空化射流促糖基化對(duì)大豆蛋白結(jié)構(gòu)與功能性的影響

孟凡迪,白 銀,王中江,江連洲,李 楊,2,3,李 良,

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030；2.哈爾濱食品產(chǎn)業(yè)研究院,黑龍江 哈爾濱 150028；3.國(guó)家大豆技術(shù)研究中心,黑龍江 哈爾濱 150000）

大豆蛋白是一種所含氨基酸種類豐富、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值全面的優(yōu)質(zhì)植物蛋白質(zhì),因其具有較好的功能特性,故在食品工業(yè)方面有著較廣泛的應(yīng)用[1]。但其功能性質(zhì)易受許多外界因素的影響,因此需要用改性的方法進(jìn)一步改善其功能特性。目前,大豆蛋白的改性方法主要有物理法、化學(xué)法、酶法等[2]。糖基化改性屬于化學(xué)改性范疇,加熱條件下,糖基化反應(yīng)可在蛋白和糖分子間自發(fā)進(jìn)行,無(wú)需催化劑,且反應(yīng)得到的蛋白質(zhì)多糖復(fù)合物具有較好的溶解性、乳化性、穩(wěn)定性、凝膠性等,是一種理想的蛋白改性方法[3-4]。但傳統(tǒng)糖基化方法中,干法反應(yīng)所需時(shí)間長(zhǎng),濕法反應(yīng)不易控制、接枝產(chǎn)物顏色深,這些問(wèn)題都限制了蛋白質(zhì)接枝改性方法的廣泛應(yīng)用。

目前較多使用外場(chǎng)輔助技術(shù)輔助糖基化反應(yīng),以彌補(bǔ)傳統(tǒng)糖基化反應(yīng)的不足,空化射流屬于外場(chǎng)輔助手段的一種,可以產(chǎn)生空化效應(yīng)?？栈?yīng)是液流系統(tǒng)中的局部壓力低于相應(yīng)溫度下該液體的飽和蒸氣壓時(shí),液體迅速氣化形成許多空泡,這些空泡隨液體流入高壓區(qū)后,發(fā)生收縮、漬滅的現(xiàn)象?？张轁n滅瞬間能形成強(qiáng)烈的沖擊力和速率高達(dá)100 m/s的微射流。并伴隨高壓等極端物理現(xiàn)象,這種極端條件可使在一般條件下難以實(shí)現(xiàn)的物理、化學(xué)反應(yīng)得以進(jìn)行[5-6]。

空化射流強(qiáng)大的沖擊力使其已在促進(jìn)化學(xué)反應(yīng)方面有許多應(yīng)用,但大都是生物醫(yī)學(xué)方面,目前在食品行業(yè)中應(yīng)用較少。本實(shí)驗(yàn)將空化射流用于輔助糖基化反應(yīng),對(duì)不同空化射流時(shí)間對(duì)糖基化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與功能性進(jìn)行研究,從而探究空化射流對(duì)糖基化改性的影響,為改善大豆蛋白功能性與空化射流在食品加工行業(yè)方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白 山東禹王集團(tuán)；葡萄糖 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司；大豆油 九三糧油工業(yè)集團(tuán)有限公司；1-苯胺基-8-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS） 美國(guó)Sigma公司；考馬斯亮藍(lán)G-250 天津市科密歐化學(xué)試劑廠；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）配制試劑盒、Lowry法蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒 上海荔達(dá)生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；THZ-80水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇億通電子有限公司；空化射流機(jī) 北京中森匯嘉科技發(fā)展有限責(zé)任公司；5430小型高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；FD5-3型冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Sim公司；722型紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；SDS-PAGE儀北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；HYP-308消化爐上海纖檢儀器有限公司；LNK-871型凱氏定氮快速自動(dòng)蒸餾器 江蘇省宜興市科教儀器研究所；F-4500熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；VECTOR33傅里葉變換紅外分析儀 德國(guó)Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 糖基化大豆分離蛋白制備

