少腹逐瘀湯對寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)大鼠活血作用研究*

吳增光 ，胡 鵬 ，范柏爽 ，張思超 ，劉昌孝 ，2，何 新 ，3

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617；2.天津藥物研究院釋藥技術(shù)與藥代動力學(xué)國家重點實驗室，天津 300193；3.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510006）

少腹逐瘀湯出自王清任[1]的《醫(yī)林改錯》，全方由小茴香（1.5 g）、干姜（0.6 g）、延胡索（3 g）、沒藥（6 g）、當(dāng)歸（9 g）、川芎（6 g）、肉桂（3 g）、赤芍（6 g）、蒲黃（9 g）、五靈脂（6 g）共10味藥物組成，具有活血化瘀、溫經(jīng)止痛的功效。研究表明[2-7]，少腹逐瘀湯對血瘀少腹之積塊、痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)等疾病有較好的療效，是臨床治療寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)的有效代表方劑之一。

《素問·舉痛論》中說：“寒氣客于脈外則脈寒，脈寒則縮蜷，縮蜷則脈絀急，絀急則外引小絡(luò)，故卒然而痛?！庇纱丝梢?，“寒邪”為原發(fā)性痛經(jīng)的主要病因，“不通則痛”為主要病機，“瘀血”為主要病理改變。故在治法上，以“通”為主。因寒邪為病，故以溫?zé)崴幗庵灰蝠鲅獙?dǎo)致血液“濃、黏、凝、聚”，故以活血化瘀藥解之。

課題組前期研究已證實少腹逐瘀湯對寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)大鼠有良好的治療作用。作為中藥復(fù)方，少腹逐瘀湯具有多成分、多靶點的作用特點，為了研究其配伍機制，本研究將少腹逐瘀湯拆方為活血組分（當(dāng)歸、川芎、赤芍、蒲黃、沒藥、延胡索、五靈脂）及溫經(jīng)組分（小茴香、干姜、肉桂），研究不同組分對寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)大鼠的治療效果及其活血機制，探討少腹逐瘀湯的配伍原理，為揭示少腹逐瘀湯中活血化瘀藥配伍溫里藥提供一定的實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 激光多普勒血流儀（PeriFlux 5000，深圳市瑞沃德生命科技有限公司），全自動血液流變學(xué)分析儀（LB-2A，濟寧市潤煤工礦物資有限公司），酶標(biāo)儀，凝血儀，鼠籠，灌胃針，手術(shù)剪，手術(shù)鉗。

1.2 藥物與試劑 縮宮素注射液（產(chǎn)品批號：09161217，上海禾豐制藥有限公司），戊二酸雌二醇片（產(chǎn)品批號：355A，拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司），少腹逐瘀湯全方組（全方組）浸膏、少腹逐瘀湯溫經(jīng)止痛組（溫經(jīng)組）浸膏、少腹逐瘀湯活血化瘀組（活血組）浸膏均由天津藥物研究院有限公司提供（當(dāng)歸、川芎、赤芍、蒲黃、沒藥、五靈脂、延胡索、小茴香、干姜、肉桂藥材經(jīng)天津藥物研究院張鐵軍研究員鑒定，各藥材均符合《中華人民共和國藥典》2015年版相關(guān)標(biāo)準，相關(guān)藥材保存于天津藥物研究院中藥和健康產(chǎn)品研究中心藥材庫）。

1.3 動物 SD雌性大鼠，SPF級，體質(zhì)量（230±10）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2016-0004。飼養(yǎng)于室內(nèi)保持12 h光照與12 h避光循環(huán)飼養(yǎng)，給予標(biāo)準飼料和飲用水，且控制室內(nèi)溫度為（25.0±1.0）℃，相對濕度在（50.0±10.0）%左右。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥 選用健康清潔級SD雌性大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，按隨機數(shù)字表法將其分為空白組、模型組、陽性藥組、溫經(jīng)組、活血組、全方組，每組10只，除空白組外，將其余各組大鼠置于0～1℃冰水中5 min，每日1次，均灌服戊二酸雌二醇混懸液造模，連續(xù)12d。第1天：1mg/d，第2～11天：0.5 mg/d，第12天：1 mg/d；空白組給同體積的生理鹽水。于灌服戊二酸雌二醇第6天，上午冰浴后給予戊二酸雌二醇，下午給藥組分別給予相應(yīng)的藥物。空白組、模型組給同體積的生理鹽水，陽性藥組（阿司匹林 14.42 mg/kg）、溫經(jīng)組（1.138 g/kg）、活血組（14.6 g/kg）、全方組（15.738 g/kg），每日給藥1次，連續(xù)給藥7 d。

