宋建　薛俊　孫海波　王姝　金鳳媚

摘要 番茄褪綠病毒 Tomato chlorosis virus （ToCV）引起番茄褪綠病毒病，給番茄生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害。開(kāi)發(fā)快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)該病害的防控具有重要意義。利用番茄褪綠病毒外殼蛋白（CP）基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，建立了ToCV的重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增（recombinase polymerase amplification， RPA）檢測(cè)方法，同時(shí)分析了該方法的靈敏度和特異性。結(jié)果表明，建立的ToCV-RPA方法在38℃恒溫下40 min可從ToCV陽(yáng)性的番茄樣品中擴(kuò)增出246 bp的特異性條帶。擴(kuò)增時(shí)間短，對(duì)設(shè)備要求低，且與番茄其他病毒無(wú)交叉反應(yīng)，特異性好，靈敏度可達(dá)到PCR方法的10倍，適用于ToCV的快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 番茄; 番茄褪綠病毒; 重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增

中圖分類(lèi)號(hào)： S 436.421.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019168

Detection of Tomato chlorotic virus based on RPA

SONG Jian， XUE Jun， SUN Haibo， WANG Shu， JIN Fengmei*

（Tianjin Agricultural Biotechnology Research Center， Tianjin 300192， China）

Abstract

Tomato chlorosis virus （ToCV） is the pathogen of tomato chlorosis virus disease， which causes serious damage to tomato production. It is important to develop rapid and accurate detection methods for the prevention and control of tomato chlorosis virus disease. Based on the CP gene sequence of ToCV， the specific primers were designed for the detection of virus via recombinase polymerase amplification （RPA）. The specificity and sensitivity of the method were evaluated. The result showed that 246 bp specific band from ToCV-positive tomato samples could be amplified by the established ToCV-RPA method. The reaction condition was 38℃ for 40 min. The method has advantages of short operation time， low equipment requirement， and good specificity and there was no cross-reaction with other tomato viruses. The sensitivity was 10 times higher than that of the PCR method. It was suitable for rapid detection of ToCV.

Key words

tomato; Tomato chlorosis virus; recombinase polymerase amplification （RPA）

番茄褪綠病毒Tomato chlorosis virus （ToCV）是一種由煙粉虱傳播的病毒，由其引起的番茄褪綠病毒病在我國(guó)迅速蔓延，且逐年加重。番茄褪綠病毒屬于長(zhǎng)線形病毒科Closteroviridae毛線病毒屬Crinivirus[1]。ToCV可以侵染茄科、菊科、藜科、莧科、番杏科、夾竹桃科及白花丹科等科的多種植物[2]，其中以茄科寄主最多，如： 番茄[3]、甜椒[4]、馬鈴薯[5]等。被病毒侵染后植株下部葉片葉脈間慢慢褪綠或黃化，然后逐漸蔓延至上部葉片，葉脈逐漸變成深綠色，染病葉片增厚變脆，植株長(zhǎng)勢(shì)也變?nèi)?，病癥與生理性缺素癥或營(yíng)養(yǎng)元素缺乏相似[6]。目前，番茄褪綠病毒病已經(jīng)成為我國(guó)番茄生產(chǎn)中一種毀滅性的病害，嚴(yán)重威脅著我國(guó)番茄產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

目前，檢測(cè)番茄褪綠病毒主要采用RT-PCR技術(shù)[7]，而血清學(xué)檢測(cè)方法應(yīng)用得較少[8]。分子生物學(xué)檢測(cè)主要是通過(guò)病毒的核酸來(lái)檢測(cè)病毒，它比血清學(xué)方法靈敏度高，能檢測(cè)到更低數(shù)量級(jí)的病毒，特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、可用于大量樣品檢測(cè)。PCR技術(shù)目前已經(jīng)成為一種廣泛采用的病毒檢測(cè)方法，但該技術(shù)對(duì)儀器的依賴(lài)度高，完成擴(kuò)增過(guò)程需要精密的溫度循環(huán)儀器，加之成本高、耗時(shí)長(zhǎng)，使其應(yīng)用大多限制于條件完善的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，難以廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

