姜黃素及其代謝修飾產(chǎn)物對(duì)PC12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

李浩銘,黃永杰,王永麗,李大鵬,李 鋒

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 泰安 271018）

維持氧化還原穩(wěn)態(tài)是機(jī)體正常運(yùn)行的必要條件,這個(gè)過(guò)程受體內(nèi)還原性分子、抗氧化酶、二相解毒酶和其他分子的嚴(yán)格調(diào)控。隨著年齡、遺傳和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因素的變化,體內(nèi)氧化還原系統(tǒng)會(huì)失衡,活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）的大量產(chǎn)生超過(guò)了機(jī)體本身的清除能力,導(dǎo)致氧化損傷的產(chǎn)生,并最終影響細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)和DNA/RNA的翻譯后修飾,造成細(xì)胞損傷或凋亡[1]。越來(lái)越多的研究表明,許多疾病都與氧化應(yīng)激損傷相關(guān),如糖尿病、心血管疾病、阻塞性肺病、白內(nèi)障、關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)退行性疾病和癌癥等[2-9]。因此,研究天然產(chǎn)物活性成分的抗氧化作用,對(duì)于預(yù)防和治療多種疾病具有重要意義。

姜黃素是從姜黃中提取的一種多酚類化合物,具有多種生物活性。研究表明,姜黃素通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子可以起到免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用[10-12]。此外,它還具有抗腫瘤、抗氧化作用,是一種較強(qiáng)的體內(nèi)和體外抗氧化劑[13-14]。然而,姜黃素在氧、光照以及中性和堿性環(huán)境下是不穩(wěn)定的,易被降解為阿魏酸和阿魏酰甲烷[15-16]。此外,與其他多酚類物質(zhì)類似,姜黃素在體內(nèi)需經(jīng)過(guò)一系列的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程才能被人體吸收[17]。研究發(fā)現(xiàn),在小鼠體內(nèi)注射的姜黃素大部分是由內(nèi)源性還原酶系統(tǒng)逐步還原成二氫姜黃素、四氫姜黃素和六氫姜黃素,然后再利用尿苷-5'-二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行葡糖醛酸化[18]。有研究證明,四氫姜黃素可減輕高脂高果糖飲食小鼠通過(guò)I相代謝酶誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[19]。它還能夠通過(guò)下調(diào)核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）來(lái)降低脂多糖誘導(dǎo)的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）在巨噬細(xì)胞中的表達(dá),但抑制活性弱于姜黃素[20],這可能與它們?cè)诩?xì)胞中的吸收和代謝不同有關(guān)[21]。但四氫姜黃素比姜黃素表現(xiàn)出更強(qiáng)的體外抗氧化活性[22]。Somparn等[23]研究證明,四氫姜黃素比姜黃素具有更強(qiáng)的清除2,2-二(4-叔辛基苯基)-1-苦肼基自由基的能力和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化活性,并且其也可以顯著抑制2,2'-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽引起的紅細(xì)胞溶血。Pal等[24]合成了兩種姜黃素葡糖糖醛酸化合物,并評(píng)估了其對(duì)4 種人類癌細(xì)胞株（KBM-5、Jurkat、U266和A549）的增殖抑制活性,發(fā)現(xiàn)姜黃素能通過(guò)抑制NF-κB的活化表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗增殖作用,而姜黃素葡萄糖醛酸化合物則沒(méi)有上述活性。這些研究結(jié)果表明姜黃素代謝產(chǎn)物可能表現(xiàn)出與母體化合物不同的生物活性。而且,不同的抗氧化評(píng)價(jià)體系（體外化學(xué)評(píng)價(jià)方法和體內(nèi)抗氧化評(píng)價(jià)方法）對(duì)抗氧化活性結(jié)果也有影響。然而,目前關(guān)于葡萄糖醛酸修飾對(duì)姜黃素抗氧化活性的影響還鮮見(jiàn)報(bào)道。因此,為了揭示膳食多酚對(duì)多種疾病的預(yù)防和治療作用機(jī)制,研究其代謝產(chǎn)物的生物活性具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定細(xì)胞存活率、ROS含量和丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量,以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活力和細(xì)胞內(nèi)抗氧化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平等指標(biāo),比較了姜黃素及其兩種主要代謝修飾產(chǎn)物（四氫姜黃素和姜黃素-β-D-葡糖苷酸）對(duì)H2O2誘導(dǎo)的大鼠腎上腺嗜鉻瘤PC12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用,以期為揭示姜黃素的健康功效機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姜黃素（純度≥98%）、四氫姜黃素（純度≥98%）上海源葉生物科技有限公司；姜黃素-β-D-葡萄糖醛酸鹽（純度≥95%） 加拿大TRC公司。

