徐天梅　符成悅　蘇造堂　肖關(guān)麗　李維薇　陳斌

摘要 草地貪夜蛾是一種新入侵我國的重大害蟲。腸道細(xì)菌是昆蟲腸道微生物的重要類群，在害蟲生理生態(tài)功能中發(fā)揮著重要作用，為弄清云南省草地貪夜蛾擴(kuò)散地與入侵地種群腸道細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)及多樣性的差異，本研究采用Illumina Hiseq技術(shù)對云南草地貪夜蛾首發(fā)地普洱市寶藏鎮(zhèn)、擴(kuò)散區(qū)昆明市嵩明縣兩個地區(qū)草地貪夜蛾4齡幼蟲腸道細(xì)菌的16S rDNA V3-V4變異區(qū)域序列進(jìn)行了測定分析，應(yīng)用USEARCH和QIIME軟件統(tǒng)計樣品序列數(shù)和操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）數(shù)量分析了腸道細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)及物種豐度與多樣性。結(jié)果表明，來自普洱市寶藏鎮(zhèn)、昆明市嵩明縣的6個草地貪夜蛾樣品共產(chǎn)生了302 786條有效序列，在97%相似度下可將其聚成564個OTUs，共發(fā)現(xiàn)細(xì)菌20門、39綱、86目、161科、318屬、344種。其中寶藏鎮(zhèn)草地貪夜蛾種群的腸道細(xì)菌分屬于16門、29綱、60目、102科、178屬共192種;優(yōu)勢門、綱、目、科、屬、種分別為：厚壁菌門（35.09%）、梭菌綱（15.84%）、梭菌目（15.84%）、艾克曼菌科（12.80%）、艾克曼菌屬（12.80%）、不可培養(yǎng)的艾克曼菌屬細(xì)菌（12.80%）。嵩明縣草地貪夜蛾腸道細(xì)菌共184種，分屬于15門、27綱、54目、96科、172屬;優(yōu)勢門、綱、目、科、屬、種分別為：厚壁菌門（65.87%）、桿菌綱（48.07%）、乳桿菌目（47.32%）、腸球菌科（46.99%）、腸球菌屬（46.99%）、NLAE-zl-C485（46.96%）。寶藏鎮(zhèn)草地貪夜蛾4齡幼蟲腸道內(nèi)細(xì)菌群落Shannon、ACE和Chao1多樣性指數(shù)分別為3.46、360.25和370.54，分別高于擴(kuò)散地嵩明縣種群的2.26、295.54和305.42;而Simpson指數(shù)（0.13）則低于嵩明縣種群（0.36）。通過KEGG代謝途徑差異分析發(fā)現(xiàn)，草地貪夜蛾腸道細(xì)菌基因主要參與的代謝途徑是整體組織構(gòu)建和碳水化合物代謝，且寶藏鎮(zhèn)草地貪夜蛾腸道細(xì)菌基因在大多數(shù)的代謝通路中表達(dá)量高于嵩明縣種群。以上結(jié)果說明，云南省草地貪夜蛾首發(fā)地種群腸道內(nèi)細(xì)菌群落組成及多樣性高于擴(kuò)散區(qū)種群。本研究將為進(jìn)一步研究不同地區(qū)草地貪夜蛾種群生物學(xué)差異及腸道微生物對其生態(tài)適應(yīng)性的調(diào)控提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 草地貪夜蛾; 腸道細(xì)菌; 16S rDNA; 基因測序

中圖分類號：

S 435.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020083

Composition and diversity of gut bacteria community of Spodoptera frugiperda from the first invasion site and the dispersal area in Yunnan province

XU Tianmei1， FU Chengyue1， SU Zaotang1， XIAO Guanli2*， LI Weiwei1，3， CHEN Bin1*

（1. College of Plant Protection， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China;

2.College of Agriculture & Biology Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China;

3. Kunming Institute of Zoology， Chinese Academy of Sciences， Kunming 650223， China）

Abstract

Fall armyworm， Spodoptera frugiperda， is a serious invaded pest insect of corn， it was firstly found in Baozang town， Yunnan province， China， in 2019. Gut bacteria played important role in the physiological and ecological function. To understand the difference of composition and diversity of gut bacteria communities in S.frugiperda from the first invasion site and the dispersal area， a comparable study on the intestinal bacteria of 4th instar larvae from Baozang and Songming populations of S.frugiperda was conducted using 16S rDNA V3-V4 variation region sequence based on the Illumina Hiseq technique. The sequence numbers of each sample and the numbers of operational taxonomic unit （OTU） were analyzed using the software of USEARCH and QIIME， and the species composition， abundance and diversity indexes of gut bacteria were determined. A total of 302 786 effective sequences were generated from six samples from two regions， which was aggregated into 564 OTUs under 97% similarity. A total of 20 phylum， 39 classes， 86 orders， 161 families， 318 genera and 344 species bacterial were annotated. For Baozang population， a total of 192 species which belong to 178 genus， 102 families， 60 orders， 29 classes and 16 phylum were identified， among which dominant phylum， class， order， family， genera and species were Firmicutes （35.09%）， Clostridia （15.84%）， Clostridiales （15.84%）， Akkermansiaeae （12.80%）， Akkermansia （12.80%） and uncultured Akkermansia bacterium （12.80%）， respectively. A total of 184 species which belong to 172 genus， 96 families， 54 orders， 27 classes and 15 phylum were identified in Songming population. Of which， dominant phylum， class， order， family， genera and species were Firmicutes （65.87%）， Bacilli （48.07%）， Lactobacilliales （47.32%）， Enterococcaceae （46.99%）， Enterococcus （46.99%）and NLAE-zl-c485 （46.96%）， respectively. The diversity indexes of Shannon index （3.46）， ACE （360.25）and Chao 1 （370.54） in the Baozang population were higher than those in the Songming population， which were 2.26， 295.54 and 305.42， respectively. But the Simpson index in the Baozang population （0.13） was lower than that in the Songming population （0.36）. Analysis of the KEGG metabolism pathway showed that the main metabolism pathway of gut bacterial was the whole tissue construction and carbohydrate metabolism， and the relative expression of gut bacterial genes in Baozang population was higher than that in Songming population. These results showed that the composition and diversity of gut bacterial community of S.frugiperda in the first invasion site was higher than those in the dispersal areas in Yunnan province. This study will provide a theoretical basis for further study on the variance of the biology of different populations and adaptation mechanism meditated by gut microorganisms.