近年來(lái)，等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的出現(xiàn)解決了PCR技術(shù)的局限性，該技術(shù)降低了對(duì)儀器的要求，縮短了反應(yīng)時(shí)間，因而日益受到關(guān)注。重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）是一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，可在常溫下進(jìn)行反應(yīng)，具有反應(yīng)快、靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。目前RPA技術(shù)在醫(yī)學(xué)病原物的快速診斷中得到了一些應(yīng)用[9-10]，農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中主要用于轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)[11-12]，用于植物病毒檢測(cè)的報(bào)道較少。番茄褪綠病毒病是近年來(lái)番茄上最嚴(yán)重的病害之一，準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)其病原對(duì)于病害防治至關(guān)重要。本研究建立了基于RPA檢測(cè)番茄褪綠病毒的方法，以期為基層單位提供一種簡(jiǎn)便適用的快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

感染番茄褪綠病毒Tomato chlorosis virus （ToCV）、番茄黃化曲葉病毒Tomato yellow leaf curl virus （TYLCV）、番茄花葉病毒Tomato mosaic virus （ToMV）、黃瓜花葉病毒Cucumber mosaic virus （CMV）、煙草花葉病毒Tobacco mosaic virus （TMV）的番茄葉片采自天津市西青區(qū)第六埠溫室，陰性對(duì)照為脫毒番茄苗，樣品經(jīng)PCR檢測(cè)和序列測(cè)定確認(rèn)后-80℃凍干保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取及cDNA 的合成

采用植物總RNA提取試劑盒（TaKaRa）提取番茄葉片的總RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT-PCR Kit，TaKaRa）將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)已發(fā)表的ToCV外殼蛋白（CP）基因的保守序列設(shè)計(jì)番茄褪綠病毒的RPA檢測(cè)引物（表1）。

1.2.3 RPA 反應(yīng)

以1.2.1合成的cDNA為模板，利用設(shè)計(jì)的RPA引物進(jìn)行擴(kuò)增，以脫毒番茄苗葉片cDNA為陰性對(duì)照。RPA擴(kuò)增體系（50 μL）： 向0.2 mL TwistAmp反應(yīng)管（TwistAmp Basic kits，Twist）中加入Rehydration Buffer 29.5 μL，正、反向引物（終濃度為0.4 μmol/L）各2.5 μL，模板cDNA 3 μL，去離子水10 μL，最后再加入280 mmol/L醋酸鎂溶液2.5 μL。將RPA擴(kuò)增體系混合充分后置于38℃的金屬浴上反應(yīng)40 min。反應(yīng)結(jié)束后，利用純化試劑盒（DNA Fragment Purification Kit， TaKaRa）對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收純化。

1.2.4 常規(guī)PCR

PCR反應(yīng)體系（25 μL）：cDNA 2.5 μL，10×PCR buffer（含Mg2+）2.5 μL、去離子水14 μL、10 μmol/L上、下游引物各2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 0.5 μL、5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，60℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束后于4℃保存。

1.2.5 電泳

取RPA或PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL于1.2%瓊脂糖凝膠電泳20 min，然后通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的篩選

分別利用引物對(duì)F1/R1、F1/R2、F1/R3、F3/R1、F3/R3、F4/R1、F4/R2、F4/R3進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物片段的大小分別為246、115、125、130、150、92、112、440 bp。從圖1中可以看出各對(duì)引物都擴(kuò)增出目標(biāo)片段，但F1/R2、F1/R3、F4/R1、F4/R2 4對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物不夠清晰，F(xiàn)4/R3除了擴(kuò)增出目的條帶，還有非特異性條帶產(chǎn)生，而F3/R1、F3/R3在后續(xù)試驗(yàn)中重復(fù)性不夠好，因此最終選定引物組合F1/R1作為檢測(cè)引物。

