吳永祥，吳麗萍，樸銀美，金泰完*

1(黃山學(xué)院 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽 黃山，245041) 2(安東國(guó)立大學(xué) 食品科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，慶尚北道 安東，760749)

豆?jié){、豆干、豆腐等大豆食品深受人們喜愛(ài)，然而在大豆食品加工過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生大量的豆渣副產(chǎn)物，目前我國(guó)每年約產(chǎn)生2 000多萬(wàn)噸濕豆渣[1]。經(jīng)研究分析，豆渣具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，富含膳食纖維、蛋白質(zhì)、維生素、微量元素、多糖、異黃酮和總酚等生物活性物質(zhì)[2-3]。現(xiàn)代研究表明，食用豆渣能顯著降低血液中膽固醇的含量，改善2型糖尿病患者的胰島素敏感性，并具有預(yù)防高血壓、腸癌等功效[4-5]。目前，豆渣被越來(lái)越多的國(guó)家作為新的保健食品原料，然而我國(guó)豆渣由于缺乏經(jīng)濟(jì)易行的加工方法，限制其在食品加工中的應(yīng)用，大部分只作為廢渣或飼料處理，造成了生態(tài)環(huán)境的污染及資源的極大浪費(fèi)[6]。

微生物發(fā)酵技術(shù)經(jīng)濟(jì)易行，可提高食品的營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味，一直被廣泛應(yīng)用于食品的生產(chǎn)和加工過(guò)程中。近年來(lái)，研究者以豆渣為基質(zhì)，接種不同菌種進(jìn)行了微生物發(fā)酵的諸多研究：李艷芳等[7]利用黑曲霉和米曲霉發(fā)酵豆渣，降低了豆渣粒度分布進(jìn)而改善其口感、增加可食性；王慧等[8]用根霉、毛霉和米曲霉菌對(duì)豆渣進(jìn)行發(fā)酵，豆渣中蛋白酶活力和淀粉酶活力較發(fā)酵前顯著增加，豆渣營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到明顯提高；VONG等[9]利用解脂耶氏酵母發(fā)酵豆渣，不溶性膳食纖維降低了33%，游離氨基酸提高了254%，游離酚酸提高了197%，豆渣的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及風(fēng)味得到改善；朱運(yùn)平等[10]以枯草芽孢桿菌、納豆桿菌和少孢根霉為菌種發(fā)酵豆渣，提高了豆渣中蛋白質(zhì)含量，顯著增強(qiáng)豆渣ABTS陽(yáng)離子自由基與DPPH自由基的清除能力；LI等[11]以羊肚菌為發(fā)酵菌種對(duì)豆渣進(jìn)行固體發(fā)酵，發(fā)酵后豆渣多糖具有顯著的抗癌與免疫調(diào)節(jié)作用。由此可見(jiàn)，微生物在豆渣發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的高活性酶系和功效成分，有利于改善口感、提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，增強(qiáng)發(fā)酵后豆渣的生物活性。云芝、靈芝和杏鮑菇等作為一類藥(食)用真菌，對(duì)人體多種疾病有預(yù)防和一定程度的治療作用[12]。目前缺乏藥(食)真菌對(duì)豆渣進(jìn)行固體發(fā)酵的深入研究。本實(shí)驗(yàn)以豆渣為原料，篩選出豆渣固體發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)藥(食)真菌，分析云芝、靈芝和杏鮑菇發(fā)酵前后豆渣中主要生物活性物質(zhì)含量的變化，并對(duì)其體外抗氧化、α-葡萄糖苷酶抑制活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為豆渣的品質(zhì)改良提供技術(shù)依據(jù)，并作為一個(gè)例證，為藥(食)真菌固體發(fā)酵在食品加工中應(yīng)用提供了一個(gè)思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豆渣，熱加工豆?jié){后的剩余物，樣品含水率為72.17%。10種藥(食)真菌，韓國(guó)微生物培養(yǎng)中心(Korea Culture Center of Microorganisms,KCCM)。α-葡萄糖苷酶、阿卡波糖、DPPH、牛血清白蛋白、ABTS等，美國(guó)sigma公司；總膳食纖維檢測(cè)試劑盒，愛(ài)爾蘭Megazyme公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基、麥芽浸出液瓊脂(Malt)培養(yǎng)基、酵母麥芽糖(yeast malt,YM)培養(yǎng)基、酵母粉、蛋白胨等，美國(guó) BD Difco 公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Liflus GX型實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵罐，韓國(guó)Biotron公司；CleanVac 8型冷凍干燥機(jī)，韓國(guó)Hanil公司；Systec V型立式高壓滅菌器，德國(guó)Systec公司；SpectraMax-190型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化和菌懸液的制備

