含量最低，其中毒性大的無機(jī)砷占提取總砷含量的58.39%；海帶、裙帶菜中砷化合物主要以無毒性的AsB形式存在；羊棲菜、鼠尾藻中無機(jī)砷占比分別約為50%～70%、40%；各海藻中毒性大的無機(jī)砷均超過NY/T 1709—2011《綠色食品 藻類及其制品》中規(guī)定的最高允許限量，其中銅藻、羊棲菜、鼠尾藻超標(biāo)嚴(yán)重。

海藻中無機(jī)砷超標(biāo)嚴(yán)重，其食用安全性引起消費(fèi)者的關(guān)注。但目前對(duì)攝入海藻后不同形態(tài)砷化合物在體內(nèi)代謝途徑的探討不夠深入，且對(duì)海藻無機(jī)砷的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估還不完善，后續(xù)應(yīng)對(duì)砷化合物的毒理學(xué)評(píng)價(jià)及風(fēng)險(xiǎn)分析進(jìn)行深入研究，同時(shí)加強(qiáng)對(duì)海藻中無機(jī)砷含量的監(jiān)測(cè)，為科學(xué)指導(dǎo)海藻的食用安全提供依據(jù)。