王 晨，張俊紅，張 苗，許雯婷，樓雄珍，童再康

（浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300）

柳杉Cryptomeria fortunei為杉科Taxodiaceae柳杉屬Cryptomeria常綠高大喬木，是中國特有的用材與綠化樹種。天然種群集中分布于東南部的武夷山和天目山山脈，長江以南省區(qū)多有栽培[1]。柳杉生長快，生長期持久，樹干通直，材質(zhì)優(yōu)良，可廣泛應(yīng)用于建筑、橋梁、家具等，且樹姿雄偉，樹形優(yōu)美，是優(yōu)良的園林綠化樹種。同時(shí)，柳杉葉片對(duì)空氣顆粒物有著較強(qiáng)吸附能力，是重要環(huán)保樹種[2]。目前柳杉研究主要集中在育苗[3?6]、良種選育[7]、病蟲害[8?9]與生理生態(tài)[10?11]等方面。此外，學(xué)者進(jìn)行了簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)分子標(biāo)記引物篩選[12]與材性相關(guān)基因的篩選[13]等分子生物學(xué)方面的初步探索。此前柳杉種苗繁育仍采用播種[3?4]、扦插[5]與嫁接[6]等常規(guī)擴(kuò)繁方法，但即便是良種選育，也存在優(yōu)良材料繁殖系數(shù)低、繁育周期長等問題，有性繁育子代分離難以保持優(yōu)良性狀。植物組織培養(yǎng)是目前植物快速繁殖的重要手段，具有繁殖系數(shù)高、生產(chǎn)速度快、受外界環(huán)境影響小、可實(shí)現(xiàn)工廠化育苗、全年生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，在良種繁育上已具有諸多成功案例[14]。如張翠萍等[15]以柳杉種胚為實(shí)驗(yàn)材料，通過柳杉試管苗繁殖技術(shù)研究，建立了種子試管苗組培快繁體系；但該體系僅能應(yīng)用于分離世代的種子材料，受種胚采集時(shí)間和環(huán)境限制，繁殖效率偏低。祝晨辰等[16]以柳杉優(yōu)良無性系的莖段為外植體，建立了柳杉優(yōu)良無性系繁育技術(shù)體系，但不定芽增殖效率較低(1.23～5.00)。為提高柳杉的不定芽增殖效率，本研究以柳杉優(yōu)良無性系的莖段為外植體，以高效分段培養(yǎng)的方式進(jìn)行組織快繁，以期建立高效無性繁殖技術(shù)體系，為柳杉良種生產(chǎn)性規(guī)?；旆碧峁﹨⒖?。

1 材料與方法

1.1 材料

以浙江省文成縣石垟林場(chǎng)20年生柳杉無性系測(cè)定林中3個(gè)植株健壯、性狀優(yōu)良的無性系作為外植體，取當(dāng)年生幼嫩枝條，用洗滌劑浸泡30 min后輕刷枝條表面，并將其剪成獨(dú)立的帶頂芽莖段，流水沖洗2 h。無菌條件下用質(zhì)量濃度75.0%的乙醇浸泡20 s，再用質(zhì)量濃度0.1%的升汞消毒8 min，無菌蒸餾水沖洗4～5次，每次1～2 min。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.2.1 不定芽的誘導(dǎo)與增殖 為探索基本培養(yǎng)基、水解酪蛋白(CH)對(duì)不定芽誘導(dǎo)與增殖的影響，采用MS、DCR和WPM等3個(gè)基本培養(yǎng)基 ， 分別 添加 蔗 糖 30 g·L?1， 瓊 脂粉 7 g·L?1，pH值調(diào)至 5.8；設(shè)置 6-芐氨基腺嘌呤 (6-BA，0.10、0.50 和 1.00 mg·L?1)、吲哚丁酸 (IBA，0、0.10 和 0.30 mg·L?1)、水解酪蛋白 (CH，0、0.50和1.00 g·L?1)各3個(gè)水平，使用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)(表1)。每瓶接種2～3個(gè)莖段，每個(gè)處理10瓶，重復(fù)3次，40 d后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，計(jì)算不定芽誘導(dǎo)率與增殖系數(shù)。