將大豆分離蛋白與葡萄糖以質(zhì)量比4∶1溶于pH 7.5、0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液,室溫下攪拌2 h至完全溶解,配制成蛋白質(zhì)量濃度為0.05 g/mL的樣品溶液。將樣品置于80 ℃恒溫水浴鍋預(yù)熱后,分別倒入空化射流機(jī)中空化20、40、60、80、100、120 min,空化過(guò)程中保持溫度80 ℃恒定?？栈淞魈幚砗?取出樣品在80 ℃水浴條件下繼續(xù)加熱,控制樣品進(jìn)行糖基化反應(yīng)總時(shí)長(zhǎng)均為6 h。待反應(yīng)結(jié)束后,立即將樣品放入冰水浴中冷卻至室溫,離心除去不溶物,取上清液透析24 h（4 ℃）,冷凍干燥后置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 接枝度測(cè)定

采用鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde,OPA）法[7]測(cè)接枝度。準(zhǔn)確稱取40.0 mg的OPA溶解于1.0 mL甲醇中,再加入25.0 mL 0.1 mol/L硼砂溶液、2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的SDS、100 μLβ-巰基乙醇,最后用蒸餾水定容到50 mL,制得OPA試劑。測(cè)定時(shí),取200 μL樣品溶液（蛋白質(zhì)量濃度2 mg/mL）溶于4.0 mL OPA試劑中,混合均勻,放入35 ℃水浴中反應(yīng)2 min,之后在340 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度At?？瞻讓?duì)照組為在4.0 mL OPA試劑加入200 μL水。接枝度按式（1）計(jì)算。

式中：A0為反應(yīng)前樣品的吸光度；At為反應(yīng)t時(shí)間后的吸光度。

1.3.3 褐變程度測(cè)定

將樣品用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% SDS溶液稀釋,使樣品液蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL,以稀釋液作空白對(duì)照,在420 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A420nm[8]。褐變程度與A420nm成正比。

1.3.4 溶解性測(cè)定

稱取一定量未處理的樣品與糖基化的樣品,分別溶解配制成蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液,并在室溫下均勻攪拌30 min使其充分溶解。然后在4 ℃、12 000×g條件下離心10 min。采用Lowry法[9]測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù),使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（y＝1.302 9x+0.001 6,R2＝0.998 1）,測(cè)定500 nm波長(zhǎng)處的吸光度,用凱氏定氮法測(cè)定蛋白樣品中總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。溶解度按式（2）計(jì)算。

1.3.5 乳化活性及乳化穩(wěn)定性測(cè)定

根據(jù)Pearce等[10]的方法進(jìn)行,首先取樣品溶于0.1 mol/L、pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液中使其質(zhì)量濃度為2 mg/mL,取5 mL樣品溶液加入15 mL大豆油,在10 000 r/min分散1 min,立即從溶液底部吸取50 mL乳濁液,加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% SDS溶液進(jìn)行稀釋,在500 mm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度A0。20 min后,測(cè)吸光度A20。乳化活性（emulsifying activity index,EAI）和乳化穩(wěn)定性（emulsion stability index,ESI）分別由公式（3）、（4）計(jì)算。

式中：DF為稀釋倍數(shù)（100）；ρ為蛋白質(zhì)量濃度/（g/mL）；φ為比色皿光程（1 cm）；θ為乳液中油相所占比例（0.25）；A0和A20分別為0 min和20 min時(shí)的吸光度。

1.3.6 SDS-PAGE分析大豆蛋白分子質(zhì)量

根據(jù)Leammli[11]的方法稍作修改,先分別配制12%分離膠與5%濃縮膠。將蛋白質(zhì)量濃度為4 mg/mL樣品溶液與4×上樣緩沖液以體積比3∶1混合,然后在95 ℃下加熱3 min做變性處理,冷卻至室溫上樣,上樣量為10 mL。電泳時(shí)保持恒壓,其中濃縮膠電壓保持為80 V,分離膠電壓保持為120 V。用染色液（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%考馬斯亮藍(lán)G-250）染色30 min,之后用脫色液脫色,成像,采用彩虹Marker作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.3.7 表面疏水性測(cè)定