Key words

Spodoptera frugiperda; gut bacteria; 16S rDNA; gene sequencing

草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda（J.E.Smith），又名秋黏蟲，屬鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae灰翅夜蛾屬Spodoptera[1]。該蟲具有較強(qiáng)的遷飛能力，繁殖能力強(qiáng)，生活周期短，是一種雜食性害蟲，能取食玉米、水稻、高粱和甘蔗等353種植物[2]。該蟲源于美洲熱帶及亞熱帶地區(qū)[3]，2016年傳入非洲，2018年入侵也門、印度和緬甸等亞洲國家， 2019年1月入侵云南省普洱市江城縣寶藏鎮(zhèn)[4-5]，此后迅速擴(kuò)散，到2019年10月10日，已在我國26個省1 518個縣發(fā)生，為害的作物達(dá)15種。草地貪夜蛾主要寄主為玉米，其次為甘蔗、高粱、谷子、小麥等作物，給玉米生產(chǎn)造成了嚴(yán)重影響[6]。

昆蟲腸道微生物被認(rèn)為是昆蟲的第二套遺傳密碼[7]，參與昆蟲體內(nèi)許多重要的生理生化反應(yīng)，如參與合成昆蟲所需營養(yǎng)物質(zhì)[8]、幫助消化大分子物質(zhì)[9]、介導(dǎo)抗藥性[10]、影響交配行為[11]、調(diào)控寄主選擇[12]和環(huán)境適應(yīng)性[13]等。因此，關(guān)于昆蟲腸道微生物群落組成結(jié)構(gòu)及多樣性的研究是近年來昆蟲學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，這些研究為昆蟲與其腸道微生物的協(xié)同進(jìn)化及害蟲防治提供了理論依據(jù)[14-16]。Almeida等[17]和Acevedo等[18]采用分離培養(yǎng)法分別對巴西和美國草地貪夜蛾幼蟲腸道細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾幼蟲腸道細(xì)菌種類豐富;唐運(yùn)林等[19]、顧偌鋮等[20]、韋俊宏等[21]對我國重慶巫溪與巫山地區(qū)、李青晏等[22]對云南蒙自地區(qū)草地貪夜蛾腸道細(xì)菌多樣性進(jìn)行了測定分析，明確了當(dāng)?shù)夭莸刎澮苟昴c道可培養(yǎng)細(xì)菌種類，且發(fā)現(xiàn)其種類隨地區(qū)不同而存在一定差異。云南省昆明市嵩明縣為草地貪夜蛾入侵進(jìn)入云南后的擴(kuò)散地，該地區(qū)草地貪夜蛾種群腸道細(xì)菌組成與入侵地普洱市江城縣寶藏鎮(zhèn)草地貪夜蛾種群是否存在差異還不清楚。本文研究了兩地草地貪夜蛾種群幼蟲腸道細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)及其多樣性，這對于系統(tǒng)研究該蟲生物生態(tài)學(xué)具有重要意義。

目前，對草地貪夜蛾腸道微生物的研究主要是利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行分離、培養(yǎng)和鑒定，唐運(yùn)林等采用該方法從重慶巫溪和巫山等地區(qū)玉米地草地貪夜蛾腸道中分離并鑒定得到5個屬的細(xì)菌[19-21]，然而采用該方法不能鑒定不可培養(yǎng)細(xì)菌種類。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，16S rDNA基因序列測定、宏基因組測定（描述細(xì)菌的潛在功能）和宏轉(zhuǎn)錄組測序（描述活性基因的表達(dá)）[23]等技術(shù)為系統(tǒng)研究微生物提供了技術(shù)支撐，其中16S rDNA是一種重要的分子標(biāo)記技術(shù)，通過獲得待測微生物的16S rDNA序列，與公共數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)研究的物種序列進(jìn)行比較[24]實現(xiàn)種類鑒定。其他一些常用的分子標(biāo)記則不具有16S rDNA基因的這種分類優(yōu)勢[25]，因此，16S rDNA基因分析已成為微生物多樣性調(diào)查和分類鑒定中的主要技術(shù)。由此，本研究基于16S rDNA分析云南草地貪夜蛾擴(kuò)散區(qū)與首發(fā)地種群腸道內(nèi)細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)與多樣性及其差異，為進(jìn)一步研究不同地區(qū)草地貪夜蛾種群生物學(xué)差異及腸道微生物調(diào)控其對生態(tài)適應(yīng)性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試?yán)ハx為2019年6月20日分別從云南省普洱市江城縣寶藏鎮(zhèn)（22°41′10″N，101°38′30″E）、昆明市嵩明縣（25°15′52″N，102°56′24″E）采集的草地貪夜蛾4齡幼蟲。