將保藏的云芝、靈芝和杏鮑菇等10種發(fā)酵菌株分別接種于相應(yīng)平板培養(yǎng)基上，于24～26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待菌種長(zhǎng)滿平板后，分別用打孔器打取直徑為 6 mm的菌苔接種于相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，于最適宜的條件下培養(yǎng)7 d(見(jiàn)表1)。培養(yǎng)后，可見(jiàn)各菌種顆粒大小均勻，培養(yǎng)液澄清透明，并用高速攪拌機(jī)在10 000 r/min轉(zhuǎn)速下攪拌10 s，即得到均勻的菌懸液[13-14]。

表1 不同藥(食)真菌的培養(yǎng)條件Table 1 Culture conditions of various medicinal andedible fungi

1.3.2 豆渣固體發(fā)酵及菌質(zhì)生長(zhǎng)直徑的測(cè)定

將新鮮豆渣置于121 ℃高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌15 min。取滅菌后的豆渣于2 L發(fā)酵罐中，分別以5%的接種量接種制備好的云芝、靈芝和杏鮑菇等10種藥(食)真菌菌懸液。于3、5、7、10、14 d分別測(cè)定豆渣固體發(fā)酵過(guò)程中各菌質(zhì)的生長(zhǎng)直徑。設(shè)立未發(fā)酵豆渣組，即接種等體積滅菌蒸餾水。

1.3.3 固體發(fā)酵前后豆渣中酶活力的測(cè)定

將云芝、靈芝和杏鮑菇固體發(fā)酵完全的豆渣分別冷凍干燥，粉碎過(guò)40目篩，得各豆渣粉末。取2.5 g樣品，加0.1 mol/L pH 6.0的檸檬酸緩沖溶液50 mL，充分?jǐn)嚢?0 min。在4 ℃、10 000 r/min條件下離心20 min，取上清液，即為粗酶液。淀粉酶活力測(cè)定參照二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)試劑法[8]，其中淀粉酶活力(U)單位定義為在37 ℃下，每分鐘水解生成1 μg葡萄糖所需的酶質(zhì)量。蛋白酶活力測(cè)定參照福林試劑法[6]，其中蛋白酶活力(U)單位定義為在40 ℃下，每分鐘水解生成1 μg酪氨酸所需的酶質(zhì)量。纖維素酶活力測(cè)定參照羧甲基纖維素(sodium carboxymethyl cellulose,CMC)糖化力法[6]，其中纖維素酶活力(U)單位定義為在37 ℃下，每分鐘水解生成1 μg葡萄糖所需的酶質(zhì)量。

1.3.4 膳食纖維含量的測(cè)定

總膳食纖維(total dietary fiber,TDF)、可溶性膳食纖維(soluble dietary fiber,SDF)、不溶性膳食纖維(insoluble dietary fiber,IDF)的測(cè)定采用Megazyme試劑盒，操作方法參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3.5 豆渣醇提物的制備及提取效率的測(cè)定

取發(fā)酵前后的豆渣粉末100.0 g，加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇1 000 mL，于180 r/min條件下震蕩提取4 h，過(guò)濾后收集上清液，剩余殘?jiān)诎凑丈鲜鰲l件提取2次，合并3次上清液，減壓濃縮后冷凍干燥成粉末，即得固體發(fā)酵前后的豆渣醇提物。按公式(1)計(jì)算各提取物的提取效率：

(1)

式中：Y表示各提取物的提取效率，%；m1為各提取物濃縮干燥后的重量，g；m0為各原料的質(zhì)量，100.0 g。

1.3.6 豆渣醇提物理化指標(biāo)的測(cè)定

將制備好的各豆渣醇提物，測(cè)定理化指標(biāo)。蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[15]；游離氨基酸含量的測(cè)定采用茚三酮法[16]；總糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法[17]；還原糖含量的測(cè)定采用DNS法[6]；總酚含量的測(cè)定采用Folin- Ciocalteu比色法[18]。