根據(jù)Kato[12]、Shen Lan[13]等的方法稍作修改。將未處理的樣品與糖基化的樣品分別用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液稀釋成蛋白質(zhì)量濃度為1.0、0.5、0.25、0.1、0.02 mg/mL的溶液,并用此磷酸鹽緩沖溶液配制ANS溶液（8 mmol/L）。取2 mL稀釋后的樣品溶液,加入20 μL ANS溶液后混合均勻,設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為390 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為470 nm,測(cè)定其熒光強(qiáng)度。以蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖,采用線性回歸分析進(jìn)行曲線擬合,曲線的初始斜率即為樣品的表面疏水性H0。

1.3.8 傅里葉變換紅外光譜分析

準(zhǔn)確稱量2 mg的樣品,加入一定量的溴化鉀至200 mg,用研缽研磨成均勻粉末,壓制成薄片,再用傅里葉變換紅外光譜儀做全波段掃描（400～4 000 cm-1）,掃描次數(shù)64 次。

1.3.9 熒光光譜分析

根據(jù)Bonomi等[14]方法進(jìn)行一定修改。用0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液配制樣品溶液,使蛋白質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL。選擇激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm、激發(fā)狹縫5 nm,發(fā)射波長(zhǎng)范圍為300～400 nm,掃描速率為240 nm/min。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均平行3 次,采用SPSS 19軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,多重比較采用Duncan分析方法,P＜0.05表示差異顯著,數(shù)據(jù)采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖基化產(chǎn)物接枝度與褐變程度分析結(jié)果

接枝度是衡量糖基化反應(yīng)程度的一個(gè)重要指標(biāo)[15]。由圖1可知,大豆蛋白接枝物的接枝度隨空化射流時(shí)間的延長(zhǎng)呈增長(zhǎng)趨勢(shì),說(shuō)明空化射流可以促進(jìn)蛋白與糖的接枝反應(yīng)?？栈淞鬏o助120 min得到的糖基化產(chǎn)物的接枝度從29.1%增加到43.2%。這是由于空化射流過(guò)程中,空泡漬滅瞬間所產(chǎn)生的空穴效應(yīng)、超高壓等可以使蛋白的分子結(jié)構(gòu)展開,變得更加松散,使可發(fā)生接枝反應(yīng)的游離氨基更多地暴露在蛋白分子表面,從而使更多的游離氨基酸與糖的還原性羰基末端發(fā)生糖基化反應(yīng),接枝物的接枝度增加。同時(shí)空化射流產(chǎn)生的高速水射流,可以使蛋白的游離氨基與糖的羰基碰撞幾率增大,這也可以加快接枝反應(yīng)速率。

糖基化棕褐色產(chǎn)物的特征波長(zhǎng)是420 nm[16]。如圖1所示,隨著空化射流時(shí)長(zhǎng)的增加,蛋白接枝物的A420nm顯著增大（P＜0.05）,大豆分離蛋白-葡萄糖褐變程度增加。這是由于空化射流使蛋白結(jié)構(gòu)展開,同時(shí)空化射流的射流效應(yīng)使蛋白與糖結(jié)合幾率增大,從而使蛋白自由氨基基團(tuán)能更多的與葡萄糖分子的羧基末端反應(yīng),使糖基化反應(yīng)程度增加,生成更多的深棕色物質(zhì)使褐變程度不斷增加。

圖1 空化射流處理時(shí)間對(duì)糖基化產(chǎn)物接枝度與褐變程度變化的影響Fig.1 Effects of cavitation jet treatment duration on the degree of grafting and browning

