自組裝多肽水凝膠對百里香精油的控釋作用、抑菌和抗氧化效果的延長作用

趙夢倩,張雅丹,王迎香,劉 娜,張 楠,簡家鈺,張 琳,,張繼紅,2,

（1.特醫(yī)食品加工湖南省重點實驗室,稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實驗室,中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖南 長沙 410004；2.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院,湖南 長沙 410117）

百里香精油是百里香經(jīng)過水蒸氣蒸餾所得的油狀產(chǎn)品[1-2],主要含有醇、酯、酚、單萜等揮發(fā)性成分[3-5]。百里香精油在防腐、提高免疫力、抗癌、抗病毒、止痛、抗氧化、延緩衰老等方面具有極高的藥用價值[6-7]。但其自身穩(wěn)定性較差,極易揮發(fā),且提取的高濃度百里香精油帶有一定的刺激性氣味,使得百里香精油在食品中的應(yīng)用受到極大限制[8-11]。對百里香精油進行包埋并控制其釋放,是目前解決該問題的主要途徑。目前主要的包埋材料有環(huán)糊精或食品膠[12-13]。近年來也有新的包埋材料出現(xiàn),比如以啤酒廢酵母為包埋材料制備百里香精油微膠囊,精油與酵母質(zhì)量比為2∶1,60 ℃下包埋10 h,包埋率為86.71%,該微膠囊可以有效抑制百里香精油的揮發(fā)[14]。海藻酸鈉復(fù)合殼聚糖也被作為百里香精油的包埋材料,該方法可有效縮短包埋時間,精油和包材質(zhì)量比為1∶2時,pH 3、40 ℃下包埋20 min,包埋率可達到85.17%[15]。雖然這些方法都具有較高的包埋率（85%以上）,有一定的抑制百里香精油揮發(fā)或者緩慢釋放精油的效果,但是大多制備工藝復(fù)雜且不能有效控制百里香精油在不同環(huán)境中的釋放。

多肽水凝膠是以多肽分子為凝膠因子來束縛水分子,從而形成的半固體透明狀凝膠[16]。相比于其他傳統(tǒng)的包埋材料,具有生物相容性好、易于合成及pH值響應(yīng)等優(yōu)點[17-18]。目前多肽水凝膠多用于藥物的控制釋放。Briuglia等[19]利用可在生理條件下自組裝成水凝膠的RADA16多肽包裹親脂性的藥物吲哚洛爾、奎寧和馬來酸噻嗎洛爾,具有良好的緩釋效果。Baral等[20]利用化學(xué)改性三肽Boc-AUDA-PhePhe-COOH為包埋材料實現(xiàn)對VB12和萬古霉素的緩釋作用。Raza等[21]用具有高pH值敏感性的FER-8肽自組裝成納米水凝膠,利用腫瘤部位的pH值敏感性實現(xiàn)對腫瘤藥物紫杉醇在小鼠體內(nèi)的靶向釋放,達到抑制腫瘤生長的作用。但是目前利用多肽水凝膠實現(xiàn)對精油類物質(zhì)進行控釋的研究還鮮有報道。