1.3.7 豆渣醇提物抗氧化活性的測(cè)定

ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力的測(cè)定采用文獻(xiàn)[19]報(bào)道的方法；DPPH自由基清除能力的測(cè)定采用文獻(xiàn)[20]報(bào)道的方法；亞鐵離子螯合能力的測(cè)定采用文獻(xiàn)[21]報(bào)道的方法。固體發(fā)酵前后豆渣醇提物的抗氧化能力以半數(shù)抑制率IC50表示，IC50指的是清除率為50%時(shí)，所需要樣品的有效質(zhì)量濃度。

1.3.8 豆渣醇提物α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[22]方法并加以改進(jìn)，向96孔板中加入50 μL不同質(zhì)量濃度(3.75、7.5、15 mg/mL)固體發(fā)酵前后的豆渣醇提物、90 μL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)以及10 μL 1 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，混勻后于37 ℃恒溫反應(yīng)5 min。然后加入50 μL 5 mmol/L對(duì)硝基苯酚α-D-吡喃葡萄糖苷溶液，充分混勻后反應(yīng)20 min后，于酶標(biāo)儀405 nm處測(cè)定吸光值。以1 mg/mL阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照，每樣重復(fù)3次，取平均值，并按公式(2)計(jì)算α-葡萄糖苷酶活性的抑制率：

(2)

式中：AS為樣品組吸光值；ASB為50 μL醇提物與10 μL磷酸鹽緩沖液(替代α-葡萄糖苷酶溶液)的樣品對(duì)照組吸光值；AC為50 μL二甲基亞砜(樣品溶劑)與10 μL α-葡萄糖苷酶溶液的空白組吸光值；ACB為50 μL二甲基亞砜與10 μL磷酸鹽緩沖液的空白對(duì)照組吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Origin 8.5軟件作圖。應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析中的Duncan’s多重比較法分析數(shù)據(jù)間的顯著差異，P<0.05表示顯著性差異；采用Pearson’s法分析發(fā)酵前后豆渣醇提物的總酚物質(zhì)含量與其抗氧化、α-葡萄糖苷酶抑制活性之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆渣固體發(fā)酵優(yōu)勢(shì)菌種的篩選

豆渣經(jīng)10種藥(食)真菌固體發(fā)酵后，各菌質(zhì)的生長(zhǎng)變化如表2所示。在生長(zhǎng)前期(0～10 d)，相比于其他菌種，云芝、靈芝和杏鮑菇的菌絲體生長(zhǎng)速度快，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，菌絲體均呈發(fā)散狀向四周擴(kuò)展，菌絲數(shù)量逐步增多，逐步形成菌絲束。如圖1所示，至第10天時(shí)，豆渣表面被各菌絲完全覆蓋，顏色潔白，云芝、靈芝和杏鮑菇菌質(zhì)的生長(zhǎng)直徑分別達(dá)到了(29±1.4)、(30±0.0)、(28±0.3) cm，表明3種藥(食)真菌能充分利用豆渣進(jìn)行固體發(fā)酵。在生長(zhǎng)后期(10～14 d)，云芝、靈芝和杏鮑菇的菌絲數(shù)量進(jìn)一步增加但生長(zhǎng)速度減緩，菌絲體潔白濃密，部分菌絲因缺氧導(dǎo)致菌質(zhì)與發(fā)酵壁分離，基內(nèi)菌絲發(fā)生自溶，并伴有水珠產(chǎn)生。從菌種生長(zhǎng)狀態(tài)和發(fā)酵周期綜合考慮，選定云芝、靈芝和杏鮑菇為優(yōu)勢(shì)菌種進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，確定10 d為最適發(fā)酵時(shí)間。

表2 發(fā)酵過(guò)程中不同藥(食)真菌菌質(zhì)的生長(zhǎng)直徑變化 單位：cm

NF-未發(fā)酵組；CV-云芝發(fā)酵組；GL-靈芝發(fā)酵組；PE-杏鮑菇發(fā)酵組(下同)圖1 發(fā)酵前后豆渣中不同藥(食)真菌的生長(zhǎng)變化Fig.1 Changes in the growth of native and fermentedokara with various medicinal and edible fungi