2.2 糖基化產(chǎn)物溶解性分析結(jié)果

由圖2可知,空化射流輔助糖基化反應(yīng)比單純糖基化反應(yīng)對(duì)大豆蛋白的溶解度改善效果更好。在空化射流60 min內(nèi),接枝物的溶解度隨著空化射流時(shí)間延長(zhǎng)而顯著增加（P＜0.05）,空化射流處理60 min時(shí)的糖基化產(chǎn)物的溶解度最高,達(dá)到89.27%,與未處理蛋白相比提高43.3%,與單獨(dú)加熱糖基化產(chǎn)物相比提高約37%。這可能是因?yàn)榭栈淞鲿?huì)加快糖基化反應(yīng)速率,而引入更多的糖鏈中的多羥基官能團(tuán)[17],改善了蛋白質(zhì)和水分子之間親和力[18]。同時(shí)空化射流所產(chǎn)生的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)會(huì)破壞蛋白質(zhì)分子的高級(jí)結(jié)構(gòu),釋放出小分子的亞基和肽,使其溶解度增加[19]。繼續(xù)延長(zhǎng)空化射流時(shí)間,溶解度變化趨于平緩并有小幅度下降,這是因?yàn)榈竭_(dá)一定程度后繼續(xù)增加親水性羥基對(duì)蛋白親水性影響不大。同時(shí)可能因?yàn)榭栈^(guò)度使蛋白質(zhì)發(fā)生一定程度的聚集,生成大分子質(zhì)量物質(zhì),故溶解性有小幅度下降[20]。

圖2 空化射流處理時(shí)間對(duì)糖基化產(chǎn)物溶解性變化的影響Fig.2 Effect of cavitation jet treatment duration on solubility of glycosylated products

2.3 糖基化產(chǎn)物乳化活性與乳化穩(wěn)定性分析結(jié)果

圖3 空化射流處理時(shí)間對(duì)糖基化產(chǎn)物乳化活性與乳化穩(wěn)定性變化的影響Fig.3 Effect of cavitation jet treatment duration on emulsifying activity and emulsion stability of glycosylated products

由圖3可知,與大豆蛋白相比,糖基化反應(yīng)可以顯著提高其乳化活性與乳化穩(wěn)定性（P＜0.05）。乳化活性隨空化射流處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增后減的趨勢(shì),在空化射流處理80 min時(shí),乳化活性改善效果最好,與未處理蛋白相比提升183.17%,與單獨(dú)加熱糖基化產(chǎn)物相比提高57.83%。蛋白乳化性與蛋白的溶解性、疏水基團(tuán)暴露程度均存在一定聯(lián)系[21]?？栈淞鞔龠M(jìn)了蛋白糖基化反應(yīng),使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)變的松散,蛋白分子內(nèi)部更多的疏水基團(tuán)暴露[22]。在蛋白乳化的過(guò)程中,更多疏水基團(tuán)與油相結(jié)合,利于蛋白吸附在油-水界面上,阻礙油滴間的聚合,從而提高蛋白的乳化活性。繼續(xù)延長(zhǎng)空化射流時(shí)間,乳化活性開始降低,接枝度不斷增大,更多的親水基團(tuán)的引入會(huì)對(duì)油-水界面的平衡造成破壞,復(fù)合物界面活性降低,從而造成乳化活性降低[23]。

乳化穩(wěn)定性也隨空化射流處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增后減的趨勢(shì),處理40 min時(shí)達(dá)到最高值。這是因?yàn)殡S著糖基化反應(yīng)的進(jìn)行,糖的引入增加了油-水乳化體系中水相的黏度,降低了其表面張力使乳化體系的穩(wěn)定性得到提高?？栈淞魈幚?0 min時(shí)達(dá)到最高值,與未處理蛋白相比提高220.21%,與單獨(dú)加熱糖基化產(chǎn)物相比提高153.72%。40 min后乳化穩(wěn)定性小幅度下降,這可能是由于空化射流會(huì)破壞蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu),使蛋白發(fā)生聚集。蛋白聚集后,疏水基團(tuán)被埋在分子內(nèi)部,無(wú)法與油相接觸而發(fā)揮乳化作用,導(dǎo)致乳化穩(wěn)定性不繼續(xù)增加[24]。

