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      響應(yīng)面優(yōu)化火麻油及有氧運動對骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響

      2020-08-24 01:02:40
      食品研究與開發(fā) 2020年15期
      關(guān)鍵詞:麻油液料骨密度

      (鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學院,河南鄭州451199)

      火麻,別稱山絲苗、線麻、胡麻、漢麻等。??疲舐閷僖荒晟绷⒉荼?,在我國種植火麻的主要地方包括廣西、云南、甘肅等省份[1]?;鹇橛偷臓I養(yǎng)成分,其中不飽和脂肪酸含量豐富,大約有89%左右,不飽和脂肪酸主要為油酸占9.6%~14.7%、亞油酸占52.2%~58.2%和亞麻酸占15.2%~23.9%[2-3]?;鹇橛椭羞€含有氨基酸、維生素E、礦物質(zhì)元素、不溶性纖維、甾體類、生物堿類、黃酮類和苷類等成分,所以營養(yǎng)價值非常豐富[4-5]。尤其火麻油含有豐富的礦物質(zhì)元素,K、Mg、Ca、Na、Fe、Mn、Cu、Zn 等人體必需的礦物質(zhì),其中元素 K、Mg、Ca的含量特別高[6]。K是細胞內(nèi)液的主要離子,Mg對機體心臟的調(diào)節(jié)起到重要作用,Ca是骨骼、牙齒及軟組織的重要成分,缺鈣易得佝僂病、骨質(zhì)疏松癥、心血管病等[7]。

      骨質(zhì)疏松癥是一種以全身骨量減少、骨密度損失及骨組織微觀結(jié)構(gòu)退化為特征,骨折危險性增大的全身代謝性疾病[8]。臨床以周身疼痛、身高降低、駝背、脆性骨折及呼吸系統(tǒng)受影響等為主要表現(xiàn)[9]。因此,改善骨質(zhì)疏松主要就是減少骨量丟失,增加骨質(zhì)形成,補充骨礦物質(zhì),提高骨密度。諸多研究表明,運動鍛煉有利于骨質(zhì)健康,增加骨代謝,使骨形成較好的結(jié)構(gòu)和強度。一旦運動不足會導(dǎo)致骨密度低下,增加患骨質(zhì)疏松癥的風險[10-11]。

      當前,對于火麻油的提取主要有肇立春等[12]利用冷榨法來提取火麻油,彭丹[13]等利用微波輔助來提取火麻油,曾凡炎等[14]利用超聲波與微波輔助來提取火麻油,以上幾種方法在提取火麻油中較為普遍。本文利用響應(yīng)面優(yōu)化溶劑法提取火麻油,以便為今后的工業(yè)生產(chǎn)提供更多的技術(shù)支持。由于火麻油的微量元素含量較為豐富,并且根據(jù)其Ca含量較高的特點,而且Ca是骨骼中重要組成部分,設(shè)計一個大鼠骨質(zhì)疏松的模型,通過雌性大鼠摘除卵巢,使體內(nèi)雌激素分泌減少,雌激素在機體內(nèi)由于參與骨代謝,從而造成骨吸收增強,致使快速的骨丟失,考察火麻油對大鼠骨密度的影響。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      火麻仁:長春市方一堂經(jīng)貿(mào)有限公司;石油醚:天津科密歐試劑有限公司;大鼠骨鈣素(OC)、磷(P)、雌二醇試劑盒:南京建成生物工程研究所;SPF級雌性SD大鼠50只 [體重在(150±5)g[SYXK(蘇)2018-0008)]:江蘇集萃藥康生物科技有限公司。

      1.2 儀器與設(shè)備

      KJ3000+骨密度儀:南京科進實業(yè)有限公司;RE-201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:鄭州科文儀器設(shè)備有限公司;HZY-1202型天子天平:上海茂宏電子科技有限公司;DFT-100A型粉碎機:無錫久平儀器有限公司;BK-200型生化分析儀:山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司;ZH-PT型動物實驗跑臺:安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司。

      1.3 方法

      1.3.1 火麻油的制備

      選取火麻仁適量,將其粉碎至粒度為可以過100目篩。將之前處理好的火麻仁粉末稱取適量,放入圓底燒瓶中,加入一定量的石油醚,調(diào)節(jié)到設(shè)置的溫度、提取時間,進行提取,提取完成后,蒸發(fā)掉溶劑,干燥稱重,得到火麻油[13,15]。