1.2 腸道解剖

從兩個取樣點(diǎn)各選擇健康的草地貪夜蛾4齡幼蟲30頭，饑餓24 h，然后于75%乙醇中表面消毒5 min，再用蒸餾水漂洗3次，在超凈工作臺上解剖，將解剖出的腸道內(nèi)容物分別溶解于2 mL無菌水中[26]。每個地點(diǎn)設(shè)置3個樣本，每個樣本10頭蟲，共6個樣本。腸道解剖完成后在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 腸道細(xì)菌總DNA提取

使用PowerSoil DNA Isolation kit提取腸道DNA。

1.4 PCR擴(kuò)增腸道細(xì)菌的16S rDNA

16S rDNA的V3-V4區(qū)域作為擴(kuò)增和測序的目的片段[27]，引物由北京百邁科生物科技有限公司設(shè)計。引物序列為：515F： 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，806R： 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR體系為（20 μL）：基因組DNA 50 ng±10 ng，上下游引物各0.6 μL，KOD FX Neo Buffer 10 μL，dNTPs（2 mmol/L each）4 μL，KOD FX Neo 0.4 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸40 s，20個循環(huán);72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化，樣品與磁珠按照1∶1.5混勻后進(jìn)行磁珠片段篩選，最終用17 μL無菌水洗脫，再進(jìn)行1次Solexa PCR，反應(yīng)體系為（20 μL）：目的區(qū)域PCR純化產(chǎn)物5 μL，★MPPI-a（2 μmol/L）2.5 μL，★MPPI-b（2 μmol/L）2.5 μL，2×Q5 HF MM 10 μL。反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性30 s;98℃變性10 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，10個循環(huán);72℃延伸5 min[28]。PCR產(chǎn)物用1.8%的瓊脂糖凝膠電泳，電壓120 V，電泳40 min，回收目的片段。

1.5 文庫構(gòu)建及數(shù)據(jù)處理

基于Illumina HiSeq測序平臺，利用雙末端測序（paired-end）的方法，構(gòu)建小片段文庫并進(jìn)行測序。對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接[29]，將拼接得到的序列進(jìn)行質(zhì)量過濾[30]，并去除嵌合體[31]，得到高質(zhì)量的tags序列。數(shù)據(jù)分析主要使用R語言。

1.6 腸道微生物鑒定和多樣性分析

使用Usearch軟件（v 7.0）對tags在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類、獲得OTU，并基于Silva（細(xì)菌）和UNITE（真菌）分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋。利用QIIME（v 1.80）軟件計算Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)。Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)反映樣品中群落豐富度，而Shannon指數(shù)反映群落的多樣性，Simpson指數(shù)反映群落中優(yōu)勢種的集中程度，Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小說明樣品中的物種越豐富多樣。使用R語言分析樣品內(nèi)物種豐富度和多樣性信息[32]，并通過KEGG代謝途徑差異分析寶藏鎮(zhèn)和嵩明縣的草地貪夜蛾腸道細(xì)菌基因在不同代謝通路中的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列拼接和組裝

通過Illumina HiSeq測序后，6個樣品共獲各302 786條有效tags（表1），6個樣本共獲得20門39綱86目161科318屬344種細(xì)菌，在97%的相似度水平下聚類共獲得564個OTUs。其中寶藏鎮(zhèn)有141 653條有效tags，聚類共獲得465個OTUs，共注釋到細(xì)菌16門29綱60目102科178屬192種;嵩明縣有176 551條有效tags，聚類共獲得490個OTUs，共注釋到細(xì)菌15門27綱54目96科172屬184種。確定各樣品中的OTU數(shù)目以后，對各樣品中共有OTU數(shù)目進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)寶藏鎮(zhèn)與嵩明縣樣品之間共有的OTU數(shù)目為391個。

2.2 草地貪夜蛾腸道細(xì)菌多樣性及豐富度分析

從門的分類水平上看（圖1），首發(fā)地寶藏鎮(zhèn)和擴(kuò)散區(qū)嵩明縣草地貪夜蛾4齡幼蟲腸道細(xì)菌的16S rDNA基因序列均注釋到了梭桿菌門Fusobacteria、柔壁菌門Tenericutes、Epsilonbacteraeota、脫鐵桿菌門Deferribacteres、疣微菌門Verrucomicrobia、放線菌門Actinobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、藍(lán)藻門Cyanobacteria、變形菌門Proteobacteria和厚壁菌門Firmicutes等共20門。其中，寶藏鎮(zhèn)草地貪夜蛾4齡幼蟲腸道細(xì)菌共注釋到16門，豐度前10的門依次為厚壁菌門（35.09%）>疣微菌門（12.80%）>擬桿菌門（12.76%）>變形菌門（12.21%）>藍(lán)藻門（11.71）>脫鐵桿菌門（5.9%）>放線菌門（4.76%）>Epsilonbacteraeota（2.66%）>柔壁菌門（1.10%）>梭桿菌門（0.86%）;擴(kuò)散區(qū)嵩明縣草地貪夜蛾腸道細(xì)菌的16S rDNA基因序列共注釋到15門，豐度前10的門依次為厚壁菌門（65.87%）>變形菌門（10.73%）>擬桿菌門（9.32%）>放線菌門（7.72%）>疣微菌門（3.29%）>藍(lán)藻門（1.22%）>脫鐵桿菌門（1.04%）>梭桿菌門（0.06%）>柔壁菌門（0.03%）>Epsilonbacteraeota（0.02%）。由此可以看出，在門的水平上，寶藏鎮(zhèn)和嵩明縣草地貪夜蛾4齡幼蟲腸道內(nèi)優(yōu)勢細(xì)菌門組成不同，但二者的優(yōu)勢菌門均包括厚壁菌門，不過該門在兩地的相對豐度差異較大，寶藏鎮(zhèn)和嵩明縣草地貪夜蛾幼蟲腸道細(xì)菌中厚壁菌門的相對豐度分別為35.09%和65.87%。

