包裝充氧量對無水活運花鱸鰓組織結(jié)構(gòu)及相關(guān)酶活性的影響

張玉晗,謝 晶

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評價專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺,食品科學(xué)與工程國家級實驗教學(xué)示范中心（上海海洋大學(xué)）,上海 201306）

花鱸（Lateolabrax maculatus）,屬鱸形目、鮨科、花鱸屬,棲息于河口咸淡水處,為廣鹽性魚類[1]?；|可以通過低溫誘導(dǎo)休眠的方式進(jìn)行無水保活（臨界冰溫4 ℃,無水?；顣r間8 h）,常溫恢復(fù)后魚體可回到正常狀態(tài)并存活一段時間[2]。

魚鰓幾乎同時擔(dān)負(fù)了相當(dāng)于哺乳動物肺和腎臟的主要功能,內(nèi)有密集的血管、高度特化的上皮細(xì)胞,可直接進(jìn)行物質(zhì)、氣體交換,結(jié)構(gòu)極其精妙、復(fù)雜。雖然魚類也有頭、腎和皮膚等輔助呼吸器官,但鰓仍是魚類最主要的呼吸器官。無水活運過程中使用高濃度O2包裝花鱸,是為了提高魚呼吸器官效率,此時魚表皮黏液和魚鰓上皮細(xì)胞同時接觸高濃度O2,而與O2直接接觸會加速鰓組織上皮細(xì)胞膜中的脂質(zhì)氧化,形成膜脂過氧化物和丙二醛（malondialdehyde,MDA）,而MDA會引起蛋白分子內(nèi)和分子間的交聯(lián),這進(jìn)一步破壞了魚鰓上皮細(xì)胞膜的流動性、通透性和完整性,使得魚鰓上皮細(xì)胞膜的主動運輸與滲透壓調(diào)節(jié)等功能出現(xiàn)障礙[3-4]。過高濃度的O2包裝也會導(dǎo)致魚體產(chǎn)生出過多的氧自由基,細(xì)胞內(nèi)的自由基不能被及時清除則會攻擊生物的蛋白質(zhì)、脂肪和核酸等細(xì)胞成分,為抵御這些攻擊,機(jī)體的抗氧化防御體系被激活,超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）可以阻斷自由基對細(xì)胞的損害,保護(hù)機(jī)體免受損傷[5-6]。在生理狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)同時存在以SOD介導(dǎo)的氧自由基反應(yīng)和MDA介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng),這兩種反應(yīng)對機(jī)體新陳代謝起著重要作用[7-8]。溶菌酶自身較穩(wěn)定,但包裝中潮濕的木屑易引起魚體表皮溶菌酶分泌功能不正常,進(jìn)而導(dǎo)致其濃度改變。對黑鯛[9]、鯽魚[10]、黃顙魚[11]的無水?；钛芯堪l(fā)現(xiàn),純氧包裝供氧相比空氣包裝能延長無水?；顣r間。本實驗研究不同充氧量（體積分?jǐn)?shù)分別60%、80%、98%）包裝對花鱸血清MDA濃度、SOD活力、表皮黏液溶菌酶活力和鰓組織形態(tài)學(xué)變化的影響,縮小無水保活運輸包裝充氧量的范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花鱸購自上海當(dāng)?shù)厮a(chǎn)品市場。挑選體質(zhì)健康、無外傷、鱗片完整、大小基本一致（體長約40 cm）的活花鱸作為實驗材料。實驗用水：由經(jīng)顆?；钚蕴窟^濾后曝氣的自來水和海鹽配制而成,實驗開始前1 d配制,連續(xù)曝氣24 h后用于實驗。水溫22～23℃、鹽度16‰～17‰、溶解氧4～6 mg/L、pH 7.5～8.5。