本課題組前期利用N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸（N-FMoc-L-phenylalanine,Fmoc-F）水凝膠包埋大蒜精油和丁香精油,包埋率都可達90%以上,并且Fmoc-F水凝膠對包埋的精油具有控制釋放的作用,但其成膠機制與結(jié)構(gòu)還鮮有研究[22-23]。因此,本實驗利用Fmoc-F為水凝膠因子,將具有抑菌效果的百里香精油作為包埋物,利用流變儀、圓二色譜、近紅外光譜等技術(shù)研究其成膠機制及凝膠特性,通過多肽水凝膠的分解實驗、抑菌實驗、抗氧化實驗研究多肽水凝膠的pH值響應(yīng)性及其對丁香精油的包埋控釋作用、抑菌和抗氧化效果的延長作用,為精油類物質(zhì)提供新型、廉價、生物相容性好的有效控釋包埋材料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百里香精油 江西鑫森天然植物油有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli） 南京便診生物科技有限公司；Fmoc-F（純度＞99%） 吉爾生化（上海）有限公司；葡萄糖酸內(nèi)酯（純度＞99%） 美國Sigma-Aldrich公司；香豆素-3-羧酸（coumarin-3-carboxylic acid,CCA）（純度＞99%） 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004B電子分析天平（精度0.000 1 g） 上海佑科儀器儀表有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇凈集團宿州安泰空氣技術(shù)有限公司；UV-1800紫外-可見分光光度計、SM-7800F型掃描電子顯微鏡、IRTracer-100型傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司；SHZ-D(III)循環(huán)水真空泵 上海精密科學(xué)儀器有限公司；G154DWS高壓滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；XMTE-8112水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；WH-3微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司；DH4000BII電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司；IS-RDD3恒溫振蕩器 鄭州南北儀器有限公司；PHS-3C型pH計 上海儀電科學(xué)儀器有限責(zé)任公司；J-815圓二色譜儀 日本Jasco公司；DHR-2型流變儀 美國TA公司；LGJ-10真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；F4600熒光色譜儀 日本日立高新技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 Fmoc-F水凝膠的制備

在1.5 mL超純水中加入15 mg Fmoc-F粉末,混勻后加入0.5 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液,于40 ℃的恒溫水浴鍋中加熱15 min使固體物質(zhì)完全溶解,再將3 mg葡糖酸內(nèi)酯加入混合液中,于超聲波清洗機中振蕩1 min,靜置30 min待其形成水凝膠。

1.3.2 Fmoc-F/百里香精油水凝膠的制備

與1.3.1節(jié)方法一致,但加入NaOH溶液后,再加入40 μL的百里香精油。

1.3.3 Fmoc-F水凝膠包埋精油前后的流變學(xué)表征

實驗選用平行板流變儀測量,平板夾具直徑40 mm。按照1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)方法制備包埋百里香精油前后的Fmoc-F水凝膠,成膠前取適量液體快速滴于流變儀夾具上,夾具邊緣加一圈硅油,防止在測試中樣品水分蒸發(fā)。設(shè)置好參數(shù)測定樣品儲能模量（G'）和耗能模量（G''）。其中,成膠流變學(xué)測定參數(shù)：平行板間隙1 mm、應(yīng)變0.2%、頻率1 Hz、溫度37 ℃、時間0～10 000 s。動態(tài)黏彈性測定參數(shù)：測量間隙1 mm、應(yīng)變0.2%、溫度37 ℃、掃描頻率0.1～10 Hz。

1.3.4 Fmoc-F水凝膠包埋精油前后的結(jié)構(gòu)表征

1.3.4.1 圓二色光譜測定

用純水將樣品稀釋至約0.05 mg/mL。取少量溶液于1 mm石英比色皿并測定。參數(shù)：掃描波長190～350 nm,頻帶寬度2.5 nm,掃描速率50 nm/min,分辨率0.1 nm。

1.3.4.2 傅里葉變換紅外光譜測定

將水凝膠干燥粉碎,按樣品和KBr質(zhì)量比1∶100在瑪瑙研缽中磨成粉末,其少量粉末壓片,采用傅里葉變換紅外光譜儀測定,分辨率為4 cm-1,掃描波數(shù)400～4 000 cm-1。以KBr壓片為背景校零。

1.3.5 掃描電子顯微鏡觀察

將水凝膠樣品滴加在硅片上,成膠后用液氮極速冷凍,迅速放入冷凍干燥機中凍干。將干燥的水凝膠樣品安放在金屬臺上,噴金、干燥后用掃描電子顯微鏡觀察樣品。

1.3.6 不同pH值環(huán)境下Fmoc-F的分解率測定

利用KH2PO4與Na2HPO4配制pH值分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液,配制6 份1 mL的Fmoc-F水凝膠,分別加于1.5 mL不同pH值的磷酸鹽緩沖液中,置于37 ℃的恒溫水浴鍋中,并分別在20、40、60、100、140、180 min時取300 μL樣品溶液,將其稀釋10 倍后于264 nm波長處測定吸光度,實驗平行測定3 次后取平均值,再根據(jù)公式（1）計算Fmoc-F水凝膠的分解率。