PC12細(xì)胞 上海蓋寧生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同）胰蛋白酶乙二胺四乙酸消化液 美國(guó)Gibco公司；青霉素-鏈霉素、二甲基亞砜、30% H2O2溶液 北京索萊寶試劑有限公司；胎牛血清 以色列Bioind公司；噻唑藍(lán)（thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT） 美國(guó)Sigma公司；SOD、MDA測(cè)定試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF）蛋白酶抑制劑、細(xì)胞核細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒、聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride,PVDF）印跡膜 上海碧云天生物科技有限公司；血紅素氧合酶-1（hemeoxygenase-1,HO-1）、腺嘌呤二核苷酸醌氧化還原酶（NADPH quinineoxidoreductase-1,NQO-1）、Nrf2單克隆抗體 美國(guó)Abcam公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2104A分析天平 上海精天電子儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HF90 CO2培養(yǎng)箱 上海力申科學(xué)儀器有限公司；ChemiDoc MP凝膠成像系統(tǒng)、Mini-PROTEN Tetra垂直電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；5810R高速冷凍離心機(jī)Eppendorf（中國(guó)）有限公司；MK3酶標(biāo)儀 Thermo（上海）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將PC12細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)1%的青霉素-鏈霉素混合液的RPMI 1640培養(yǎng)基中,置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2～3 d傳代一次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（細(xì)胞貼壁80%）用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),96 孔板種板密度為2.0×105個(gè)/mL,6 孔板種板密度為1×106個(gè)/mL。

1.3.2 細(xì)胞存活率的測(cè)定

將PC12細(xì)胞接種于96 孔板,培養(yǎng)24 h后倒掉培養(yǎng)基,加入含有藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后,倒掉培養(yǎng)基,用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline,PBS）沖洗2～3 遍,每孔加入0.5 mg/mL的MTT溶液100 μL,37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h后倒掉MTT,每孔加入100 μL二甲基亞砜溶液,振蕩10 min,然后于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。在H2O2損傷組中,藥物處理后,加入含有H2O2的培養(yǎng)基處理1 h,再加入MTT溶液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞存活率按下式計(jì)算。

式中：A0為空白對(duì)照孔的吸光度；A1為藥物處理孔的吸光度；A2為未加藥物處理孔的吸光度。

1.3.3 ROS水平的測(cè)定

將PC12細(xì)胞接種于96 孔板,于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,倒掉培養(yǎng)基,PBS沖洗2～3 遍,經(jīng)含有藥物的無(wú)血清培養(yǎng)基處理48 h后,加入含25 μmol/L 2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA）的基本培養(yǎng)基200 μL,于培養(yǎng)箱避光孵育30 min[25]。在氧化損傷模型中,藥物處理48 h后,倒掉培養(yǎng)基,用0.5 mmol/L的H2O2溶液處理1 h,再裝載探針,后面步驟同上。用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度（吸收波長(zhǎng)488 nm、激發(fā)波長(zhǎng)525 nm）。

1.3.4 MDA含量的測(cè)定

將PC12細(xì)胞接種到6 孔板中,分為對(duì)照組、H2O2損傷組和不同濃度藥物處理組,培養(yǎng)48 h后,H2O2處理1 h。吸出培養(yǎng)基,PBS沖洗2～3 遍,加入150 μL含1 mmol/L PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液,用細(xì)胞刮收集細(xì)胞后冰浴20 min,于4 ℃、14 000×g離心10 min,取上清液即為提取的細(xì)胞總蛋白。按照試劑盒的步驟測(cè)定細(xì)胞總蛋白中MDA含量[25]。用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度。