從綱水平來看（圖2），寶藏鎮(zhèn)和嵩明縣草地貪夜蛾4齡幼蟲腸道細(xì)菌16S rDNA基因序列均注釋到了δ-變形菌綱Deltaproteobacteria、α-變形菌綱Alphaproteobacteria、疣微菌綱Verrucomicrobia、γ-變形菌綱Gammaproteobacteria、丹毒絲菌綱Erysipelotrichia、放線菌綱Actinobacteria、產(chǎn)氧光細(xì)菌綱Oxyphotobacteria、擬桿菌綱Bacteroidia、梭菌綱Clostridia、桿菌綱Bacilli等共計39綱。其中寶藏鎮(zhèn)草地貪夜蛾腸道細(xì)菌的16S rDNA基因序列共注釋到29綱，豐度前10的綱依次為梭菌綱（15.84%）>疣微菌綱（12.80%）>擬桿菌綱（12.76%）>產(chǎn)氧光細(xì)菌綱（11.69%）>桿菌綱（10.44%）>丹毒絲菌綱（8.73%）>δ-變形菌綱（5.71%）>γ-變形菌綱（4.84%）>放線菌綱（3.07%）>α-變形菌綱（1.66%）;嵩明縣草地貪夜蛾腸道細(xì)菌共注釋到27個綱，豐度前10的綱為：桿菌綱（48.07%）>丹毒絲菌綱（9.94%）>擬桿菌綱（9.32%）>梭菌綱（7.81%）>γ-變形菌綱（7.35%）>放線菌綱（7.21%）>疣微菌綱（3.28%）>δ-變形菌綱（2.05%）>α-變形菌綱（1.34%）>產(chǎn)氧光細(xì)菌綱（1.18%）。由此表明，首發(fā)地寶藏鎮(zhèn)草地貪夜蛾的腸道細(xì)菌優(yōu)勢綱為梭菌綱Clostridia，豐度為15.84%;而擴(kuò)散地嵩明縣草地貪夜蛾腸道細(xì)菌優(yōu)勢綱為桿菌綱，豐度為48.07%。

從目水平來看（圖3），寶藏鎮(zhèn)和嵩明縣草地貪夜蛾4齡幼蟲腸道細(xì)菌的16S rDNA基因序列均注釋到了棒狀菌目Corynebacteriales、脫硫弧菌目Desulfovibrionales、疣微菌目Verrucomirobiales、微球菌目Micrococcales、腸桿菌目Enterobacteriales、丹毒絲菌目Erysipelotrichales、Chloroplast、擬桿菌目Bacteroidales、梭菌目Clostridiales、乳桿菌目Lactobacillales等共計86目。其中寶藏鎮(zhèn)草地貪夜蛾腸道細(xì)菌的16S rDNA基因序列共注釋到60目，豐度前10的目依次為梭菌目（15.84%）>疣微菌目（12.80%）>擬桿菌目（11.69%）>Chloroplast（11.68%）>丹毒絲菌目（8.73%）>乳桿菌目（8.69%）>脫硫弧菌目（5.67%）>腸桿菌目（1.23%）>微球菌目（0.39%）>棒狀菌目（0.37%）;嵩明縣草地貪夜蛾腸道細(xì)菌共注釋到54個目，豐度前10的目依次為乳桿菌目（47.32%）>丹毒絲菌目（9.94%）>擬桿菌目（9.17%）>梭菌目（7.82%）>腸桿菌目（6.30%）>微球菌目（4.19%）>疣微菌目（3.29%）>脫硫弧菌目（2.00%）>棒狀菌目（1.97%）>Chloroplast（1.18%）。由此表明，首發(fā)地寶藏鎮(zhèn)草地貪夜蛾的腸道細(xì)菌優(yōu)勢目為梭菌目，豐度為15.84%;擴(kuò)散地嵩明縣草地貪夜蛾腸道細(xì)菌優(yōu)勢目為乳桿菌目，豐度為47.32%。