2.4 糖基化產(chǎn)物SDS-PAGE分析結(jié)果

SDS-PAGE可被用來(lái)分析蛋白質(zhì)的亞基及分子質(zhì)量的變化情況。圖4反映不同空化射流處理時(shí)間輔助糖基化改性的大豆蛋白各亞基條帶的變化,可以看出,在空化射流輔助下,大豆蛋白與葡萄糖發(fā)生共價(jià)反應(yīng)。交聯(lián)的蛋白隨著空化射流時(shí)間的延長(zhǎng)生成異肽鏈或二硫鍵,從而生成了一些大分子物質(zhì),這些大分子物質(zhì)不能通過(guò)濃縮膠和分離膠,留在分離膠頂部,使分離膠頂部顏色逐漸加深。

隨著空化射流時(shí)間的延長(zhǎng),大豆蛋白的亞基組成發(fā)生明顯變化,多個(gè)亞基因?yàn)榕c葡萄糖之間發(fā)生接枝作用,生成了大分子聚集體,表現(xiàn)為對(duì)應(yīng)譜帶的缺失。另外一種可能是一個(gè)葡萄糖連接了一個(gè)亞基,但是亞基之間逐漸聚合,表現(xiàn)為譜帶的缺失。

圖4 不同空化射流時(shí)間下糖基化產(chǎn)物的SDS-PAGE圖Fig.4 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of glycosylated products at different cavitation jet times

2.5 糖基化產(chǎn)物表面疏水性分析結(jié)果

由圖5可知,對(duì)比未糖基化處理的蛋白與普通糖基化（即空化射流0 min）產(chǎn)物,可以發(fā)現(xiàn)糖基化反應(yīng)可以降低蛋白表面疏水性。這是由于大豆蛋白經(jīng)糖基化反應(yīng)后,產(chǎn)物中引入了較多的親水性羥基,從而導(dǎo)致表面疏水性降低。短時(shí)間空化射流處理可以顯著提高接枝物的表面疏水性（P＜0.05）,處理20 min時(shí)表面疏水性達(dá)到最高,之后不斷降低。這可能是因?yàn)榭栈?yīng)使折疊的肽鏈展開,更多藏在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露,從而使表面疏水性增加。有研究表明,空化作用會(huì)增加蛋白表面疏水性[25]。繼續(xù)延長(zhǎng)空化射流時(shí)間,糖基化反應(yīng)程度加劇,更多葡萄糖與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合,產(chǎn)物中引入了更多的親水性羥基,使蛋白質(zhì)分子親水性增加[26-27]。另外可能是由于空化射流處理使疏水基團(tuán)相互作用導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的聚集,從而降低了接枝物的表面疏水性[28]。

2.6 糖基化產(chǎn)物紅外光譜分析結(jié)果

圖6 不同空化射流處理時(shí)間糖基化產(chǎn)物傅里葉變換紅外光譜分析Fig.6 Fourier transform infrared spectra of glycosylated products at different cavitation jet treatment times

紅外光譜（圖6）測(cè)定的酰胺I帶可以計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量,對(duì)酰胺I帶的譜帶進(jìn)行了如下歸屬：1 650～1 660 cm－1為α-螺旋,1 610～1 640 cm－1和1 670～1 690 cm－1為β-折疊,1 660～1 670 cm－1和1 690～1 700 cm－1為β-轉(zhuǎn)角,1 640～1 650 cm－1為無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。對(duì)酰胺I帶進(jìn)行處理后進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)擬合。各峰面積占總面積的比例即為各二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。不同空化射流處理時(shí)間糖基化產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量如表1所示。

表1 空化射流處理時(shí)間對(duì)糖基化產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的影響Table 1 Effect of cavitation jet treatment duration on secondary structures of glycosylated products