式中：A0為Fmoc-F水凝膠完全溶解于水中,溶液在264 nm波長處的吸光度；A1為Fmoc-F水凝膠在不同pH值溶液中水浴后在264 nm波長處的吸光度。

1.3.7 百里香精油標準曲線的繪制

將100 μL的百里香精油用體積分數(shù)95%乙醇溶液稀釋1 000 倍后,繼續(xù)稀釋成質(zhì)量濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 μL/mL的標準液。以體積分數(shù)95%的乙醇溶液為背景,測定各標準溶液在274 nm波長處的吸光度,每個質(zhì)量濃度平行測定3 次后取平均值。以274 nm波長處的吸光度為縱坐標,百里香精油體積分數(shù)為橫坐標,繪制百里香精油標準曲線,得到線性方程：y＝46.256x-0.048 9（R2＝0.998 7）。

1.3.8 Fmoc-F水凝膠包埋百里香精油的包埋率測定

用體積分數(shù)95%乙醇溶液沖洗包埋40 μL百里香精油的Fmoc-F水凝膠的表面,并將沖洗所得的液體稀釋定容到100 mL,再吸取2 mL溶液稀釋5 倍后,于276 nm波長處測定吸光度。將吸光度代入線性方程得到Fmoc-F水凝膠表面含油量,再根據(jù)公式（2）計算百里香精油的包埋率[22]。

1.3.9 Fmoc-F/百里香精油多肽水凝膠的抑菌實驗

將4 個250 mL的錐形瓶編號A、B、C、D,同時制備LB液體培養(yǎng)基和大腸桿菌菌懸液,滅菌備用。在無菌條件下分別向4 個錐形瓶中加入40 mL LB液體培養(yǎng)基和100 μL菌懸液[23]。其中,向A中加入6.12 mL無菌水,作為空白組；向B中加入6 mL Fmoc-F水凝膠和120 μL無菌水；向C中加入6 mL Fmoc-F水凝膠和120 μL百里香精油；向D中加入包埋120 μL百里香精油的6 mL Fmoc-F水凝膠。

將以上4 組錐形瓶用一次性封口皮和牛皮紙包扎,于37 ℃、150 r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng),并分別在0、1、2、4、6、8、10、24 h時測定其在600 nm波長處的吸光度,實驗平行3 次,取平均值。

1.3.10 自由基清除率實驗

取4 支試管,分別標記A、B、C、D,按照1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)的方法分別配制1 mL水凝膠備用。試管A、C中都加入1 mL Fmoc-F水凝膠和20 μL百里香精油；B、D試管分別加入1 mL包埋20 μL百里香精油的Fmoc-F水凝膠。

1.3.10.1 DPPH自由基清除實驗

稱量3 mg 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）,用無水乙醇定容至100 mL,配制為75 μmol/L的DPPH溶液備用,在517 nm波長處測得吸光度A0。在裝有水凝膠的4 組試管中分別加入1 mL pH 3的鹽酸溶液。待A、B兩組試管中的膠完全溶解,C、D兩組于室溫下放置20 h后,將4 組離心（12 000 r/min、30 min）取1 mL上清液加入3 mL DPPH溶液中,充分混勻并避光靜置30 min后于517 nm波長處測得吸光度A1。每組實驗平行3 次,取平均值。根據(jù)公式（3）計算各組的DPPH自由基清除率。

式中：A0為517 nm波長處不加樣品的吸光度；A1為517 nm波長處加入樣品后的吸光度。

1.3.10.2 ABTS陽離子自由基清除實驗

取0.2 mL 2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS）儲備液（ABTS二銨鹽3 mg,超純水0.735 mL）和0.2 mL K2S2O8儲備液（K2S2O81 mg,超純水1.430 mL）混合,黑暗環(huán)境下室溫放置12 h,用pH 7.4磷酸鹽緩沖液將混合液稀釋10～20 倍至吸光度為（0.70±0.02）,即為ABTS工作液。