2.2 指標(biāo)測定

2.2.1 子宮血流量 用異氟烷麻醉大鼠后，將大鼠固定在操作臺上，大鼠仰臥位，從腹部由下而上用多普勒探頭進行掃描，掃描范圍為5 cm，連續(xù)測量血流量3次。儀器配套數(shù)據(jù)分析軟件可直接輸出血流量灌注指標(biāo)數(shù)值，選取3次平均值進行統(tǒng)計分析[8]。

2.2.2 血液流變學(xué) 末次給藥后第2天，用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，固定解剖，腹主動脈取血，抗凝真空采血管收集血液3 mL，用血液流變儀檢測血液流動性。

2.2.3 凝血功能 末次給藥后第2天，用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，固定解剖，腹主動脈取血，用不抗凝真空采血管收集血液，用凝血儀測定血液的凝血功能。

2.2.4 血栓素（TXA2）與前列環(huán)素（PGI2） 末次給藥后第2天，用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，固定解剖，腹主動脈取血，靜置0.5 h，離心半徑為10 cm，3 000 r/min離心后取上清液，根據(jù)試劑盒操作說明用酶標(biāo)儀進行測定。

2.3 數(shù)據(jù)處理 用SPSS 23.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 給藥期間對子宮血流量的影響 與空白組比較，模型組的子宮血流量顯著上升（P<0.05），結(jié)果提示造模成功；與模型組比較，各給藥組的子宮血流量明顯下降（P<0.05），結(jié)果表明給藥后，溫經(jīng)組、活血組、全方組都能降低子宮血流量，作用效果：活血組>溫經(jīng)組，而活血組與全方組相比，差異無顯著性（P>0.05），說明活血組與全方組療效相當(dāng)。見圖1。

圖1 給藥期間各組子宮血流量變化（±s，n=10）Fig.1 Changes in uterine blood flow in each group during administration（±s，n=10）

3.2 給藥期間對血液流變學(xué)的影響

3.2.1 給藥期間對血漿黏度的影響 血液黏度是測量血液流變學(xué)的一個經(jīng)典指標(biāo)。實驗結(jié)果表明，與空白組比較，模型組血漿黏度顯著上升（P<0.05）；給藥后，各組均能降低血漿黏度，表明溫經(jīng)組、活血組、全方組均能通過降低血漿黏度來改善血液的流動性。見圖2。

3.2.2 給藥期間對紅細胞壓積的影響 紅細胞壓積是反映血液“濃度”的指標(biāo)，實驗結(jié)果表明，與空白組比較，模型組紅細胞壓積顯著上升（P<0.05）；給藥后，各組均能降低紅細胞壓積，表明溫經(jīng)組、活血組、全方組均能通過降低血液“濃度”來改善血液的流動性。見圖3。

圖2 給藥期間各組血漿黏度變化（±s，n=10）Fig.2 Affection in plasma viscosity of each group during administration（±s，n=10）

圖3 給藥期間各組紅細胞壓積變化（±s，n=10）Fig.3 Changes in hematocrit of each group during administration（±s，n=10）

3.2.3 給藥期間對紅細胞聚集指數(shù)的影響 紅細胞聚集指數(shù)是指血液細胞間互相聚集程度的大小，紅細胞聚集指數(shù)越高，表示聚集能力越高。實驗結(jié)果表明，與空白組比較，模型組紅細胞聚集指數(shù)顯著上升（P<0.05）；給藥后，各組均能降低紅細胞聚集指數(shù)，表明溫經(jīng)組、活血組、全方組均能通過降低紅細胞聚集改善細胞聚集導(dǎo)致的血流減慢。見圖4。

3.2.4 給藥期間對紅細胞電泳指數(shù)的影響 紅細胞電泳時間延長，反映了紅細胞表面電荷下降，導(dǎo)致細胞易于聚集，聚集力增加反過來又可導(dǎo)致血流減慢，致使末梢循環(huán)發(fā)生障礙，這是形成血瘀的病理基礎(chǔ)。實驗結(jié)果表明，與空白組比較，模型組紅細胞電泳指數(shù)顯著上升（P<0.05）；給藥后，各組均能降低紅細胞電泳指數(shù)，表明溫經(jīng)組、活血組、全方組均能通過降低紅細胞電泳時間改善細胞聚集導(dǎo)致的血流減慢。見圖5。