由表1可知,與未糖基化蛋白相比,糖基化反應(yīng)可以使葡萄糖與大豆蛋白共價(jià)結(jié)合,從而使蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化?？栈淞鬏o助可以使接枝物二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量發(fā)生顯著變化（P＜0.05）,接枝物α-螺旋相對(duì)含量顯著降低,β-折疊與無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量增加?？栈淞魈幚?0 min時(shí),變化最為明顯,接枝物的α-螺旋相對(duì)含量由19.47%下降到12.58%,β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲的相對(duì)含量則分別從32.25%和19.72%增加到38.29%和20.96%。說(shuō)明空化射流輔助條件下,糖基化大豆蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是由α-螺旋結(jié)構(gòu)解螺旋形成β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu),由有序變?yōu)闊o(wú)序。這是由于參與糖基化反應(yīng)的ε-氨基位于α-螺旋結(jié)構(gòu)中,ε-氨基與葡萄糖中的還原性羰基反應(yīng)造成了α-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的降低[29]?？栈淞骺梢源龠M(jìn)糖基化反應(yīng),使更多ε-氨基參與糖基化反應(yīng),從而降低α-螺旋相對(duì)含量。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋呈緊密無(wú)空腔結(jié)構(gòu),較穩(wěn)定,不利于蛋白功能性的發(fā)揮。α-螺旋相對(duì)含量降低可以使蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性變差,從而有利于蛋白功能性的改善[30-31]。

2.7 糖基化產(chǎn)物熒光光譜分析結(jié)果

圖7 不同空化射流處理時(shí)間對(duì)糖基化產(chǎn)物熒光強(qiáng)度變化的影響Fig.7 Effect of cavitation jet treatment time on fluorescence intensity of glycosylated products

由圖7可以看出,對(duì)比未經(jīng)糖基化反應(yīng)蛋白,糖基化反應(yīng)可以顯著降低蛋白的熒光強(qiáng)度?？栈淞魈幚砜梢允沟鞍捉又ξ锏臒晒鈴?qiáng)度顯著降低,處理80 min時(shí),熒光強(qiáng)度達(dá)到最小值,繼續(xù)增加空化射流時(shí)間,熒光強(qiáng)度有所上升。這可能是由于空化射流破壞了大豆蛋白的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致更多的發(fā)色團(tuán)暴露在溶劑中。另外,空化射流促進(jìn)了糖基化反應(yīng)的發(fā)生,使更多蛋白與葡萄糖共價(jià)結(jié)合,導(dǎo)致對(duì)色氨酸的熒光猝滅作用的發(fā)生,這與Sun Yuanxia等[32]的研究結(jié)果類似。同時(shí)空化射流處理使蛋白質(zhì)的λmax發(fā)生不同程度紅移,λmax發(fā)生紅移代表蛋白具有更松散的三級(jí)結(jié)構(gòu),有利于蛋白功能特性的發(fā)揮[33-34],證明空化射流處理可以改變接枝物的三級(jí)結(jié)構(gòu),從而改善接枝物的功能性。

3 結(jié) 論

大豆分離蛋白與葡萄糖糖基化產(chǎn)物的接枝度隨空化射流時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增大,說(shuō)明空化射流可以促進(jìn)糖基化反應(yīng)。經(jīng)空化射流輔助處理后,接枝物功能性均有不同程度改善。但達(dá)到最優(yōu)所需的處理時(shí)間不同。溶解度在處理60 min時(shí)改善最為明顯,達(dá)到峰值89.27%,與未處理蛋白相比提高43.3%,與單獨(dú)加熱糖基化產(chǎn)物相比提高約37%。乳化活性在處理80 min時(shí)最高,比未處理蛋白提高183.17%。乳化穩(wěn)定性在40 min時(shí)改善效果最明顯,與未處理蛋白相比提高220.21%。短時(shí)間空化射流可以使蛋白質(zhì)分子內(nèi)部疏水氨基酸暴露,提高其表面疏水性。SDS-PAGE顯示空化射流促進(jìn)了蛋白質(zhì)亞基與葡萄糖發(fā)生接枝反應(yīng)。傅里葉變換紅外光譜分析證明了空化射流可以使蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變得疏松,柔韌性增加,從而利于蛋白功能性的發(fā)揮。熒光光譜分析表明,空化射流處理可以使接枝物發(fā)生熒光猝滅作用且使最大熒光強(qiáng)度紅移,說(shuō)明空化射流處理可以使蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)變得更加松散。