1.3.5 SOD活力的測(cè)定

按照1.3.4節(jié)中的方法處理PC12細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白,用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度,按照SOD活力測(cè)定試劑盒步驟測(cè)定細(xì)胞總蛋白中SOD活力[25]。

1.3.6 Western Blot檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)

采用Western Blot實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Nrf2及其下游抗氧化酶HO-1和NQO-1蛋白的表達(dá)量。按照1.3.4節(jié)中的方法提取細(xì)胞總蛋白,按照細(xì)胞漿和細(xì)胞核蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)上的步驟提取細(xì)胞漿和細(xì)胞核蛋白。用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品濃度,并以V（蛋白樣品）∶V（上樣緩沖液）＝1∶4的比例計(jì)算上樣量。將樣品混勻后于65 ℃變性10 min,隨后上樣。在電壓90 V條件下電泳30 min,然后調(diào)節(jié)電壓至110 V電泳約1.5 h。90 V條件下轉(zhuǎn)膜2 h。將膜在溶于含吐溫20的Tris緩沖液（Tris buffered saline with Tween 20,TBST）的脫脂奶粉中封閉2 h。TBST清洗5 次,每次5 min,加入稀釋好的一抗,4 ℃孵育過(guò)夜。取出PVDF膜,TBST清洗5 次,每次5 min,加入稀釋好的二抗,室溫孵育2 h。將配好的化學(xué)發(fā)光液滴于膜上,通過(guò)凝膠成像儀成像,并通過(guò)Image Lab軟件定量分析[26]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,以3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,并采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析,P＜0.05表示存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜黃素及其代謝產(chǎn)物對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞存活率的影響

圖1 姜黃素及其代謝產(chǎn)物對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effects of curcumin and its metabolites on cell viability in H2O2-treated PC12 cells

如圖1所示,與對(duì)照組相比,0.5 mmol/L的H2O2處理導(dǎo)致細(xì)胞的存活率顯著下降了約40%（P＜0.05）。姜黃素、四氫姜黃素及姜黃素-β-D-葡糖苷酸處理對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞均有一定的保護(hù)作用。其中,與H2O2損傷組相比,姜黃素處理組和姜黃素-β-D-葡糖苷酸處理組對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用均呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性,隨著藥物處理劑量的增加,細(xì)胞存活率顯著增加（P＜0.05）。在最高處理濃度為7.5 μmol/L,姜黃素處理組的細(xì)胞存活率最高（101.88%）,其次為姜黃素-β-D-葡糖苷酸處理組（76.66%）。四氫姜黃素處理組僅在高濃度（5 μmol/L和7.5 μmol/L）時(shí)表現(xiàn)出一定的細(xì)胞保護(hù)作用,但細(xì)胞存活率均低于相同濃度條件下的姜黃素處理組和姜黃素-β-D-葡糖苷酸處理組。在用7.5 μmol/L四氫姜黃素處理時(shí),細(xì)胞存活率低于5 μmol/L處理組,這可能是由于過(guò)氧化氫損傷導(dǎo)致細(xì)胞抵抗能力減弱,較高濃度的四氫姜黃素（7.5 μmol/L）處理對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了一定的毒性作用。Yang Bobo等[25]也發(fā)現(xiàn)了類似的研究結(jié)果。

2.2 姜黃素及其代謝產(chǎn)物對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響

ROS是細(xì)胞氧化損傷的一個(gè)重要標(biāo)志,采用DCFH-DA熒光探針?lè)z測(cè)了姜黃素及其代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響。如圖2所示,在對(duì)照組細(xì)胞中,ROS產(chǎn)生較少；經(jīng)H2O2損傷刺激后,細(xì)胞內(nèi)ROS的水平顯著增加（P＜0.05）,約為對(duì)照組的141%。與H2O2損傷組相比,姜黃素及其代謝產(chǎn)物處理均能顯著降低H2O2導(dǎo)致的細(xì)胞ROS的升高（P＜0.05）,其中姜黃素和姜黃素-β-D-葡糖苷酸處理組均呈現(xiàn)出較好的劑量依賴性。在濃度為7.5 μmol/L時(shí),細(xì)胞中的ROS含量分別為對(duì)照組的60.90%、85.23%。四氫姜黃素處理的細(xì)胞在處理濃度為5 μmol/L時(shí)ROS含量最低,為對(duì)照組的76.53%。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,姜黃素及其代謝產(chǎn)物能夠顯著降低PC12細(xì)胞ROS的產(chǎn)生（P＜0.05）,從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷,其中姜黃素的保護(hù)效果要優(yōu)于姜黃素-β-D-葡糖苷酸和四氫姜黃素。