從科水平來看（圖4），寶藏鎮(zhèn)和嵩明縣草地貪夜蛾4齡幼蟲腸道細(xì)菌的16S rDNA基因序列均注釋到了擬桿菌科Bacteroidaceae、瘤胃菌科Ruminococcaceae、短桿菌科Brevibacteriaceae、艾克曼菌科Akkermansiaeae、鼠桿菌科Muribaculaceae、腸桿菌科Enterobacteriaceae、毛螺菌科Lachnospiraceae、丹毒絲菌科Erysipelotrichaceae、微球菌科Micrococcaceae、腸球菌科Enterococcaceae等共計161科。其中寶藏鎮(zhèn)草地貪夜蛾腸道細(xì)菌的16S rDNA基因序列共注釋到102科，豐度前10的科依次為艾克曼菌科（12.80%）>微球菌科（11.63%）>鼠桿菌科（9.41%）>丹毒絲菌科（8.73%）>毛螺菌科（8.21%）>瘤胃菌科（6.77%）>腸球菌科（1.31%）>腸桿菌科（1.23%）>擬桿菌科（0.21%）>短桿菌科（0.06%）;嵩明縣草地貪夜蛾腸道細(xì)菌共注釋到96個科，豐度前10的科為腸球菌科（46.99%）>丹毒絲菌科（9.94%）>腸桿菌科（6.30%）>毛螺菌科（5.34%）>鼠桿菌科（5.05%）>艾克曼菌科（3.29%）>短桿菌科（3.08%）>瘤胃菌科（1.99%）>擬桿菌科（1.25%）>微球菌科（1.02%）。由此表明，首發(fā)地寶藏鎮(zhèn)草地貪夜蛾的腸道細(xì)菌優(yōu)勢科菌為艾克曼菌科，豐度為12.80%;擴(kuò)散地嵩明縣草地貪夜蛾腸道細(xì)菌優(yōu)勢科菌為腸球菌科，豐度為46.99%。

從屬水平上看（圖5），寶藏鎮(zhèn)和嵩明縣草地貪夜蛾4齡幼蟲腸道細(xì)菌的16S rDNA基因序列均注釋到了黏液桿菌屬M(fèi)ucispirillum、異桿菌屬Allobaculum、ZOR0006、擬桿菌屬Bacteroides、短桿菌屬Brevibacterium、腸桿菌屬Enterobacter、艾克曼菌屬Akkermansia、Muribaculaceae科的一未知屬、節(jié)桿菌屬Arthrobacter、腸球菌屬Enterococcus等共計318屬。寶藏鎮(zhèn)草地貪夜蛾4齡幼蟲腸道細(xì)菌共注釋到178屬，豐度前10的屬依次為艾克曼菌屬（12.80%）>節(jié)桿菌屬（11.63%）>Muribaculaceae科的一未知屬（9.30%）>黏液桿菌屬（5.10%）>異桿菌屬（1.82%）>腸球菌屬（1.31%）>ZOR0006（0.40%）>擬桿菌屬（0.21%）>腸桿菌屬（0.14%）>短桿菌屬（0.05%）;嵩明縣草地貪夜蛾4齡幼蟲腸道內(nèi)細(xì)菌共注釋到172個屬，豐度前10的屬依次為腸球菌屬（46.99%）>腸桿菌屬（6.20%）>異桿菌屬（5.60%）>黏液桿菌屬（4.99%）>艾克曼菌屬（3.29%）>短桿菌屬（3.08%）>擬桿菌屬（1.25%）>Muribaculaceae科的一未知屬（1.04%）>節(jié)桿菌屬（1.02%）>ZOR0006（0.06%）。由此表明，首發(fā)地寶藏鎮(zhèn)的草地貪夜蛾腸道優(yōu)勢屬菌為艾克曼菌屬，豐度為12.80%;擴(kuò)散地嵩明縣的草地貪夜蛾腸道優(yōu)勢屬菌為腸球菌屬，豐度為46.99%。

從種水平上看（圖6），寶藏鎮(zhèn)和嵩明縣草地貪夜蛾4齡幼蟲腸道細(xì)菌的16S rDNA基因序列均注釋到了沙德勒氏黏菌Mucispirillum schaedleri、不可培養(yǎng)的異桿菌屬細(xì)菌uncultured Allobaculum bacterium、細(xì)菌ZOR006、不可培養(yǎng)的擬桿菌屬細(xì)菌uncultured Bacteroides bacterium、短桿菌NXYK Brevibacterium sp. NXYK、細(xì)菌HA01、不可培養(yǎng)的艾克曼菌屬細(xì)菌uncultured Akkermansia bacterium、不可培養(yǎng)的鼠桿菌科一未知屬細(xì)菌uncultured Muribaculaceae bacterium、煙草節(jié)桿菌Arthrobacter nicotianae以及細(xì)菌NLAE-zl-C485等344個種。寶藏鎮(zhèn)草地貪夜蛾4齡幼蟲腸道細(xì)菌共注釋到192個種，其中豐度前10的種依次為不可培養(yǎng)的艾克曼菌屬細(xì)菌（12.80%）>煙草節(jié)桿菌（11.63%）>鼠桿菌科一未知屬細(xì)菌（9.30%）>沙德勒氏黏菌（5.10%）>不可培養(yǎng)的異桿菌屬細(xì)菌（1.28%）>細(xì)菌NLAE-zl-C485（0.94%）>不可培養(yǎng)的擬桿菌屬細(xì)菌（0.16%）>細(xì)菌HA01（0.14%）>短桿菌NXYK（0.06%）>細(xì)菌ZOR006（0.04%）;嵩明縣草地貪夜蛾幼蟲腸道內(nèi)細(xì)菌共注釋到184種，豐度前10的種依次為細(xì)菌NLAE-zl-C485（46.96%）>細(xì)菌HA01（6.20%）>不可培養(yǎng)的異桿菌屬細(xì)菌（5.60%）>鼠桿菌科一未知屬細(xì)菌（4.99%）>不可培養(yǎng)的艾克曼菌屬細(xì)菌（3.28%）>短桿菌NXYK（3.07%）>不可培養(yǎng)的擬桿菌屬細(xì)菌（1.25%）>沙德勒氏黏菌（1.04%）>煙草節(jié)桿菌（1.02%）>細(xì)菌ZOR006（0.06%）。由此表明，首發(fā)地寶藏鎮(zhèn)草地貪夜蛾腸道優(yōu)勢菌為不可培養(yǎng)的艾克曼菌屬細(xì)菌，豐度為12.80%;擴(kuò)散地嵩明縣草地貪夜蛾腸道優(yōu)勢種為細(xì)菌NLAE-zl-C485，豐富度為46.96%。