MDA檢測試劑盒、溶菌酶檢測試劑盒、SOD檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動循環(huán)冷水機(jī) 廣東海利集團(tuán)；LX-100VTR模擬運輸振動臺 上海魯軒儀器設(shè)備廠；SH-1000Lab-全波長酶標(biāo)儀 北京宏昌信科技有限公司；5810R高速冷凍離心機(jī) 上海艾測電子科技有限公司；Axio Scope A1光學(xué)顯微鏡 德國卡爾蔡司公司；切片機(jī) 德國Leica公司；K-600泵吸式氣體檢測儀 河南凱陸電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花鱸魚的暫養(yǎng)

暫養(yǎng)箱中魚密度1 尾/50 L,禁食暫養(yǎng)時間12 h；先暫養(yǎng)后冷馴化,設(shè)置冷水機(jī)以3 ℃/h降溫速率將暫養(yǎng)箱中水溫從22～23 ℃歷時6 h降至冰溫4 ℃；此時,魚體呼吸頻率（24±3）次/min,魚體失去平衡、魚腹朝上,裂鰓,刺激反應(yīng)遲鈍,進(jìn)入休眠狀態(tài)。

1.3.2 花鱸魚的包裝與分組

實驗共分為4 組,即對照組（CK組）和O2體積分?jǐn)?shù)60%、80%、98%包裝處理組,每組樣品15 條,CK組正常養(yǎng)在水池內(nèi)樣品5 條,實驗總數(shù)為50 條。將暫養(yǎng)箱中的花鱸撈出,放于泡沫箱（36 cm×45 cm×13 cm）內(nèi)的濕木屑上（4 ℃、鹽度16‰～17‰水潤濕1 h后瀝干）,然后裝入塑料袋內(nèi)（1 箱/袋）,冰袋放進(jìn)塑料袋內(nèi)的濕木屑上不與魚接觸,充入O2（泵吸式氣體檢測儀檢測氣體體積分?jǐn)?shù),O2體積分?jǐn)?shù)分別為60%、80%、98%）后扎緊袋口；再放入振動臺上的4 ℃保溫箱內(nèi)。在振動臺上進(jìn)行模擬運輸實驗,運輸總時間8 h[12]。模擬運輸8 h后,打開包裝,取出魚放入4 ℃水中,使用冷水機(jī)及冰袋以5 ℃/h升溫速率將水溫升至22～23 ℃喚醒。在運輸0（降溫后未包裝運輸）、1、2、8 h和喚醒后隨機(jī)選取5 條魚進(jìn)行指標(biāo)測定。

1.3.3 指標(biāo)測定

參考張玉晗等[13]的方法進(jìn)行花鱸取血操作,采用相關(guān)檢測試劑盒測定血清中花鱸SOD活力、MDA濃度。

參考王曉雯等[14]的方法制備花鱸體表黏液樣品,采用溶菌酶檢測試劑盒測定體表黏液中溶菌酶活力。

參考阮成旭[15]、區(qū)又君[16]等的方法進(jìn)行魚鰓光學(xué)顯微鏡、掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡制片和觀察。為確保本研究圖片的代表性,實驗過程中每組至少觀察4 個切片,所選觀察組為鰓表面氧化變化最明顯的實驗組。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用SPSS19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,采用Origin軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 包裝充氧量對無水活運花鱸血清SOD活力、MDA濃度的影響

SOD為內(nèi)源性抗氧化因子,是率先起作用的抗氧化酶之一,來源于線粒體及過氧化物酶體,廣泛存在于細(xì)胞漿中,具有消耗自由基的作用,可減少細(xì)胞損害,與機(jī)體的抗外源脅迫密切相關(guān)[17]。在外源環(huán)境因子脅迫下,SOD活力通常表現(xiàn)為顯著升高,SOD活力高低能間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力[18]。脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)便可產(chǎn)生MDA,魚鰓上皮細(xì)胞膜上存在的大量多不飽和脂肪酸,對氧化應(yīng)激較敏感,是氧化應(yīng)激攻擊的目標(biāo)。血清中MDA濃度可反映細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的程度,并間接反映自由基的水平。MDA濃度也可與蛋白質(zhì)的游離氨基作用,引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間交聯(lián),直接導(dǎo)致細(xì)胞損傷[19-20]。魚體正常情況下上述兩種反應(yīng)處于協(xié)調(diào)與動態(tài)平衡的狀態(tài),而魚體在無水活運過程中,會產(chǎn)生過量的氧自由基,進(jìn)而引起脂類、蛋白質(zhì)和核酸等大分子過氧化,魚體抗氧化應(yīng)激表現(xiàn)為SOD、MDA水平呈上升趨勢。