1.2.2 不定芽的伸長 前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，組織培養(yǎng)過程中＜1 cm的不定芽操作效率偏低，微扦插生根效果不佳。本實(shí)驗(yàn)將芽長≥1 cm的不定芽定義為有效芽。為解決上一步實(shí)驗(yàn)中不定芽萌發(fā)多但有效芽少的問題，調(diào)整培養(yǎng)基植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度，設(shè)計(jì) B1(WPM+1.00 mg·L?16-BA+0.10 mg·L?1IBA)、B2(WPM+0.20 mg·L?16-BA+0.02 mg·L?1IBA)和 B3(不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的WPM培養(yǎng)基)等3個(gè)培養(yǎng)基組合，每瓶接種3～5個(gè)莖段，每個(gè)處理10瓶，重復(fù)3次。40 d后觀察芽伸長情況，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.2.3 生根培養(yǎng) 剪取不定芽長≥1 cm的有效芽進(jìn)行生根培養(yǎng)。在DCR和WPM培養(yǎng)基中添加0.10 mg·L?1IBA和不同質(zhì)量濃度(0、0.01、0.10 mg·L?1)萘乙酸(NAA)，每瓶接種3個(gè)有效芽，每個(gè)處理10瓶，重復(fù)3次。30 d后觀察并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.2.4 煉苗移栽 生根培養(yǎng)約40 d后，將株高≥5 cm且根系發(fā)達(dá)的柳杉無菌苗移至V(泥炭)∶V(蛭石)=1∶1的混合基質(zhì)常規(guī)管理。30 d后調(diào)查移栽存活率。

1.3 培養(yǎng)條件

以上培養(yǎng)條件均為光照時(shí)間16 h·d?1，光強(qiáng)2 000 lx，培養(yǎng)溫度(23±2) ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)實(shí)驗(yàn)獲得數(shù)據(jù)，分別計(jì)算以下指標(biāo)。

芽誘導(dǎo)率=出芽外植體數(shù)/總接外植體數(shù)×100%。芽增殖系數(shù)=誘導(dǎo)出的不定芽總數(shù)/外植體總數(shù)。有效枝條增長率=誘導(dǎo)出的有效枝條總數(shù)/原有效枝條總數(shù)×100%。不定根的誘導(dǎo)率=生根的枝條數(shù)/接種枝條總數(shù)×100%。平均不定根數(shù)=生根的總數(shù)/誘導(dǎo)出不定根的枝條數(shù)。平均根長=不定根的總長度/誘導(dǎo)出不定根的枝條數(shù)。移栽存活率=移栽存活的苗數(shù)/移栽的總苗數(shù)×100%。繁殖潛能(株·株?1·a?1)=繁殖系數(shù)3.75×生根率×移栽存活率。

采用SPSS 17.0和Excel先對(duì)百分率數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換，再進(jìn)行方差分析和LSD多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)柳杉芽誘導(dǎo)與增殖的影響

由表1知：各無性系在所有培養(yǎng)基中均能形成不定芽，但不同處理間芽的誘導(dǎo)率與增殖系數(shù)存在差異。綜合來看，A8處理優(yōu)于其他組合，不定芽誘導(dǎo)率和增殖系數(shù)達(dá)到最高，分別為100%和9.13。外植體在培養(yǎng)基中7 d左右開始萌動(dòng)，針葉基部的芽點(diǎn)膨大，隨后逐漸伸長，萌發(fā)出芽(圖1A)。從芽的生長狀況來看，A8芽萌發(fā)較多，葉色翠綠，生長健壯(圖1B)；A1芽萌發(fā)少，葉色較黃，芽苗瘦弱，生長狀況較差(圖1C)。

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，結(jié)果見表2。從誘導(dǎo)率來看，6-BA對(duì)柳杉莖段不定芽誘導(dǎo)率的影響占主導(dǎo)地位，極差(R)達(dá)40.63，其次是IBA(15.07)和基本培養(yǎng)基(12.82)，最后是CH(5.91)。其中最佳水平6-BA為1.00 mg·L?1，IBA 為 0.10 mg·L?1，CH 為 0.50 g·L?1，最佳基本培養(yǎng)基為DCR。因此，柳杉芽誘導(dǎo)與增殖的最佳基本培養(yǎng)方案為WPM+1.00 mg·L?16-BA+0.10 mg·L?1IBA。

表2 不定芽誘導(dǎo)與增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果極差分析Table 2 Range analysis on the induction and proliferation of adventitious buds