2.3 草地貪夜蛾腸道細(xì)菌群落多樣性分析

由表2可知，草地貪夜蛾幼蟲腸道細(xì)菌有較高的豐富度和多樣性，寶藏鎮(zhèn)和嵩明縣的草地貪夜蛾腸道細(xì)菌ACE指數(shù)分別為360.25和295.54，Chao1指數(shù)分別為370.54和305.42，Simpson指數(shù)分別為0.13和0.36，Shannon指數(shù)分別為3.46和2.26。寶藏鎮(zhèn)的草地貪夜蛾腸道細(xì)菌ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)均高于嵩明縣，說明寶藏鎮(zhèn)的草地貪夜蛾腸道細(xì)菌多樣性更高，而寶藏鎮(zhèn)的Simpson指數(shù)低于嵩明縣，說明寶藏鎮(zhèn)草地貪夜蛾腸道細(xì)菌的優(yōu)勢種集中程度高于嵩明縣。

2.4 功能預(yù)測及分析

通過KEGG代謝途徑差異分析（圖7），無論是首發(fā)地寶藏鎮(zhèn)，還是擴(kuò)散區(qū)的嵩明縣，草地貪夜蛾幼蟲腸道細(xì)菌所富集到的代謝通路一致，主要富集到的代謝通路為信號傳導(dǎo)、膜運(yùn)輸、整體組織構(gòu)建、翻譯、氨基酸代謝、核苷酸代謝、能量代謝、輔助因子和維生素代謝、復(fù)制和修復(fù)、碳水化合物代謝。但在部分代謝通路中基因表達(dá)存在差異，從信號傳導(dǎo)、整體組織構(gòu)建、翻譯、氨基酸代謝、核苷酸代謝、能量代謝、輔助因子和維生素代謝、復(fù)制和修復(fù)通路基因表達(dá)來看，首發(fā)地BZ601樣品中分離出的腸道細(xì)菌基因表達(dá)量高于擴(kuò)散地Sm601樣品;而在膜運(yùn)輸、碳水化合物代謝通路中，首發(fā)地BZ601樣品中分離出的腸道細(xì)菌基因表達(dá)量低于擴(kuò)散地Sm601樣品。

3 討論

從當(dāng)前報道的草地貪夜蛾腸道可培養(yǎng)細(xì)菌組成來看，各地存在一定差異，其中巴西草地貪夜蛾種群腸道分離獲得的細(xì)菌有腸球菌屬、代爾夫特菌屬、勒克氏菌屬、細(xì)桿菌屬、假單胞菌屬、節(jié)桿菌屬和葡萄球菌屬7屬[17]，美國草地貪夜蛾種群中分離的細(xì)菌有泛菌屬、腸桿菌屬、拉恩氏菌屬、拉烏爾菌屬和克雷伯氏菌屬5屬[18]，我國重慶種群分離的腸道細(xì)菌有克雷伯氏菌屬、不動桿菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬和氣單胞菌屬5屬[19]，云南省蒙自地區(qū)的草地貪夜蛾幼蟲腸道分離到的細(xì)菌有克雷伯氏菌屬、腸球菌屬、沙雷氏菌屬和摩根菌屬4屬[22]。本研究通過16S rDNA和Illumina Hiseq技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)云南省草地貪夜蛾首發(fā)地種群與擴(kuò)散地種群腸道內(nèi)細(xì)菌共計20門39綱86目161科318屬344種，腸道細(xì)菌種類顯著多于美國和巴西草地貪夜蛾的腸道微生物類群，也多于重慶和云南蒙自地區(qū)草地貪夜蛾腸道細(xì)菌類群，究其原因，可能是不同地域環(huán)境條件及寄主植物的差異造成，也有可能是不同區(qū)域內(nèi)施用的農(nóng)藥等化學(xué)物質(zhì)不同造成，這些都值得進(jìn)一步深入研究。從腸道細(xì)菌的優(yōu)勢屬組成來看，本研究中首發(fā)地和擴(kuò)散地草地貪夜蛾幼蟲腸道內(nèi)細(xì)菌與唐運(yùn)林的報道存在差異，產(chǎn)生差異的原因在于16S rDNA和Illumina Hiseq技術(shù)不僅可以獲得可以培養(yǎng)的細(xì)菌，還可以檢測到許多不可培養(yǎng)的細(xì)菌，相對于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)，16S rDNA和Illumina Hiseq技術(shù)能夠更加全面地揭示腸道微生物組成結(jié)構(gòu)及多樣性。