      式中:Y為火麻油得率,%;m火麻油質(zhì)量,g;n火麻仁粉末質(zhì)量,g。

      1.3.2 單因素試驗

      在提取溫度40℃、提取時間90 min,設(shè)定不同液料比為 6 ∶1、10 ∶1、14 ∶1、18 ∶1、22 ∶1(mL/g);在液料比為 14 ∶1(mL/g)、提取時間 90 min,設(shè)定不同提取溫度分別為 30、35、40、45、50 ℃;在液料比為 14 ∶1(mL/g)、提取溫度40℃,設(shè)定不同提取時間分別為30、60、90、120、150 min,考察火麻油得率的影響。

      1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化火麻油提取工藝

      在單因素試驗的基礎(chǔ)上,通過火麻油得率(Y)為指標,液料比(X1)、提取溫度(X2)和提取時間(X3)為因素,進行三因素三水平響應(yīng)面試驗設(shè)計,采用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計的Box-Behnken試驗,試驗因素與水平見表1。

      表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素水平Table 1 Box-Behnken test design factor level

      1.3.4 動物模型、分組以及運動方案

      模型設(shè)計:大鼠使用35 mg/kg戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔麻醉后,剃掉其毛發(fā),在大鼠的脊柱兩側(cè)切開背肌大約1.5 cm切口,摘除卵巢。使用可以吸收的羊腸線縫合大鼠傷口,術(shù)后腹腔注射60×104U/kg青霉素鈉,1次/d,持續(xù)注射5 d,以防術(shù)后感染。大鼠全部存活并沒有出現(xiàn)感染癥狀[16]。

      選取SPF級雌性SD大鼠50只,體重在(150±5)g,隨機分成5組,每個小組10只大鼠,分成對照組、模型組、運動組、火麻油組、火麻油運動組。其中對照組不進行手術(shù),其余組以戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,摘除雙側(cè)卵巢。除了對照組、模型組、火麻油組,其余2組SD大鼠放置在動物跑臺上進行跑步訓(xùn)練,第一周對大鼠進行跑步適應(yīng)訓(xùn)練,將跑臺參數(shù)設(shè)置成0度、10 m/min、45 min,使大鼠跑步訓(xùn)練保持45 min;第二周開始將跑臺參數(shù)設(shè)置成7度、25 m/min,直至大鼠力竭。大鼠力竭的標準為,使用毛刷刺激大鼠尾部,大鼠在跑步過程中與跑臺預(yù)設(shè)速度出現(xiàn)不一致情況,其臀部壓在跑臺上,而且后肢與跑臺皮帶后拖達到20 s以上?;鹇橛徒M對其進行灌胃0.8 mg/g的火麻油;火麻油運動組在按照運動組進行跑步運動之外,每天對大鼠灌胃0.8 mg/g的火麻油,并觀察每天大鼠的變化,實驗持續(xù)6周[17-18]。

      1.3.5 相關(guān)指標檢測

      大鼠骨鈣素(OC)、磷(P)、雌二醇含量測定:各組大鼠麻醉后腹主動脈取血,分離血清,-25℃保存,根據(jù)酶學試劑盒的說明書檢測分析;骨密度測定:采用骨密度儀對大鼠腰椎骨進行檢查。

      1.4 統(tǒng)計學分析

      本文使用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)均使用均值±標準差來表示,采取組間進行對比,P<0.05、P<0.01表示具有統(tǒng)計學意義。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 單因素試驗

      2.1.1 液料比對火麻油得率的影響

      液料比對火麻油得率的影響見圖1。

      圖1 液料比對火麻油得率的影響Fig.1 Effect of liquid-to-material ratio on the yield of hemp oil

      由圖1分析,液料比的增加,使得火麻油的得率逐漸升高,在14∶1(mL/g)時得率達到最高,繼續(xù)增加液料比提取趨于不變。這是因為液料比的增加,使得火麻仁與提取溶劑之間接觸更加充分,提取逐漸提高。繼續(xù)增加液料比,火麻油得率反而趨于平衡,考慮到溶劑回收時間和成本的問題,因此液料比選擇14 ∶1(mL/g)。