由圖1可知,包裝充氧量對花鱸血清中SOD、MDA水平影響較大。CK組SOD活力為（5.38±0.29）U/mL,MDA濃度為（14.93±1.54）nmol/mL,運輸0 h（降溫未包裝運輸）,不同O2包裝組SOD、MDA水平與CK組相比升高,表明降溫過程刺激魚體產(chǎn)生氧自由基,SOD活力升高以清除自由基,從而減輕運輸應(yīng)激對機(jī)體的損傷。潘桂平等[21]研究的低溫（9 ℃）脅迫云紋石斑幼魚7 d,其血清中SOD活力較脅迫前顯著上升。由圖1A可知,包裝運輸1 h,花鱸血清SOD活力下降,可能是運輸脅迫魚體產(chǎn)生的大量自由基消耗了SOD；也可能是SOD處于應(yīng)激適應(yīng)階段,其濃度有所降低。結(jié)合圖1A、B可知,在運輸2～8 h,60% O2包裝組的MDA濃度最低,SOD活力最高,這可能是由于因為運輸因素迫使魚體SOD活力升高,抗氧化酶清除自由基的能力較強(qiáng),故而氧化產(chǎn)物濃度低；98% O2包裝組MDA濃度下降,SOD活力則較穩(wěn)定；而80%組MDA濃度較穩(wěn)定。喚醒后各組花鱸血清SOD活力與運輸過程中相比降低并恢復(fù)至正常水平。

圖1 包裝充氧量對無水活運過程中花鱸血清SOD活力（A）、MDA濃度（B）的影響Fig.1 Effect of oxygen concentration in packaging atmosphere on serum SOD (A) and MDA (B) levels in Lateolabrax maculatus during waterless live transportation

2.2 包裝充氧量對無水活運花鱸體表黏液溶菌酶活力的影響

健康的魚體表包裹著一層黏液,這種黏液在魚類生活中直接接觸不同的環(huán)境應(yīng)激物,是防御的第一道防線。黏液中含有的溶菌酶具有水解致病菌黏多糖的功能,是魚類的非特異性免疫物質(zhì)之一[22-23]。

圖2 包裝充氧量對無水活運花鱸體表黏液溶菌酶活力的影響Fig.2 Effect of oxygen concentration in packaging atmosphere on LZM activity on body surface mucus of Lateolabrax maculatus during waterless transportation

CK組花鱸體表黏液溶菌酶活力為（9.58±2.84）U/mL。如圖2所示,運輸0 h,溶菌酶活力降低,說明花鱸黏液溶菌酶活性在經(jīng)降溫處理后受到低溫抑制,一方面可能是因為低溫導(dǎo)致嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌的溶菌酶減少；另一方面也可能是由于低溫導(dǎo)致血流緩慢,造成了溶菌酶分布范圍縮小[24]。運輸1 h,花鱸體表黏液溶菌酶活力未見回升,運輸1～2 h,60%、80% O2包裝組花鱸體表黏液溶菌酶活力升高,運輸2～8 h,60%、80% O2包裝組溶菌酶活力依舊處于較高水平,甚至接近CK組,溶菌酶水平回升有利于保護(hù)魚體免受病原侵害。98% O2包裝組在整個運輸過程中花鱸體表黏液溶菌酶活力均處于最低水平,可能是O2刺激超出花鱸的適應(yīng)范圍,導(dǎo)致溶菌酶活力下降,也可能是包裝環(huán)境中微生物數(shù)量引起的溶菌酶活力變化[25]。喚醒后花鱸體表黏液溶菌酶活力接近運輸0 h,暫養(yǎng)水可能降低溶菌酶活力?？梢娡獠恳蛩兀囟?、O2體積分?jǐn)?shù)、微生物數(shù)量等）可直接引起花鱸體表溶菌酶活力變化。