2.2 不同菌種發(fā)酵前后豆渣中酶活力變化

選用云芝、靈芝和杏鮑菇對(duì)豆渣進(jìn)行固體發(fā)酵，比較發(fā)酵前后豆渣中的淀粉酶活力、蛋白酶活力和纖維素酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖2。未發(fā)酵豆渣中淀粉酶活力較低，僅為3.00 U/g，經(jīng)云芝、靈芝和杏鮑菇發(fā)酵后，淀粉酶活力得到顯著增加(P<0.05)，分別為(211.80±11.57)、(187.80±12.77)、(180.60±12.25) U/g。相比于未發(fā)酵豆渣組，3種藥(食)真菌發(fā)酵后豆渣中蛋白酶活力、纖維素酶活力得到顯著性提高(P<0.05)，其中靈芝發(fā)酵后豆渣中蛋白酶活力、纖維素酶活力較云芝、杏鮑菇發(fā)酵組的高。結(jié)果表明，3種藥(食)真菌在發(fā)酵豆渣過(guò)程中能產(chǎn)生高活性的淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶，有利于提高發(fā)酵后豆渣的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，改善豆渣的功能活性[23-24]。

圖2 發(fā)酵前后豆渣中酶活力變化Fig.2 Changes in enzyme activity of native and fermented okara注：不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3 不同菌種發(fā)酵前后豆渣中膳食纖維含量變化

由圖3可知，未發(fā)酵豆渣中TDF含量很高，占豆渣干質(zhì)量的76.15%，其中主要成分是IDF，含量為71.32%，而SDF含量相對(duì)較低，僅為4.82%。云芝、靈芝和杏鮑菇固體發(fā)酵后豆渣中IDF含量顯著降低，分別為51.75%、28.53%、42.92%，而SDF含量顯著提高(P<0.05)。未發(fā)酵豆渣組的IDF/SDF比值為14.79，經(jīng)云芝、靈芝和杏鮑菇發(fā)酵后，IDF/SDF比值分別降低到6.87、4.38、5.01。結(jié)果表明，3種藥(食)真菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的纖維素酶，能將IDF水解成SDF，造成IDF/SDF值的降低，且IDF/SDF值的變化與纖維素酶活力變化規(guī)律基本一致。

圖3 發(fā)酵前后豆渣中膳食纖維含量變化Fig.3 Changes in dietary fiber contents of native andfermented okara

2.4 不同菌種發(fā)酵前后豆渣醇提物的主要活性物質(zhì)含量變化

由表3可知，云芝、靈芝和杏鮑菇固體發(fā)酵后豆渣醇提物的提取效率顯著高于未發(fā)酵豆渣(P<0.05)，其提取效率分別為12.84%、38.31%、33.27%，而未發(fā)酵豆渣的提取效率僅為5.74%。云芝、靈芝和杏鮑菇固體發(fā)酵后豆渣醇提物的蛋白質(zhì)、游離氨基酸、總糖、還原糖、總酚含量較發(fā)酵前均顯著性增加(P<0.05)，其中總酚含量分別達(dá)到了(0.42±0.01)、(1.48±0.81)、(0.81±0.02) mg/g，而未發(fā)酵豆渣中總酚含量?jī)H為(0.02±0.01) mg/g。靈芝發(fā)酵后豆渣的主要活性物質(zhì)含量較云芝、杏鮑菇發(fā)酵組的高(P<0.05)。結(jié)果表明，云芝、靈芝和杏鮑菇在豆渣固體發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生高活性的淀粉酶、蛋白酶以及纖維素酶等，可將豆渣中的淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素等大分子酶解成還原糖、功能性小肽和氨基酸，并且可以促進(jìn)豆渣中一些結(jié)合狀態(tài)的生物活性成分的釋放[25-26]。發(fā)酵后豆渣中蛋白質(zhì)、游離氨基酸、總糖、總酚等物質(zhì)含量的變化與ORTS等[27]、申春莉等[28]的研究結(jié)果基本一致。

表3 發(fā)酵前后豆渣醇提物的提取效率及主要活性物質(zhì)含量Table 3 Extraction yields and the main active substances contents in native and fermented okara ethanol extracts

2.5 不同菌種發(fā)酵對(duì)豆渣醇提物抗氧化活性的影響

由表4可知，云芝、靈芝和杏鮑菇固體發(fā)酵后豆渣醇提物的DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力以及亞鐵離子螯合能力較發(fā)酵前均顯著性提高(P<0.05)，其中DPPH自由基清除作用的IC50值分別為(5.66±0.08)、(3.63±0.04)、(4.72±0.01) mg/mL，而未發(fā)酵豆渣的IC50值為(9.50±0.07) mg/mL。3種藥(食)真菌固體發(fā)酵對(duì)豆渣醇提物抗氧化活性的影響差異顯著(P<0.05)，其中抗氧化能力排序?yàn)殪`芝發(fā)酵組>杏鮑菇發(fā)酵組>云芝發(fā)酵組>未發(fā)酵組。結(jié)果表明，3種藥(食)真菌均能顯著提高發(fā)酵后豆渣的抗氧化活性，這可能與發(fā)酵過(guò)程中豆渣中的總酚、異黃酮等生物活性物質(zhì)含量的增加有關(guān)[29-30]。