取ABTS工作液800 μL于比色皿中,加200 μL無水乙醇稀釋混合,于734 nm波長處測得吸光度A0（A0宜在0.70±0.02）。在裝有水凝膠的4 組試管中分別加入1 mL無水乙醇,待A、B試管中的膠完全溶解,C、D于室溫下放置20 h后,將4 組離心（12 000 r/min、30 min）取200 μL上清液加入800 μL的ABTS溶液中,于734 nm波長處測得吸光度A1。每組實驗平行3 次,取平均值。根據(jù)公式（4）計算各組的ABTS陽離子自由基清除率。

式中：A0為734 nm波長處不加樣品的吸光度；A1為734 nm波長處加入樣品后的吸光度。

1.3.10.3 CCA熒光標記法測定羥自由基清除實驗

在裝有水凝膠的4 組試管中分別加入1 mL超純水,待A、B兩組試管中的膠完全溶解,C、D兩組于室溫下放置20 h后,將4 組離心（12 000 r/min、30 min）,稀釋至合適濃度后,分別取20 μL并加入終濃度為6 μmol/L Cu2+、40 μmol/L H2O2的溶液、100 μmol/L pH 7.4的CCA溶液以及pH 7.4的磷酸鹽緩沖液制成150 μL混合液,外覆錫箔紙避光7 h。設(shè)置激發(fā)波長為390 nm,將上述測定液加入到微量比色皿中,測定其在450 nm波長處的熒光值F。每組實驗平行3 次,取平均值。根據(jù)公式（5）計算各組的羥自由基清除率。

式中：F0為450 nm波長處不加樣品的熒光值；F1為450 nm波長處加入樣品后的熒光值；F2為450 nm波長處加入樣品但不加Cu2+和H2O2時的熒光值（背景）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗均進行3 次平行,數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示；采用Origin 93軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Fmoc-F水凝膠及Fmoc-F/百里香精油水凝膠的流變學(xué)特征

G'和G''是流變性中重要的兩個參數(shù),其中G'代表了樣品的彈性形變,G''反映樣品的黏性形變[24]。當(dāng)G'大于G''時,彈性形變大于黏性形變,樣品呈現(xiàn)一定的剛性；當(dāng)G'小于G''時,樣品呈現(xiàn)流體特性；當(dāng)G'等于G''時,為凝膠轉(zhuǎn)化點,也就是凝膠點。

圖1 儲能模量和耗能模量隨時間變化曲線Fig.1 Time-dependent storage and loss moduli of hydrogels

如圖1所示,Fmoc-F和Fmoc-F/百里香精油樣品的G'和G''都隨時間延長而上升。在160 s之前,Fmoc-F樣品的G'小于G'',說明樣品呈現(xiàn)流體性質(zhì)；160 s后,G'大于G'',樣品呈現(xiàn)一定的剛性,即成膠[24]（圖1A）。利用Fmoc-F包埋百里香精油的樣品的凝膠點在50 s（圖1B）。證明Fmoc-F包埋百里香可以形成凝膠,且百里香精油可以縮短Fmoc-F的成膠時間。這可能是因為百里香精油的強疏水性加速了Fmoc-F分子間的有序聚合,從而加速了膠體的形成。

圖2 包埋精油前后的Fmoc-F水凝膠成膠過程中儲能模量隨時間（A）和頻率（B）的變化曲線Fig.2 Comparison of storage modulus during gelation of Fmoc-F hydrogel with and without essential oil encapsulation varied with time (A)and frequency (B)

如圖2A所示,Fmoc-F和Fmoc-F/百里香精油樣品的G'在4 000 s之前都隨時間延長而上升,4 000 s后基本保持不變。在樣品成膠以后,Fmoc-F/百里香精油膠體的G'始終大于Fmoc-F膠體,證明Fmoc-F/百里香精油膠體的強度更優(yōu)于Fmoc-F膠體。

在頻率10 Hz以內(nèi),Fmoc-F膠體的G'隨著頻率的變化有緩慢上升,而Fmoc-F/百里香精油的G'在該頻率范圍內(nèi)基本不變（圖2B）。說明Fmoc-F膠體是一種較為松弛的凝膠[25],而百里香精油的加入填補了Fmoc-F分子間的空隙,使凝膠的結(jié)構(gòu)更為緊密,膠體的強度也更強（圖2A）。