從草地貪夜蛾幼蟲腸道細(xì)菌類群組成來看，首發(fā)地與擴(kuò)散地存在明顯差異，其中寶藏鎮(zhèn)草地貪夜蛾種群腸道內(nèi)細(xì)菌隸屬于16門29綱60目102科178屬192種，嵩明縣種群腸道內(nèi)細(xì)菌隸屬于15門27綱54目96科172屬184種。寶藏鎮(zhèn)和嵩明縣兩個地區(qū)草地貪夜蛾腸道細(xì)菌的優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門，但擴(kuò)散地優(yōu)勢菌門的相對豐度顯著高于首發(fā)地，而在其他分類水平上，兩個地方的菌群組成及優(yōu)勢菌種都存在差異，其原因可能是由于草地貪夜蛾遷飛擴(kuò)散進(jìn)入另一個生態(tài)環(huán)境后，兩個地方的生態(tài)環(huán)境及作物組成結(jié)構(gòu)不同。此外，本研究通過多個生物多樣性指數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)寶藏鎮(zhèn)的草地貪夜蛾腸道細(xì)菌豐富度高于嵩明縣。由此可以看出，首發(fā)地寶藏鎮(zhèn)田間草地貪夜蛾腸道細(xì)菌種類較擴(kuò)散地的嵩明縣豐富，原因可能是兩地不同的氣候環(huán)境或兩地點(diǎn)寄主食物有差異，還有待進(jìn)一步探討。本研究也表明，云南草地貪夜蛾首發(fā)地和擴(kuò)散地種群腸道中細(xì)菌豐度前10的細(xì)菌門主要有梭桿菌門、柔壁菌門、Epsilonbacteraeota、脫鐵桿菌門、疣微菌門、放線菌門、擬桿菌門、藍(lán)藻門、變形菌門和厚壁菌門。同時，厚壁菌門細(xì)菌在稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis（Guenée）、棉鈴蟲Helicoverpa armigera（Hübner）、小菜蛾P(guān)lutella xylostella（Linnaeus）、家蠶Bombyx mori Linnaeus、斜紋夜蛾 S.litura （Fabricius）等昆蟲腸道內(nèi)都被分離獲得[32-33]，說明厚壁菌門在昆蟲腸道內(nèi)廣泛存在。此外，唐運(yùn)林等運(yùn)用傳統(tǒng)培養(yǎng)法研究發(fā)現(xiàn)重慶地區(qū)草地貪夜蛾的腸道細(xì)菌屬于變形菌門、厚壁菌門和放線菌門[19]，這3個門的細(xì)菌在本研究的云南省草地貪夜蛾首發(fā)地和擴(kuò)散地種群腸道中也存在，進(jìn)一步表明16S rDNA和Illumina Hiseq技術(shù)可用于昆蟲腸道內(nèi)可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)及多樣性分析。

昆蟲腸道細(xì)菌在昆蟲消化食物、抗逆和生殖調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[18，34]。據(jù)報道，草地貪夜蛾腸道中存在著大量的可降解農(nóng)藥的細(xì)菌[20]，而本研究中對于草地貪夜蛾腸道內(nèi)具有降解農(nóng)藥作用細(xì)菌還未做深入研究，這也將是下一步深入研究的重要內(nèi)容。此外，本研究通過KEGG代謝途徑差異分析，發(fā)現(xiàn)在多數(shù)代謝通路中，寶藏鎮(zhèn)草地貪夜蛾腸道細(xì)菌的基因表達(dá)量高于嵩明縣，僅在膜運(yùn)輸、碳水化合物代謝通路中，寶藏鎮(zhèn)低于嵩明縣。造成該差異的原因可能是由于寶藏鎮(zhèn)與嵩明縣地理位置及氣候差異，草地貪夜蛾為適應(yīng)不同的環(huán)境產(chǎn)生了適應(yīng)性變化。

參考文獻(xiàn)

[1] 郭井菲， 趙建周， 何康來， 等. 警惕危險性害蟲草地貪夜蛾入侵中國[J]. 植物保護(hù)， 2018， 44（6）： 1-10.

[2] MONTEZANO D G， SPECHT A， SOSA-GMEZ D R， et al. Host plants of Spodoptera frugiperda （Lepidoptera： Noctuidae） in the Americas [J]. African Entomology， 2018， 26（2）： 286-300.

[3] SPARKS A N. A review of the biology of the fall armyworm [J]. The Florida Entomologist， 1979， 62（2）： 82-87.

[4] 楊學(xué)禮， 劉永昌， 羅茗鐘， 等. 云南省江城縣首次發(fā)現(xiàn)遷入我國西南地區(qū)的草地貪夜蛾[J]. 云南農(nóng)業(yè)， 2019， 34（1）： 72.

[5] 姜玉英， 劉杰， 朱曉明. 草地貪夜蛾侵入我國的發(fā)生動態(tài)和未來趨勢分析[J]. 中國植保導(dǎo)刊， 2019， 39（2）： 33-35.

[6] 姜玉英， 劉杰， 謝茂昌， 等. 2019年我國草地貪夜蛾擴(kuò)散為害規(guī)律觀測[J]. 植物保護(hù)， 2019， 45（6）： 10-19.

[7] ZILBER-ROSENBERG I， ROSENBERG E. Role of microorganisms in the evolution of animals and plants： the hologenome theory of evolution [J]. FEMS Microbiology Reviews， 2008， 32（5）： 723-735.

[8] SALEM H， BAUER E， STRAUSS A S， et al. Vitamin supplementation by gut symbionts ensures metabolic homeostasis in an insect host [J/OL]. Proceedings of the Royal Society B： Biological Sciences， 2014， 281（1796）： 20141838. DOI： 10.1098/rspb.2014.1838.

[9] LUNDGREN J G， LEHMAN R M. Bacterial gut symbionts contribute to seed digestion in an omnivorous beetle [J/OL]. PLoS ONE， 2010， 5（5）： e10831. DOI： 10.1371/journal.pone.0010831.