      2.1.2 提取溫度對火麻油得率的影響

      提取溫度對火麻油得率的影響見圖2。

      由圖2分析,提取溫度的增加,使得火麻油的得率逐漸升高,當溫度達到45℃時得率達到最高,繼續(xù)升高溫度,火麻油得率出現(xiàn)降低。因為溫度過高會導(dǎo)致火麻油中其他活性成分在溶劑中的濃度隨之提高,從而與火麻油形成競爭,導(dǎo)致得率降低,另外溫度過高會導(dǎo)致火麻油營養(yǎng)成分被破壞,降低了原有的生物活性。

      圖2 提取溫度對火麻油得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of hemp oil

      2.1.3 提取時間對火麻油得率的影響

      提取時間對火麻油得率的影響見圖3。

      圖3 提取時間對火麻油得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of hemp oil

      由圖3分析,提取時間為90 min時,火麻油得率達到最高,時間繼續(xù)延長得率反而有所降低。這是由于90 min時,火麻油提取接近完全,從得率和節(jié)省時間等方面來分析,再繼續(xù)延長提取時間得率反而稍有降低,因此,選擇提取時間為90 min。

      2.2 響應(yīng)面法試驗結(jié)果與分析

      在單因素試驗的基礎(chǔ)上,確定各因素最佳水平值范圍,采用響應(yīng)面法試驗設(shè)計,以火麻油得率(Y)為指標,液料比(X1)、提取溫度(X2)和提取時間(X3)為因素,進行三因素三水平響應(yīng)面試驗,設(shè)計Box-Benhnken試驗中心組合試驗。響應(yīng)面分析方案與結(jié)果見表2。

      表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Box-Behnken test design and results

      續(xù)表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Continue table 2 Box-Behnken test design and results

      響應(yīng)面回歸模型ANOVA分析結(jié)果見表3。

      表3 響應(yīng)面回歸模型ANOVA分析結(jié)果Table 3 Response surface regression model ANOVA analysis results

      響應(yīng)面分析方案與結(jié)果如表2,采用Design-Expert 8.0軟件對表3試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,得到多元回歸方程:

      Y=-82.18+3.37X1+1.44X2+1.91X3-0.70X1X2+0.26X1X3-0.25X2X3-3.88X12-3.99X22-2.14X32

      由表3的ANVOA分析可知:模型P=0.000 1<0.01極顯著,失擬項P=0.505 5>0.05不顯著,說明方程對該試驗具有較好的擬合性,試驗誤差較小。相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3,調(diào)整系數(shù)Adj.R2=0.998 3也表明上述模型擬合程度較好。該模型可用于提取火麻油。

      對火麻油得率影響順序依次為:液料比(X1)>提取時間(X3)> 提取溫度(X2)。并且液料比(X1)、提取溫度(X2)和提取時間(X3)影響都達到了極顯著水平(P<0.01);X1X2達到極顯著水平(P<0.01)、X1X3達到顯著水平(P<0.05)、X2X3達到顯著水平(P<0.05);液料比(X1)、提取溫度(X2)和提取時間(X3)各因素的二次項對得率影響極顯著(P<0.01)。

      2.3 響應(yīng)面法分析最佳工藝方案

      液料比與提取溫度對得率的影響見圖4。

      圖4 液料比與提取溫度對得率的響應(yīng)面分析Fig.4 Response surface analysis of the ratio of liquid to material and extraction temperature to the yield

      液料比與提取時間對得率的影響見圖5。

      圖5 液料比與提取時間對得率的響應(yīng)面分析Fig.5 Response surface analysis of liquid-to-material ratio and extraction time to yield

      提取溫度與提取時間對得率的影響見圖6。

      圖6 提取溫度與提取時間對得率的響應(yīng)面分析Fig.6 Response surface analysis of extraction temperature and time to yield

      通過上述分析得火麻油最佳提取條件為:當液料比為16∶1(mL/g)、提取溫度為46℃、提取時間為104 min時,火麻油的得率為83.45%。選取上述組合做3次驗證試驗,得出火麻油的平均得率為83.39%。與預(yù)測值相近,證明該工藝可以用來提取火麻油。

      2.4 火麻油結(jié)合運動對骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響

      火麻油結(jié)合運動對骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響見表4。

      表4 火麻油結(jié)合運動對骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響Table 4 Effects of hemp oil combined with exercise on bone mineral density in osteoporotic rats