圖2 姜黃素及其代謝產(chǎn)物對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響Fig.2 Effects of curcumin and its metabolites on ROS generation in H2O2-treated PC12 cells

2.3 姜黃素及其代謝產(chǎn)物對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞MDA含量的影響

圖3 姜黃素及其代謝產(chǎn)物對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞MDA含量的影響Fig.3 Effects of curcumin and its metabolites on MDA level in H2O2-treated PC12 cells

MDA是評(píng)估氧化應(yīng)激的另一種標(biāo)志物。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,機(jī)體中ROS的過(guò)量積累會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化,從而造成脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的積累,并最終引起細(xì)胞損傷甚至凋亡[27]。姜黃素及其代謝產(chǎn)物對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞MDA含量的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。正常PC12細(xì)胞中,MDA的含量較低,約為0.20 μmol/mg。過(guò)氧化氫損傷顯著增加了PC12細(xì)胞中MDA含量（P＜0.05）,經(jīng)姜黃素及其代謝產(chǎn)物處理后,PC12細(xì)胞中MDA的含量均呈現(xiàn)不同程度的減少（P＜0.05）。在藥物處理濃度為7.5 μmol/L時(shí),姜黃素、四氫姜黃素及姜黃素-β-D-葡糖苷酸處理組的MDA含量較H2O2損傷組分別降低了45.12%、33.05%和33.13%。

2.4 姜黃素及其代謝產(chǎn)物對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞SOD活力的影響

細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的存在可以有效地抑制氧化并減少脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生,它們?cè)诰S持氧化和抗氧化防御系統(tǒng)之間的平衡中起關(guān)鍵作用。SOD是維持生物體中活性氧水平所必需的酶,是指示活性氧產(chǎn)生的生物標(biāo)志物[28],SOD的失活將使機(jī)體產(chǎn)生過(guò)量的活性氧,進(jìn)而引起氧化應(yīng)激[29]。

圖4 姜黃素及其代謝產(chǎn)物對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞SOD活力的影響Fig.4 Effects of curcumin and its metabolites on SOD activity in H2O2-treated PC12 cells

從圖4可知,與對(duì)照組相比,加入H2O2誘發(fā)氧化應(yīng)激狀態(tài)后,總SOD活力顯著降低了45.57%（P＜0.05）。加入不同濃度的姜黃素及其代謝產(chǎn)物處理后,細(xì)胞中SOD的活力均得到不同程度的提高。其中,姜黃素處理組呈現(xiàn)出較好的劑量依賴性,濃度為7.5 μmol/L時(shí)SOD活力提高至對(duì)照組的91.60%。與H2O2損傷組相比,四氫姜黃素和姜黃素-β-D-葡糖苷酸處理組在低濃度時(shí)對(duì)SOD活力無(wú)顯著影響（P＞0.05）,在高濃度（5 μmol/L和7.5 μmol/L）時(shí)具有顯著影響（P＜0.05）。濃度為7.5 μmol/L時(shí),四氫姜黃素和姜黃素-β-D-葡糖苷酸處理組細(xì)胞SOD的活力分別提升至對(duì)照組的59.21%和77.71%。

2.5 姜黃素及其代謝產(chǎn)物對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5.1 對(duì)HO-1蛋白表達(dá)的影響

HO-1是血紅素降解過(guò)程中的限速酶,它將血紅素轉(zhuǎn)化為膽綠素,促進(jìn)一氧化碳和鐵的釋放,在細(xì)胞保護(hù)中起著至關(guān)重要的作用,發(fā)揮抗氧化、抗炎和抗凋亡等生物學(xué)功能。姜黃素及其代謝產(chǎn)物對(duì)氧化損傷的PC12細(xì)胞HO-1蛋白表達(dá)的影響如圖5所示。