[10]MANSOURI S M， GANBALANI G N， FATHI S A A， et al. Nutritional indices and midgut enzymatic activity of Phthorimaea operculella （Lepidoptera： Gelechiidae） larvae fed different potato germplasms [J]. Journal of Economic Entomology， 2013， 106（2）： 1018-1024.

[11]SHARON G， SEGAL D， RINGO J M， et al. Commensal bacteria play a role in mating preference of Drosophila melanogaster [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2010， 107（46）： 20051-20056.

[12]MCLEAN A H C， VAN ASCH M， FERRARI J， et al. Effects of bacterial secondary symbionts on host plant use in pea aphids [J]. Proceedings of the Royal Society B： Biological Sciences， 2010， 278（1706）： 760-766.

[13]TSUCHIDA T， KOGA R， HORIKAWA M， et al. Symbiotic bacterium modifies aphid body color [J]. Science， 2010， 330（6007）： 1102-1104.

[14]魯迎新， 劉彥群， 李群， 等. 昆蟲腸道微生物多樣性研究進(jìn)展[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2016， 45（11）： 1-7.

[15]張振宇， 圣平， 黃勝威， 等. 昆蟲腸道微生物的多樣性、功能及應(yīng)用[J]. 生物資源， 2017， 39（4）： 231-239.

[16]邴孝利， 陸益佳. 水果害蟲斑翅果蠅體內(nèi)微生物菌群研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)報， 2019， 59（10）： 1880-1888.

[17]ALMEIDA L G， MORAES L A， TRIGO J R， et al. The gut microbiota of insecticide-resistant insects houses insecticide-degrading bacteria： A potential source for biotechnological exploitation [J/OL]. PLoS ONE， 2017， 12（3）： e0174754. DOI： 10.1371/journal.pone.0174754.

[18]ACEVEDO F E， PEIFFER M， TAN C W， et al. Fall armyworm-associated gut bacteria modulate plant defense responses [J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2017， 30（2）： 127-137.

[19]唐運(yùn)林， 吳燕燕， 顧偌鋮， 等. 重慶地區(qū)草地貪夜蛾腸道細(xì)菌的分離鑒定[J]. 西南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2019， 41（7）： 8-14.

[20]顧偌鋮， 唐運(yùn)林， 吳燕燕， 等. 重慶地區(qū)取食高粱的草地貪夜蛾與玉米黏蟲腸道細(xì)菌比較[J]. 西南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2019， 41（8）： 6-13.

[21]韋俊宏， 唐運(yùn)林， 顧偌鋮， 等. 重慶地區(qū)玉米葉內(nèi)生細(xì)菌的分離及其與草地貪夜蛾腸道菌的比較[J]. 西南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2019， 41（9）： 17-23.

[22]李青晏， 唐運(yùn)林， 蔣睿軒， 等. 云南地區(qū)草地貪夜蛾腸道細(xì)菌的分離及鑒定[J]. 西南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2020， 42（1）： 1-8.

[23]GOODRICH J K， DI RIENZI S. C， POOLE A. C， et al. Conducting a microbiome study [J]. Cell， 2014， 158（2）： 250-262.

[24]McDONALD D， PRICE M N， GOODRICH J， et al. An improved greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea [J]. The ISME Journal， 2012， 6（3）： 610-618.

[25]KUCZYNSKI J， STOMBAUGH J， WALTERS W A， et al. Using QIIME to analyse 16S rRNA gene sequences from microbial communities [J/OL]. Current Protocols in Bioinformatics Unit， 2011， 36（1）： 10.7.1-10.7.20.DOI：10.1002/0471250953.bi1007s36.

[26]藍(lán)波妙. 斜紋夜蛾腸道細(xì)菌多樣性及其功能研究[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學(xué)， 2016.

[27]FLORES R， SHI Jianxin， YU Guoqin， et al. Collection media and delayed freezing effects on microbial composition of human stool [J]. Microbiome， 2015， 3（1）： 1-11.

[28]魏丹峰， 王秀吉， 楊錦， 等. 取食不同食料的美國白蛾幼蟲腸道細(xì)菌多樣性及差異性研究[J]. 環(huán)境昆蟲學(xué)報， 2017， 39（3）： 515-524.

[29]MAGOCˇ T， SALZBERG S L. FLASH： fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies [J]. Bioinformatics， 2011， 27（21）： 2957-2963.

[30]BOLGER A M， LOHSE M， USADEL B. Trimmomatic： a flexible trimmer for Illumina sequence data [J]. Bioinformatics， 2014， 30（15）： 2114-2120.

[31]EDGAR R C， HAAS B J， CLEMENTE J C， et al. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection [J]. Bioinformatics， 2011， 27（16）： 2194-2200.

[32]劉小改， 楊亞軍， 廖秋菊， 等. 稻縱卷葉螟腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性分析[J]. 昆蟲學(xué)報， 2016， 59（9）： 965-976.

[33]孫博通， 藍(lán)波妙， 王倩， 等. 斜紋夜蛾幼蟲腸道細(xì)菌分離鑒定及其功能初步分析[J]. 生物資源， 2017， 39（4）： 264-271.

[34]SU Qi， ZHOU Xiaomao， ZHANG Youjun. Symbiont-mediated functions in insect hosts [J]. Communicative & Integra Biology， 2013， 6（3）： e23804. DOI： 10.4161/cib.23804.

（責(zé)任編輯：田 喆）