      從表4得出,模型組大鼠骨鈣素(OC)與對照組相比明顯提高(P<0.05),運動組、火麻油組、火麻油運動組大鼠骨鈣素(OC)與模型組相比明顯降低(P<0.05),火麻油運動組大鼠骨鈣素(OC)與對照組相比不具有顯著性差異(P>0.05);模型組大鼠磷(P)與對照組相比明顯降低(P<0.05),火麻油運動組磷(P)與模型組相比明顯提高(P<0.05),火麻油運動組磷(P)與對照組相比不具有顯著性差異(P>0.05);模型組大鼠雌二醇與對照組相比明顯降低(P<0.05),運動組、火麻油組、火麻油運動組雌二醇與模型組相比明顯提高(P<0.05),火麻油運動組雌二醇與對照組相比不具有顯著性差異(P>0.05);模型組大鼠骨密度與對照組相比明顯降低(P<0.05),火麻油運動組骨密度與模型組相比明顯提高(P<0.05),火麻油運動組骨密度與對照組相比不具有顯著性差異(P>0.05)。

      研究表明女性在絕經(jīng)之后骨質(zhì)疏松癥狀逐年提高[19],骨質(zhì)疏松是一種多原因引發(fā)骨量丟失,骨結(jié)構(gòu)退化的疾病[20]。運動是當前治療骨質(zhì)疏松的重要方法,相對來說跑步、走路等運動對于骨密度的增加使其產(chǎn)生的效果需要在10~12個月左右,所以通過食物或者藥物來配合可以達到更好的效果[21]。本文中大鼠通過切除雙側(cè)卵巢后,導(dǎo)致自身代謝出現(xiàn)紊亂,出現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥狀,血清中OC水平可以作為評價骨轉(zhuǎn)換率以及骨形成的重要指標,磷(P)的水平是評價骨質(zhì)疏松癥狀效果的重要指標,代表了骨組織中無機物的變化狀態(tài),通過以上指標可以反映骨代謝情況,而且會參與到成骨細胞分化及基質(zhì)的礦化的整個過程[22],模型組的血清OC明顯高于其他組,模型組的磷(P)水平明顯低于其他組,表明模型組的骨轉(zhuǎn)化率高于其他組,骨質(zhì)疏松癥狀明顯,說明經(jīng)過有氧運動干預(yù)以及灌胃火麻油可以調(diào)節(jié)骨代謝平衡,降低骨轉(zhuǎn)換率,起到抑制骨質(zhì)疏松的作用;雌二醇可以對成骨細胞和破骨細胞的調(diào)節(jié)來反映機體的骨鈣代謝,模型組的雌二醇低于其他組,說明經(jīng)過有氧運動干預(yù)以及灌胃火麻油可以調(diào)節(jié)骨鈣代謝之間的平衡,減弱成骨細胞的骨形成能力;骨密度是骨骼強度的一個重要指標,大鼠通過切除雙側(cè)卵巢6周后,模型組的骨密度明顯低于其他組,說明經(jīng)過有氧運動干預(yù)以及灌胃火麻油可以抑制破骨細胞分化、阻礙骨吸收,進而改善骨密度,接近正常大鼠的骨密度。并且火麻油結(jié)合有氧運動要比運動組和火麻油組單一效果要好。

      3 結(jié)論

      通過溶劑法提取火麻油的最優(yōu)工藝條件為:當液料比為16∶1(mL/g)、提取溫度為46℃、提取時間為104 min時,火麻油的得率為83.45%。選取該組合做3次驗證試驗,得出火麻油的平均得率為83.39%。與預(yù)測值相近,證明該方法的可行性。同時大鼠實驗表明,火麻油結(jié)合有氧運動對骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨鈣素(OC)、磷(P)水平、雌二醇水平、骨密度 4項指標起到積極作用。說明經(jīng)過有氧運動干預(yù)以及灌胃火麻油可以調(diào)節(jié)骨代謝平衡,降低骨轉(zhuǎn)換率,減弱成骨細胞的骨形成能力,抑制破骨細胞分化、阻礙骨吸收,進而改善骨密度,起到抑制骨質(zhì)疏松的作用。并且火麻油結(jié)合有氧運動的效果要優(yōu)于兩者單獨作用,為今后的相關(guān)研究提供了寶貴經(jīng)驗。

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