圖5 姜黃素及其代謝產(chǎn)物對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞HO-1表達(dá)的影響Fig.5 Effects of curcumin and its metabolites on hemeoxygenase-1 expression in H2O2-treated PC12 cells

與對(duì)照組相比,H2O2損傷顯著降低了PC12細(xì)胞中HO-1蛋白的表達(dá)（P＜0.05）,而姜黃素及其代謝產(chǎn)物處理顯著抑制了H2O2損傷導(dǎo)致的HO-1蛋白的下降（P＜0.05）。姜黃素處理組和姜黃素-β-D-葡糖苷酸處理組呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)。在濃度為7.5 μmol/L時(shí),姜黃素、四氫姜黃素和姜黃素-β-D-葡糖苷酸處理組與H2O2損傷組相比,HO-1蛋白表達(dá)分別增加了123.70%、65.20%和68.10%。這些結(jié)果表明姜黃素及其代謝產(chǎn)物能夠促進(jìn)H2O2損傷的PC12細(xì)胞HO-1蛋白的表達(dá),進(jìn)而抵御細(xì)胞氧化損傷,其中以姜黃素的作用效果最為顯著。

2.5.2 對(duì)NQO-1蛋白表達(dá)的影響

NQO-1是一種II相解毒酶,它專一性催化細(xì)胞內(nèi)雙電子還原反應(yīng),解除醌類物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的毒害,從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用。如圖6所示,H2O2處理能夠顯著降低PC12細(xì)胞NQO-1蛋白的表達(dá)量（P＜0.05）,為對(duì)照組的88.19%。與H2O2損傷組相比,姜黃素及其代謝產(chǎn)物處理顯著增加了NQO-1蛋白的表達(dá)量（P＜0.05）,并具有劑量依賴性。濃度為7.5 μmol/L時(shí),3 種物質(zhì)對(duì)NQO-1的誘導(dǎo)作用均達(dá)到最大。與損傷組相比,姜黃素處理組提高了43.60%,四氫姜黃素處理組提高了30.10%,姜黃素-β-D-葡糖苷酸處理組提高了27.30%。

圖6 姜黃素及其代謝產(chǎn)物對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞NQO-1表達(dá)的影響Fig.6 Effects of curcumin and its metabolites on NADPH quinineoxidoreductase-1 expression in H2O2-treated PC12 cells

2.6 姜黃素及其代謝產(chǎn)物對(duì)PC12細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)的影響

圖7 姜黃素及其代謝產(chǎn)物對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞Nrf2表達(dá)的影響Fig.7 Effects of curcumin and its metabolites on Nrf2 expression in H2O2-treated PC12 cells

Nrf2是機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子,氧化應(yīng)激的產(chǎn)生可以導(dǎo)致Nrf2從keap1蛋白上解離并移位至細(xì)胞核,從而使Nrf2被激活,活化的Nrf2可以通過(guò)調(diào)節(jié)II相解毒酶、抗氧化酶系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄和翻譯,從而抵御機(jī)體由于ROS造成的損傷[30-31],因此,進(jìn)一步檢測(cè)姜黃素及其代謝產(chǎn)物對(duì)PC12細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果如圖7所示。

與對(duì)照組相比,H2O2損傷組細(xì)胞質(zhì)中Nrf2蛋白的表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）,但細(xì)胞核中的Nrf2蛋白表達(dá)量無(wú)顯著變化（P＞0.05）,說(shuō)明H2O2損傷降低了PC12細(xì)胞總Nrf2蛋白的表達(dá)量,但是由于H2O2處理導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度氧化損傷,Nrf2表達(dá)量降低,可能使Nrf2不足以由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移。與H2O2損傷組相比,姜黃素及其代謝產(chǎn)物處理顯著增加了細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白的表達(dá)量（P＜0.05）,其中姜黃素、四氫姜黃素和姜黃素-β-D-葡糖苷酸在濃度為7.5 μmol/L時(shí),細(xì)胞質(zhì)中Nrf2表達(dá)量分別提高了102.80%、24.48%、69.54%,細(xì)胞核內(nèi)Nrf2表達(dá)量分別提高了115.10%、32.09%、86.20%。Gao Shuang等[32]研究表明,姜黃素不僅可顯著增加氧化損傷的小鼠肝臟內(nèi)總Nrf2蛋白水平,還可使Nrf2蛋白易位進(jìn)入細(xì)胞核,從而激活Nrf2蛋白。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。姜黃素及其代謝產(chǎn)物不僅能夠激活氧化損傷的PC12細(xì)胞中Nrf2蛋白的表達(dá)量,而且還能促進(jìn)Nrf2向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移,從而激活下游抗氧化酶活性,抵御細(xì)胞氧化損傷。