2.2 Fmoc-F和Fmoc-F/百里香精油的二級結(jié)構(gòu)分析

圖3 Fmoc-F與Fmoc-F/百里香精油水凝膠的圓二色譜Fig.3 Comparison of circular dichroism spectra of Fmoc-F hydrogels with and without encapsulated essential oil

為研究Fmoc-F和Fmoc-F/百里香精油的二級結(jié)構(gòu),利用圓二色譜進行檢測。結(jié)果如圖3所示,Fmoc-F在217 nm波長處有一個明顯的負峰,證明Fmoc-F很可能是呈β-折疊結(jié)構(gòu)[26],同樣,在Fmoc-F/百里香精油的樣品中在同一位置有明顯的負峰,此外并沒有明顯的其他峰的出現(xiàn)。因此Fmoc-F和Fmoc-F/百里香精油水凝膠主要的二級結(jié)構(gòu)極可能都是β-折疊結(jié)構(gòu),并且百里香精油的加入,并不影響Fmoc-F的二級結(jié)構(gòu)。

2.3 傅里葉變換紅外光譜研究膠體的分子間作用

圖4 Fmoc-F和Fmoc-F/百里香精油水凝膠的傅里葉變換紅外光譜Fig.4 Intermolecular interactions evaluated by Fourier transform infrared spectroscopy

采用傅里葉變換紅外光譜分析水凝膠的特殊基團,結(jié)果見圖4。Fmoc-F水凝膠在3 448 cm-1處出現(xiàn)酰胺A帶的N—H或O—H伸縮振動吸收峰；3 334 cm-1是—NH的伸縮振動峰[27],2 954 cm-1是酰胺B帶的N—H或O—H伸縮振動吸收峰,1 697 cm-1是C＝O的伸縮振動峰,與文獻[28]報道的結(jié)果一致。與Fmoc-F水凝膠相比,在Fmoc-F/百里香精油的譜線中,3 448 cm-1處的伸縮振動吸收峰變寬,3 334 cm-1處的伸縮振動吸收峰移動至3 342 cm-1處,2 954 cm-1處的伸縮振動吸收峰移動至2 960 cm-1處,1 697 cm-1處的伸縮振動峰增寬且移動至1 674 cm-1處,這些變化證明分子間氫鍵的存在[29]。因此推斷百里香精油是通過疏水作用力推動,與Fmoc-F分子形成分子間氫鍵從而形成水凝膠。

2.4 Fmoc-F和Fmoc-F/百里香精油多肽水凝膠的形貌

Fmoc-F水凝膠與包埋百里香精油的Fmoc-F水凝膠,經(jīng)液氮處理、冷凍干燥后用掃描電子顯微鏡觀察膠體的形貌,結(jié)果如圖5所示。

Fmoc-F水凝膠為納米纖維結(jié)構(gòu)（圖5A）,纖維分布不太均勻。Fmoc-F/百里香精油也具有長的、纖維狀的三維空間結(jié)構(gòu)（圖5B）,纖維分布更均勻。正是因為這種更均勻的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),導(dǎo)致Fmoc-F/百里香精油凝膠比Fmoc-F水凝膠具有更高的G'（圖2）。

2.5 Fmoc-F水凝膠在不同pH值下的分解率

Fmoc-F水凝膠具有pH值響應(yīng)性[23],為研究其在不同pH值下的分解率,將Fmoc-F水凝膠分別放在不同pH值的磷酸鹽緩沖液中,在不同的時間測定溶液中Fmoc-F的特征吸收峰（264 nm波長處的吸光度）,從而計算其分解率,結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同pH值下Fmoc-F水凝膠的分解率Fig.6 Decomposition rates of Fmoc-F hydrogel at different pH