圖4 給藥期間對各組紅細胞聚集指數(shù)影響（±s，n=10）Fig.4 Influence in red blood cell aggregation index of each group during administration（±s，n=10）

圖5 給藥期間各組紅細胞電泳指數(shù)變化（±s，n=10）Fig.5 Changes in erythrocyte electrophoresis index of each group during administration（±s，n=10）

3.2.5 給藥期間對細胞變形指數(shù)的影響 紅細胞變形指數(shù)，是描述紅細胞在流動狀態(tài)中形狀改變的能力，指數(shù)越高，表示紅細胞變形能力越差，紅細胞硬化程度越高。實驗結(jié)果表明，與空白組比較，模型組紅細胞變形指數(shù)顯著上升（P<0.05）；給藥后，各組均能降低紅細胞變形指數(shù)，表明溫經(jīng)組、活血組、全方組均能通過降低紅細胞變形指數(shù)，改善細胞流動性。見圖6。

3.3 給藥期間對凝血4項的影響

3.3.1 給藥期間對凝血酶時間（TT）的影響 TT是指在血漿中加入標(biāo)準化的凝血酶后血液凝固的時間。TT偏低多與血栓栓塞性疾病及高凝狀態(tài)等有關(guān)。由圖7可知，模型組較正常組減少（P<0.05），表明模型大鼠血液處于高凝狀態(tài)，符合血瘀證模型；給藥后各組與模型組比較，TT明顯上升（P<0.05），說明溫經(jīng)組、活血組、全方組能夠延長寒凝血瘀大鼠TT，改善高凝狀態(tài)。

圖6 給藥期間各組紅細胞變形指數(shù)變化（±s，n=10）Fig.6 Changes in red blood cell deformation index of each group during administration（±s，n=10）

圖7 給藥期間各組TT變化（±s，n=10）Fig.7 Changes in thrombin time in each group during administration（±s，n=10）

3.3.2 給藥期間對凝血酶原時間（PT）的影響 PT的測定常用于血漿中外源性凝血系統(tǒng)較理想和常用的篩選測試。PT縮短可見于體內(nèi)先天性凝血因子Ⅴ增多癥、血栓性疾病、彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）高凝期。由圖8可知，模型組較正常組減少（P<0.05）；給藥后各組與模型組比較，PT明顯上升（P<0.05），具有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果表明溫經(jīng)組、活血組、全方組能夠延長寒凝血瘀大鼠PT，改善高凝狀態(tài)。

3.3.3 給藥期間對活化部分凝血活酶時間（APTT）的影響 由圖9可知，模型組較正常組減少（P<0.05）；給藥后與模型組比較，APTT明顯上升（P<0.05），具有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果表明溫經(jīng)組、活血組、全方組能夠延長寒凝血瘀大鼠APTT，改善高凝狀態(tài)。

3.3.4 給藥期間對纖維蛋白原（FIB）的影響 FIB即凝血因子I，是凝血過程的主要蛋白質(zhì)。由圖10可知，模型組較正常組升高（P<0.05）；給藥后與模型組比較，F(xiàn)IB明顯上升（P<0.05），具有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果表明溫經(jīng)組、活血組、全方組能夠減少寒凝血瘀大鼠FIB的含量，抑制凝血。

圖8 給藥期間對各組PT影響（±s，n=10）Fig.8 Affection in prothrombin time of each group during administration（±s，n=10）

圖9 給藥期間各組APTT改變（±s，n=10）Fig.9 Changes in the time of activated partial thrombin in each group during administration（±s，n=10）

圖10 給藥期間對各組FIB影響（±s，n=10）Fig.10 Influence of fibrinogen in each group during administration（±s，n=10）

3.4 給藥期間對TXA2與PGI2含量的影響

3.4.1 給藥期間對TXA2含量的影響 TXA2主要由血小板線粒體合成和釋放，有收縮血管、促進血小板聚集并誘發(fā)血栓形成的作用。血中TXA2含量越高，說明收縮血管作用越大，血液流動性越差。由圖11可知，模型組較正常組升高（P<0.05），具有統(tǒng)計學(xué)差異；給藥后較模型組升高，TXA2含量明顯減少，說明各組能夠降低血漿中TXA2釋放，抑制血管收縮。

圖11 給藥期間各組TXA2變化（±s，n=10）Fig.11 Changes of thromboxane TXA2 in each group during administration（±s，n=10）