2.3 包裝充氧量對無水活運花鱸鰓的顯微、超微結(jié)構(gòu)影響

圖3 包裝充氧量對無水活運花鱸鰓絲橫截面顯微形態(tài)的影響（400×）Fig.3 Effect of oxygen concentration in packaging atmosphere on cross-sectional micromorphology of gill filaments in Lateolabrax maculatus during waterless live transportation (400 ×)

魚類的鰓器官表面積大,具有呼吸、滲透壓調(diào)節(jié)、排泄含氮廢物、酸堿平衡功能,相比其他器官更易受到外界環(huán)境脅迫的影響,危及魚體的正常生長[26-28]。取正常魚鰓（CK）、運輸0 h、運輸8 h時花鱸鰓絲進(jìn)行組織切片觀察,花鱸鰓絲包括鰓小片、鰓絲血管和結(jié)締組織等。圖3為鰓絲橫截面顯微結(jié)構(gòu),CK組花鱸鰓絲形態(tài)對稱、細(xì)長,血管飽滿、內(nèi)部充盈,具有發(fā)達(dá)的管囊系統(tǒng)（圖3A）。經(jīng)歷降溫處理后運輸0 h的鰓絲明顯腫脹、肥大、不對稱、邊緣模糊,可能是由于降溫使魚鰓消耗大量能量,導(dǎo)致變形（圖3B）。60% O2包裝組運輸8 h后與CK組相比,鰓絲腫脹、鰓小片融合,邊緣加厚（圖3C）。80% O2包裝組運輸8 h后,其腮最接近CK組的正常形態(tài),但由于運輸原因,呈現(xiàn)不對稱形態(tài),表明鰓絲彎曲。98% O2包裝組運輸8 h后,花鱸鰓絲輕微腫脹,鰓小片融合,末端膨大。鰓絲結(jié)構(gòu)極易受到外界環(huán)境影響,整個保活運輸操作中降溫處理對鰓絲的影響最大,包裝運輸過程中充氧量也對鰓絲形態(tài)有影響,在運輸過程中保證鰓絲正常形態(tài)有利于運輸結(jié)束后花鱸的恢復(fù)。

圖4 包裝充氧量對無水活運花鱸鰓小片表面微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of oxygen concentration in packaging atmosphere on mirostructure of gill lamellar surface of Lateolabrax maculatus during waterless live transportation

由圖4可知,鰓小片上皮細(xì)胞表面著生有環(huán)形微嵴（circulars microridged,CM）、星點棒狀（star point rodshaped,SPRS）和微絨毛（microvilli,MIC）,CM形成類似迷宮的紋路,具有較深的溝。CM輪廓直徑范圍為5.11～9.38 μm、SPRS輪廓直徑范圍為6.25～10.57 μm、MIC輪廓直徑范圍為6.89～9.57 μm。鰓小片上皮細(xì)胞表面凹陷,形成了類似丘陵的小山,增加了鰓小片的表面積,也可參與氣體交換[29-30]。CK組鰓小片平整,CM溝壑清晰,SPRS分布均勻（圖4A）；運輸0 h后,鰓小片上皮細(xì)胞CM溝壑加深,SPRS、MIC分布密集,且與CM連成一片,可能是上皮細(xì)胞因為降溫發(fā)生了皺縮（圖4B）；60%、80%、98% O2包裝組運輸8 h后,CM、SPRS數(shù)量減少,MIC幾乎不可見,可能是因為無水活運導(dǎo)致鰓小片缺水而發(fā)生皺起、不平,使其發(fā)生不可逆的形態(tài)變化。相比之下,80% O2包裝組花鱸鰓小片微觀形態(tài)更接近CK組。