方差分析發(fā)現(xiàn)(表3)：6-BA對(duì)柳杉莖段不定芽的誘導(dǎo)率及增殖系數(shù)均有極顯著影響(P＜0.01)，基本培養(yǎng)基與IBA質(zhì)量濃度對(duì)柳杉莖段不定芽的增殖系數(shù)有顯著影響(P＜0.05)。

2.2 不同質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)柳杉不定芽伸長的影響

在繼代培養(yǎng)過程中，將幼芽接入最佳誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基后，各無性系不定芽增殖系數(shù)顯著提升。培養(yǎng)40 d后，接入不定芽伸長培養(yǎng)基。結(jié)果表明(表4)：相較于添加高質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基，低質(zhì)量濃度或不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基對(duì)柳杉不定芽的伸長有顯著促進(jìn)作用。其中B3處理下柳杉芽伸長效果最好，有效枝條多，長勢(shì)良好，有效枝條增長率達(dá)到456.87%；B1處理下柳杉芽基本沒有伸長，短芽多，植株發(fā)黃，甚至死亡。由圖1D(培養(yǎng)1 d)、圖1E(培養(yǎng)7 d)、圖1F(培養(yǎng)40 d)可知：B3處理下柳杉芽伸長良好。

表3 不同因素對(duì)莖段不定芽誘導(dǎo)與增殖影響的方差分析Table 3 Variance analysis on the induction and proliferation of adventitious buds

表4 不同質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽伸長的影響Table 4 Effects of different concentrations of plant growth regulators on elongation of adventitious buds

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)柳杉不定根發(fā)生的影響

待枝條生長到2～3 cm時(shí)剪下，插入生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)。結(jié)果表明(表5)：幼苗在2種基本培養(yǎng)基中生根情況無顯著差異。當(dāng)培養(yǎng)基中添加0.10 mg·L?1IBA時(shí)，枝條的生根率達(dá)到100%，生根速度較快，根多且健壯。平均生根數(shù)隨著NAA質(zhì)量濃度的升高而增加，但平均根長減小(圖1G )。當(dāng)培養(yǎng)基中添加少量NAA時(shí)，幼苗基部先分化出少量愈傷組織，隨后從愈傷組織中分化出根，根條細(xì)弱，根數(shù)較多，根長度較短。隨著NAA質(zhì)量濃度升高，生根率逐漸降低，愈傷組織增多；至0.10 mg·L?1時(shí)，幼苗基部分化出大量愈傷組織，生根受到抑制，莖段發(fā)黃，最終整株死亡。C1處理下柳杉幼苗生根率較高，根長度大，與其他處理差異顯著。因此，DCR+0.10 mg·L?1IBA為生根的最適培養(yǎng)基。幼苗在最佳不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生長，7 d左右長出白色的根尖，之后根迅速伸長，30 d后形成良好根系。由圖1G可知：無性系在C1培養(yǎng)基中生根情況最好。

圖1 柳杉莖段的不定芽誘導(dǎo)和植株再生Figure 1 Adventitious buds induction and plant regeneration of C. fortunei sterile seedlings

表5 不同培養(yǎng)基對(duì)生根的影響Table 5 Effects of different mediums on the percentage of rooting

2.4 煉苗與移栽

組培苗經(jīng)煉苗移栽，約15 d后發(fā)出新芽。檢查根部有新根長出即移栽成活，移栽成活率達(dá)96.70%，成活植株長勢(shì)較好且一致。圖1H可知：無菌苗移栽1、15和40 d后生長良好。

2.5 分段培養(yǎng)效果

將誘導(dǎo)與繼代增殖的不定芽進(jìn)行分段培養(yǎng)。首先，將經(jīng)消毒的外植體接入誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)與增殖；接著，將誘導(dǎo)與增殖的不定芽接入伸長培養(yǎng)基進(jìn)行伸長培養(yǎng)；然后，將經(jīng)過伸長培養(yǎng)的枝條剪下，一部分接入生根或增殖不定芽，進(jìn)行分段循環(huán)培養(yǎng)；最后，將生根完成的無菌苗移栽煉苗，投入常規(guī)容器苗培育。經(jīng)分段培養(yǎng)的組培苗，各無性系不定芽得到有效利用，有效枝條比例顯著提升，單個(gè)外殖體的繁殖潛能高達(dá) 3 865 株·株?1·a?1。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