3.4.2 給藥期間對PGI2含量的影響 PGI2具有抑制血小板聚集、擴張血管的作用，血中含量越高，說明擴張血管作用越大，血液流動性就越好。由圖12可知，模型組較正常組降低（P<0.05），具有統(tǒng)計學(xué)差異；給藥后與模型組比較，PGI2含量明顯上升，說明各組能夠促進寒凝血瘀大鼠血漿中PGI2的釋放，從而起到擴張血管的作用，增加子宮血流量，緩解由于寒凝造成的疼痛。

4 討論

痛經(jīng)是女性較常見的疾病之一，其中以寒凝血瘀型最為多見[9]。中醫(yī)認為該病是經(jīng)期或生產(chǎn)后，感受寒邪，或過食寒冷生食，引起寒與血搏，導(dǎo)致瘀阻沖任，胞脈之血氣運行不暢，“不通則痛”所致，因此治療上，常以“活血化瘀、溫經(jīng)止痛”為原則。少腹逐瘀湯具有溫經(jīng)散寒、活血化瘀、消腫定痛的功效，主要用于治療血瘀積塊結(jié)于少腹胞宮等疾病[10-13]。

血瘀學(xué)說是中醫(yī)理論特有的學(xué)說，根據(jù)“經(jīng)脈者，受血而營之”，“經(jīng)脈流行不止，環(huán)周不休”，如“氣血不和，百病乃變化而生”的理論，認為“瘀”即為“積血也”，“瘀證”為“積血之病”[14-19]?；钛龇ㄊ侵嗅t(yī)的主要治療方法之一，它關(guān)系到人體內(nèi)氣血的運行。各種疾病只要有氣血的運行受阻之證都可以應(yīng)用此法。

圖12 給藥期間各組PGI2變化（±s，n=10）Fig.12 Changes in prostacyclin during each administration period（±s，n=10）

血瘀證的臨床表現(xiàn)、病理變化特點及發(fā)病原因[20-23]與血流量的調(diào)節(jié)、血管的擴張或者收縮、血液的流動性和黏度異常、血液凝固功能密切相關(guān)[24-26]。因此，在研究溫經(jīng)組、活血組、全方組的藥效差異時，選擇能夠反映“活血化瘀”傳統(tǒng)功效的指標(biāo)來進行測定。結(jié)果表明：1）在子宮血流量的作用：活血組>溫經(jīng)組。2）血液流變學(xué)的作用：3組在血漿黏度、紅細胞壓積、紅細胞電泳指數(shù)、紅細胞變形指數(shù)4個指標(biāo)中，都具有改善血液流動性的作用，但三者之間沒有顯著性差異，說明在這些指標(biāo)中，溫經(jīng)組與活血組療效相當(dāng)；紅細胞聚集指數(shù)：活血組改善>溫經(jīng)組。3）在凝血功能測定中：三者對于TT、APTT、FIB 3個指標(biāo)，沒有顯著性差異，但對PT，活血組改善<溫經(jīng)組。4）在對血管的作用中：PGI2擴血管：活血組改善>全方組；TXA2：活血組改善>溫經(jīng)組。活血組在與全方組比較時，無差異，說明活血組的活血化瘀功效與全方組相當(dāng)。兩組配伍即是中醫(yī)的活血化瘀藥配伍溫里藥，即全方組，綜合實驗結(jié)果表明，全方組體現(xiàn)活血化瘀與溫經(jīng)止痛的功效，由此說明活血組分和溫經(jīng)組分有顯著的協(xié)同作用。

少腹逐瘀湯對寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)大鼠的治療作用中，以活血化瘀藥為主，配伍溫里藥，在子宮血流量、紅細胞聚集指數(shù)、PT方面具有協(xié)同的作用?！把脺貏t行”，溫里藥小茴香、干姜、肉桂，其性熱，味辛，熱以散寒，辛以行氣，故溫經(jīng)散寒、調(diào)暢氣機，則寒凝得散、氣血得行；同時使用活血化瘀藥當(dāng)歸、川芎、赤芍、蒲黃、沒藥、延胡索、五靈脂，其性溫，味辛苦，溫以驅(qū)寒，辛以活血行氣，苦以逐瘀。少腹逐瘀湯使用活血化瘀藥與溫里藥配伍，達到寒凝得散、氣血得行、通則不痛的目的。本研究結(jié)果提示溫里藥物配伍在少腹逐瘀湯中存在一定協(xié)同或增效作用，為深入研究其配伍機制打下了基礎(chǔ)。同時，為進一步探討性味與功效的相關(guān)性研究提供了一定參考。