3 討 論

近年來(lái),食物中的酚類物質(zhì)因其廣泛的生物學(xué)活性受到關(guān)注。其在體內(nèi)往往需經(jīng)過(guò)復(fù)雜的生物轉(zhuǎn)化才能被機(jī)體利用,在體內(nèi)的代謝主要分為兩相,第I相主要是官能團(tuán)化反應(yīng),在酶的催化下對(duì)藥物分子進(jìn)行的氧化、還原、水解和羥化等反應(yīng),在化合物中引入或使其暴露出極性基團(tuán)；第II相又稱結(jié)合反應(yīng),將第I相中化合物產(chǎn)生的極性基團(tuán)與體內(nèi)的內(nèi)源性成分,如葡萄糖醛酸、硫酸等,經(jīng)共價(jià)鍵結(jié)合,生成極性大、易溶于水和易排出體外的結(jié)合物[33]。市面上的大多數(shù)藥物通常會(huì)在高劑量下精準(zhǔn)釋放,從而避免了代謝過(guò)程,這確保了足夠數(shù)量的活性藥物以未代謝、未結(jié)合的形式被運(yùn)送到適當(dāng)?shù)慕M織。相反,通過(guò)飲食傳遞的多酚類物質(zhì)往往含量較低,絕大部分都要經(jīng)歷代謝轉(zhuǎn)化過(guò)程。因此,為揭示膳食多酚對(duì)多種疾病的預(yù)防和治療作用機(jī)制,研究其代謝產(chǎn)物的生物活性或許具有重要意義[34]。Holder等[35]對(duì)姜黃素在大鼠體內(nèi)的代謝研究發(fā)現(xiàn),姜黃素的I相代謝產(chǎn)物主要為四氫姜黃素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)約50%）、六氫姜黃素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)約42%）,以及少量的阿魏酸。而姜黃素的I相代謝產(chǎn)物一部分會(huì)進(jìn)行II相代謝,代謝產(chǎn)物主要以葡萄糖醛酸類化合物存在[36]。

本實(shí)驗(yàn)比較了姜黃素及其兩種主要代謝產(chǎn)物對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果表明,姜黃素及其代謝產(chǎn)物能夠清除細(xì)胞內(nèi)ROS,提高SOD活力,激活Nrf2信號(hào)通路,上調(diào)HO-1、NQO-1的表達(dá),從而降低細(xì)胞氧化損傷,提高細(xì)胞存活率。然而,姜黃素及其代謝產(chǎn)物對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用效果具有一定差異?？傮w來(lái)看,經(jīng)代謝修飾后的產(chǎn)物——四氫姜黃素和姜黃素-β-D-葡糖苷酸的抗氧化損傷作用弱于姜黃素,這與前人研究的結(jié)果類似。Pan等[20]證明姜黃素比四氫姜黃素具有更好的抗炎活性,姜黃素可顯著降低脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中iNOS基因水平,促進(jìn)IκB的降解,激活NF-κB轉(zhuǎn)錄因子,而四氫姜黃素、六氫姜黃素和八氫姜黃素的活性較低。此外,Shoji等[37]也證明姜黃素葡糖苷酸對(duì)HepG2細(xì)胞存活率及mRNA的影響弱于姜黃素,這可能與姜黃素和黃素葡糖苷酸在HepG2細(xì)胞中的相對(duì)吸收速率有關(guān)。在將來(lái)的研究中,進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)揭示姜黃素修飾前后產(chǎn)物的構(gòu)效關(guān)系和吸收速率是必要的。