圖5 包裝充氧量對無水活運花鱸鰓小片超微形態(tài)的影響Fig.5 Effect of oxygen concentration in packaging atmosphere on ultrastructure of gill filaments of Lateolabrax maculatus during waterless live transportation

由圖5可知,花鱸鰓絲邊緣有SPRS,內(nèi)部微細(xì)囊管系統(tǒng)極為發(fā)達(dá)、分布密集,細(xì)胞內(nèi)部線粒體數(shù)量多、體積大。線粒體是細(xì)胞代謝的能量來源,機(jī)體生命活動80%的能量來自線粒體,大體積的線粒體能更充分地利用包裝中O2,黏液細(xì)胞發(fā)達(dá)可分泌含溶菌酶的黏液形成魚鰓表面防線[31-32]。CK組花鱸鰓絲邊緣SPRS突出明顯,黏液細(xì)胞發(fā)達(dá),并與外界直接相連（圖5A）；運輸0 h組與CK組相比,線粒體數(shù)量增多,體積增大,表明魚體正需要大量能量；60%、80%、98% O2包裝組運輸8 h后,游離線粒體增多且趨于表皮,邊緣微嵴變粗且數(shù)量減少,可能是由于這些花鱸直接暴露于O2中,這與圖4中掃描電子顯微鏡觀察的結(jié)果一致。對比發(fā)現(xiàn),80% O2包裝組運輸8 h后,魚鰓組織形態(tài)更接近CK組。

3 討 論

無水活運過程中使用高體積分?jǐn)?shù)O2充注包裝,目的是為了提高體表花鱸輔助呼吸器官效率,但這也增加了氧自由基的生成,造成魚體細(xì)胞受損。已有關(guān)于無水活運研究多數(shù)采用純氧包裝,少數(shù)采用空氣包裝,關(guān)于無水運輸包裝中充氧體積分?jǐn)?shù)使用范圍過于寬泛,不利于實際應(yīng)用中精確控制,且造成資源浪費。在相同運輸時間下,60% O2包裝組花鱸血清中MDA濃度最低,80% O2組花鱸血清中SOD活力未隨運輸時間延長升高,充氧包裝會增加花鱸無水活運過程中的氧化應(yīng)激反應(yīng)。80% O2組溶菌酶活力維持在較高水平,98% O2包裝組花鱸體表黏液溶菌酶活力在運輸操作中較低,溶菌酶活力受環(huán)境刺激的影響,具體包括降溫操作、充氧濃度、微生物數(shù)量等；魚鰓組織形態(tài)因無水活運操作受到影響,不同O2體積分?jǐn)?shù)包裝運輸8 h后,花鱸魚鰓均出現(xiàn)不同了程度的鰓絲腫脹、鰓小片融合,邊緣加厚,末端膨大現(xiàn)象,其中80% O2包裝組運輸8 h后最接近CK組正常形態(tài),但由于運輸原因,呈現(xiàn)不對稱形態(tài),表明鰓絲彎曲。超微結(jié)構(gòu)顯示鰓小片因無水操作造成皺起不平,表面上皮細(xì)胞CM、SPRS數(shù)量減少,MIC幾乎不可見,鰓絲內(nèi)部游離線粒體增多且趨于表皮,黏液細(xì)胞減少,表皮邊緣微嵴變粗或脫落。充氧包裝提高魚呼吸器官效率,而與O2直接接觸會導(dǎo)致鰓組織上皮細(xì)胞輕微變化；因而,接近純氧的體積分?jǐn)?shù)98% O2的包裝運輸花鱸并未顯現(xiàn)優(yōu)勢。綜上,降低包裝中O2體積分?jǐn)?shù)至60%～80%對運輸中的花鱸?；罡幸嫣帯?/p>