表4 發(fā)酵前后豆渣醇提物的抗氧化活性Table 4 Antioxidant activity of native and fermentedokara ethanol extracts

2.6 不同菌種發(fā)酵對(duì)豆渣醇提物α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

α-葡萄糖苷酶抑制劑可以通過(guò)抑制α-葡萄糖苷酶的活性，抑制食物中碳水化合物的水解，延緩或減少葡萄糖在腸道中的吸收，從而有效降低餐后高血糖，往往作為改善和治療高血糖、2型糖尿病的一類藥物[31]。圖4結(jié)果顯示，發(fā)酵與未發(fā)酵豆渣醇提物對(duì)α-葡萄糖苷酶均有一定的抑制作用，且隨著樣品質(zhì)量濃度增加，α-葡萄糖苷酶抑制能力增強(qiáng)。3種藥(食)真菌發(fā)酵后豆渣醇提物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用效果較未發(fā)酵豆渣顯著提高(P<0.05)。當(dāng)質(zhì)量濃度為15 mg/mL時(shí)，未發(fā)酵豆渣醇提物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率為35.76%，而經(jīng)云芝、靈芝和杏鮑菇固體發(fā)酵后的抑制率分別為62.25%、77.45%、47.91%。發(fā)酵后豆渣的α-葡萄糖苷酶抑制活性顯著提高，與朱運(yùn)平等[32]的研究結(jié)果一致，表明微生物發(fā)酵能促進(jìn)豆渣中異黃酮、皂苷等生物活性成分的釋放，從而提高發(fā)酵后豆渣α-葡萄糖苷酶的抑制作用效果。

圖4 發(fā)酵前后豆渣醇提物的α-葡萄糖苷酶抑制活性Fig.4 α-Glucosidase inhibitory activity of native andfermented okara ethanol extracts

2.7 發(fā)酵前后豆渣醇提物總酚物質(zhì)含量與其抗氧化、α-葡萄糖苷酶抑制能力的相關(guān)性分析

由表5可知，發(fā)酵前后豆渣醇提物的總酚含量與DPPH自由基清除能力、ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力以及亞鐵離子螯合能力呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性(P<0.05)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.982、0.951、0.956，表明發(fā)酵后豆渣醇提物的總酚含量越高，其體外抗氧化能力越強(qiáng)。但發(fā)酵前后豆渣醇提物的總酚含量與α-葡萄糖苷酶抑制能力無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)，表明3種藥(食)真菌發(fā)酵后豆渣中還存在著其他生物活性物質(zhì)，如異黃酮、皂苷等，需進(jìn)一步深入分析，以明確發(fā)酵后豆渣中的α-葡萄糖苷酶抑制作用活性成分。

表5 發(fā)酵前后豆渣醇提物總酚物質(zhì)含量與其抗氧化、α-葡萄糖苷酶抑制能力的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis between total phenoliccontents and antioxidant,α-glucosidase inhibitory activitiesof native and fermented okara ethanol extracts

3 結(jié)論

經(jīng)云芝、靈芝和杏鮑菇3種藥(食)真菌固體發(fā)酵后，豆渣的總膳食纖維、不溶性膳食纖維含量減少，可溶性膳食纖維、蛋白質(zhì)、游離氨基酸、還原糖、總酚等主要活性物質(zhì)含量增加，這與發(fā)酵后豆渣中的淀粉酶活力、蛋白酶活力和纖維素酶活力顯著提高有關(guān)。與未發(fā)酵豆渣相比，3種藥(食)真菌固體發(fā)酵后豆渣醇提物表現(xiàn)出更為顯著的DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力、亞鐵離子螯合能力以及α-葡萄糖苷酶抑制能力，其中靈芝發(fā)酵后豆渣的生物功效更為突出。相關(guān)性分析結(jié)果表明，發(fā)酵前后豆渣醇提物的總酚物質(zhì)含量與其抗氧化能力有較好的相關(guān)性，是其主要抗氧化物質(zhì)。本研究揭示了云芝、靈芝和杏鮑菇固體發(fā)酵能有效改善豆渣的可食用性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，顯著提高了發(fā)酵后豆渣的生物功效，為豆渣的功能性食品開(kāi)發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。