由圖6可知,在pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中,前20 min內(nèi)凝膠的分解率僅有3.5%,40～180 min內(nèi),其分解率穩(wěn)定在5.0%左右。在pH 6.5的磷酸鹽緩沖液中,前20 min內(nèi)凝膠分解率為7.8%,之后也穩(wěn)定在10.0%左右。在pH 6.0的磷酸鹽緩沖液中,前100 min內(nèi)Fmoc-F水凝膠的分解率逐漸提高,由12.7%增長到38.6%。但100 min后凝膠的分解率未出現(xiàn)明顯的上升。在pH 5.5的磷酸鹽緩沖液中,前20～100 min內(nèi),Fmoc-F水凝膠的分解率從21.6%提高到50.9%,100 min后分解率上升不明顯。在pH 5.0與pH 4.5的磷酸鹽緩沖液中,到100 min時分解率分別達到89.5%和93.6%,在140 min時,完全分解。

結(jié)果表明,Fmoc-F水凝膠具有明顯的pH值響應(yīng)特性,其在酸性條件下會分解,在中性條件下可以形成穩(wěn)定凝膠。這是由于當(dāng)pH≥6.5時,Fmoc-F分子間通過疏水作用力和氫鍵結(jié)合在一起,其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,不易分解[30]；當(dāng)pH＜6.5時,溶液呈現(xiàn)酸性,且隨著pH值的逐漸降低,溶液中正電荷不斷增加,Fmoc-F分子帶正電荷而使分子間的斥力逐漸增大,當(dāng)分子間斥力大于分子間的疏水作用力時,凝膠結(jié)構(gòu)被破壞,Fmoc-F分子發(fā)生分解[30]。當(dāng)利用Fmoc-F包埋百里香精油時,凝膠也會因為環(huán)境pH值的變化發(fā)生分解,從而釋放其中包埋的精油。

2.6 Fmoc-F水凝膠對百里香精油的包埋和控釋作用研究

2.6.1 Fmoc-F水凝膠對百里香精油的包埋率

用1.3.8節(jié)的方法計算Fmoc-F對百里香精油的包埋率,實驗結(jié)果表明Fmoc-F多肽水凝膠對百里香精油的包埋率高達93.13%,具有很好的包埋效果,而王娣等[14]利用啤酒廢酵母為包埋材料制備百里香精油微膠囊,包埋率為86.71%；申莉莉[15]采用殼聚糖和海藻酸鈉為壁材包埋百里香精油的包埋率只有85.17%；張珊珊等[31]采用乳液模板——層層自組裝法制備的百里香精油微膠囊的包埋率也僅有71.13%,均小于采用Fmoc-F水凝膠對百里香精油的包埋率。

2.6.2 Fmoc-F水凝膠對百里香精油的控釋作用和對抑菌效果的延長作用

為了研究Fmoc-F水凝膠對百里香精油的控釋作用及Fmoc-F/百里香精油水凝膠的抑菌效果,利用百里香精油、Fmoc-F水凝膠、包埋百里香精油的Fmoc-F水凝膠作液體抑菌實驗,結(jié)果如表1所示。A組在培養(yǎng)24 h的過程中,菌液OD值呈現(xiàn)出典型的大腸桿菌的生長周期[32]；B組OD值變化與A組一致,證明單獨的Fmoc-F水凝膠對大腸桿菌的生長并沒有抑制效果；C組因為加入百里香精油,在0～24 h,其OD值明顯小于A、B組,證明百里香精油的加入可以較好地抑制大腸桿菌的生長；D組在0～1 h內(nèi),菌液pH＞6.5,Fmoc-F水凝膠基本沒有分解,被包埋的百里香精油無法發(fā)揮抑菌作用,在1～4 h內(nèi),菌液pH＞5.5,Fmoc-F水凝膠少量分解,百里香精油開始緩慢釋放到菌液中,發(fā)揮抑菌作用。隨著培養(yǎng)時間的延長（10 h后）,菌液中微生物數(shù)量增多,溶液pH值下降到5左右,Fmoc-F水凝膠分解增多,百里香精油釋放出來,完全發(fā)揮抑菌效果。此外,10 h后,對比C、D組,發(fā)現(xiàn)D組的抑菌效果好于C組,這是因為C組中,由于百里香精油加在溶液中,導(dǎo)致培養(yǎng)后期有部分精油揮發(fā)；而D組由于百里香精油被包埋在Fmoc-F水凝膠中,大腸桿菌數(shù)量增多,導(dǎo)致溶液pH值下降后才釋放出來,因此有效抑制了百里香精油的揮發(fā),從而延長百里香精油的抑菌效果。