植物組織培養(yǎng)中，基本培養(yǎng)基的區(qū)別主要在于無機(jī)鹽的種類和含量的不同[17]。MS培養(yǎng)基中無機(jī)鹽和離子濃度較高，具有較穩(wěn)定的離子平衡，養(yǎng)分的數(shù)量和比例合適，因而適用范圍比較廣，是多數(shù)植物組織培養(yǎng)快速繁殖的基本培養(yǎng)基。相較于MS培養(yǎng)基，DCR與WPM培養(yǎng)基均是低鹽培養(yǎng)基。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：DCR與WPM培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果均優(yōu)于常用的MS基本培養(yǎng)基；不定芽誘導(dǎo)中DCR培養(yǎng)基效果最佳，不定芽增殖中WPM效果最佳。這與低鹽培養(yǎng)基更適合于外植體生長和增殖的報(bào)道相符[18]。

植物生長調(diào)節(jié)劑尤其生長素和細(xì)胞分裂素在調(diào)控離體器官發(fā)生中起關(guān)鍵作用[19]。本研究中選用6-BA和IBA作為植物生長調(diào)節(jié)劑，選用CH作為營養(yǎng)物質(zhì)，研究不同組合在柳杉芽誘導(dǎo)過程中的作用。結(jié)果表明：6-BA最佳質(zhì)量濃度為1.00 mg·L?1，同時(shí)添加少量的IBA(0.10 mg·L?1)誘導(dǎo)率可達(dá)100%，增殖系數(shù)達(dá)到9.0以上。有研究[20]表明：CH對(duì)獼猴桃Actinidia chinensis芽苗的生長有一定促進(jìn)作用；本研究中，添加CH的處理組合其誘導(dǎo)與增殖效果均無明顯差異，可見CH不適用于柳杉不定芽的誘導(dǎo)與增殖。

有研究認(rèn)為：繁殖系數(shù)過高，不定芽過度增殖會(huì)引起組培苗弱化，生長勢(shì)變差[21]。崔佩榮[22]在對(duì)紫萼Hosta ventricosa繼代增殖培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)：有效芽增殖系數(shù)隨著植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度增加呈先上升后再下降規(guī)律，影響有效芽增殖。本研究采用高質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基與低質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基交替繼代，對(duì)柳杉組培苗進(jìn)行分段培養(yǎng)，可有效解決上述問題，顯著加快柳杉組織培養(yǎng)進(jìn)程，為工廠化育苗提供了有效途徑。

大量研究[23]表明：培養(yǎng)基的無機(jī)鹽質(zhì)量濃度降至一半，可有效提高大多數(shù)植物的生根能力；WPM和DCR培養(yǎng)基是低鹽培養(yǎng)基，因此常和不同質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)劑配合誘導(dǎo)組培苗生根。本實(shí)驗(yàn)利用WPM和DCR培養(yǎng)基配合低質(zhì)量濃度的IBA誘導(dǎo)生根，柳杉幼苗生根率高達(dá)100%，同時(shí)生根較快，根系健壯。生根的無菌苗移栽至V(泥炭)∶V(蛭石)=1∶1的基質(zhì)中，澆透水，保持相對(duì)濕度90%～100%，30 d后存活率達(dá)96.70%。

3.2 結(jié)論

本研究建立的柳杉外植體分段培養(yǎng)再生體系，主要包括叢生芽誘導(dǎo)、伸長、生根及移栽等。不定芽誘導(dǎo)與增殖階段，無性系在WPM+1.00 mg·L?16-BA+0.10 mg·L?1IBA中培養(yǎng)，不定芽誘導(dǎo)率(100%)和增殖系數(shù)(9.13)顯著高于其它處理；不定芽伸長階段采用高-低質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基交替分段培養(yǎng)，柳杉無性系繼代增殖效果良好，有效枝條增長率可達(dá)到456.87%；生根培養(yǎng)階段，無性系離體生根的最適宜培養(yǎng)基為DCR+0.10 mg·L?1IBA，且3個(gè)無性系生根率最高可達(dá)100%；煉苗移栽階段，生根的無菌苗移栽至V(泥炭)∶V(蛭石)=1∶1的混合基質(zhì)，經(jīng)過15～20 d煉苗，成活率高達(dá)96.70%。從不定芽的誘導(dǎo)到生根僅需4～5個(gè)月，繁殖潛能高達(dá)3 865株·株?1·a?1。綜上所述，柳杉分段培養(yǎng)的組培模式可有效解決柳杉外植體叢芽分化能力強(qiáng)而芽伸長不足的問題。