從上述實驗可以看出Fmoc-F水凝膠能抑制培養(yǎng)液中百里香精油的揮發(fā),提高其穩(wěn)定性,并且由于Fmoc-F水凝膠的pH值響應(yīng)特性,可以對百里香精油進行有效的控制釋放,根據(jù)菌液的生長情況緩慢釋放被包埋的精油,從而達到長效抑菌效果。

表1 添加包埋和未包埋的百里香精油的大腸桿菌液體培養(yǎng)液的OD值和pH值Table 1 OD and pH of Escherichia coli culture in the presence of Fmoc-F hydrogels with free and encapsulated thyme essential oil

2.7 Fmoc-F水凝膠對百里香精油抗氧化作用的影響

除了抑菌作用,百里香精油還有抗氧化作用,為研究Fmoc-F水凝膠對百里香精油抗氧化效果的影響,測定了百里香精油、Fmoc-F水凝膠包埋百里香精油的DPPH自由基、ABTS陽離子自由基及羥自由基清除率。

表2 各樣品的自由基清除率Table 2 Free radical scavenging rates of free and encapsulated essential oil

如表2所示,對比A、B兩組發(fā)現(xiàn),A組樣品的自由基清除率略大于B組,這是由于B組百里香精油是包埋在Fmoc-F水凝膠內(nèi)的,實驗過程中有少量精油在膠體內(nèi)沒有完全起到抗氧化作用；對比A、C兩組發(fā)現(xiàn),A組樣品的自由基清除率遠大于C組樣品,這是由于C組經(jīng)20 h放置后,百里香精油大量揮發(fā),使其抗氧化效果減弱,自由基清除率大大降低；對比C、D兩組發(fā)現(xiàn),D組樣品的自由基清除率大于C組,這是由于Fmoc-F水凝膠的包埋作用,使得百里香精油緩慢釋放,減少其揮發(fā)作用,延長百里香精油的抗氧化作用。D組羥自由基清除率相比B組略有下降,可能是因為精油并不溶于水,在水相體系中,精油更傾向于附著在Fmoc-F膠體上,因此放置20 h后溶液中精油的有效濃度減少,從而導(dǎo)致對羥自由基清除率的輕微下降。上述結(jié)果說明Fmoc-F水凝膠對百里香精油有較好的控釋作用,可以減少百里香精油的揮發(fā),延長其抗氧化效果。

3 結(jié) 論

本實驗利用Fmoc-F水凝膠包埋百里香精油,通過流變儀、圓二色光譜、傅里葉變換紅外光譜、掃描電子顯微鏡研究其成膠機制及微觀結(jié)構(gòu)；通過紫外吸收、抑菌和抗氧化研究Fmoc-F水凝膠的pH值響應(yīng)性及其對百里香精油的控釋作用和長效抑菌、抗氧化作用。通過流變學(xué)實驗發(fā)現(xiàn),百里香精油可以加速水凝膠的形成,并提高其剛性；圓二色譜表明Fmoc-F水凝膠和Fmoc-F/百里香精油水凝膠的二級結(jié)構(gòu)都可能是β-折疊結(jié)構(gòu)；傅里葉變換紅外光譜和掃描電子顯微鏡結(jié)果說明百里香精油與Fmoc-F分子形成水凝膠主要是通過分子間氫鍵形成均勻纖維狀三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；紫外吸收實驗說明Fmoc-F具有pH值響應(yīng)性；抑菌實驗和抗氧化實驗說明當(dāng)溶液pH≥6.5時,Fmoc-F水凝膠可有效包埋百里香精油,并且抑制百里香精油的揮發(fā),其包埋率可達93.13%,當(dāng)溶液pH＜6.5時,Fmoc-F水凝膠開始分解,釋放百里香精油,從而起到緩釋精油、發(fā)揮其長效抑菌和抗氧化的效果。