2.2 RPA檢測(cè)方法的靈敏度

將帶毒植株的cDNA進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)瑵舛确謩e為100、10、1、0.1、0.01、0.001 ng/μL，按照1.2.3所示的反應(yīng)體系進(jìn)行RPA靈敏度試驗(yàn)，同時(shí)參考已經(jīng)報(bào)道的ToCV檢測(cè)引物CP-F/CP-R[13]（擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為840 bp）進(jìn)行PCR靈敏度試驗(yàn)，比較兩種方法的檢測(cè)靈敏度。結(jié)果表明，RPA法的檢測(cè)靈敏度為1 ng/μL（圖2a），PCR法的檢測(cè)靈敏度為10 ng/μL（圖2b），RPA法的靈敏度要優(yōu)于PCR法。

2.3 RPA檢測(cè)方法的特異性

按照1.2.3的RPA反應(yīng)體系，檢測(cè)番茄褪綠病毒、番茄黃化曲葉病毒、番茄花葉病毒、黃瓜花葉病毒、煙草花葉病毒共5種病毒的cDNA，同時(shí)以脫毒番茄苗的cDNA為陰性對(duì)照，評(píng)價(jià)所建立的RPA檢測(cè)方法的特異性。從圖3中可以看出只有感染番茄褪綠病毒的番茄葉片對(duì)應(yīng)的RPA反應(yīng)擴(kuò)增出了目的條帶，感染其他種對(duì)照病毒的番茄葉片均未擴(kuò)增出條帶，由此證明本試驗(yàn)的RPA引物特異性高，可有效檢測(cè)番茄褪綠病毒。

3 討論

本研究建立了一種番茄褪綠病毒的RPA檢測(cè)方法，可以在38℃等溫條件并且在40 min內(nèi)完成目標(biāo)cDNA的快速擴(kuò)增，可特異性檢測(cè)番茄褪綠病毒，其他4種植物病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，RPA法檢測(cè)番茄褪綠病毒的靈敏度優(yōu)于常規(guī)PCR法，縮短了反應(yīng)時(shí)間，也不需要昂貴的儀器，可在簡(jiǎn)易實(shí)驗(yàn)室和田間完成快速檢測(cè)，為番茄褪綠病毒病的診斷和預(yù)警提供了一種高效簡(jiǎn)便的技術(shù)方法，在植物病毒快速檢測(cè)方面具有一定的實(shí)踐意義。

RPA對(duì)引物有嚴(yán)格要求，用于擴(kuò)增反應(yīng)的引物一般由30～35個(gè)核苷酸組成，這種較長(zhǎng)的引物與模板序列互補(bǔ)性好，使擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物特異性更高。RPA引物的設(shè)計(jì)沒(méi)有特殊的方法，只能通過(guò)篩選較好的引物進(jìn)行下一步試驗(yàn)。此外RPA對(duì)儀器設(shè)備的要求較低，不需要PCR儀，反應(yīng)可以通過(guò)水浴鍋或小型金屬浴完成，如果配合瓊脂糖凝膠電泳或小型便攜式設(shè)備，短時(shí)間內(nèi)即可獲得檢測(cè)結(jié)果，適合基層單位的快速檢測(cè)，具有廣泛的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)

[1] KING A M， ADAMS M J， CARSTENS E B. Virus taxonomy： ninth report of the international committee on taxonomy of viruses [M]. Amsterdam： Elsevier Academic Press， 2011.

[2] WINTERMANTEL W M， WISLER G C. Vector specificity， host range， and genetic diversity of Tomato chlorosis virus [J]. Plant Disease， 2006， 90（6）： 814-819.

[3] 趙黎明， 李剛， 劉永杰， 等. 侵染番茄的番茄褪綠病毒山東泰安分離物的分子鑒定和序列分析[J]. 植物保護(hù)， 2014， 40（5）： 34-39.

[4] 趙汝娜， 王蓉， 師迎春， 等. 侵染甜椒的番茄褪綠病毒的分子鑒定[J]. 植物保護(hù)， 2014， 40（1）： 128-130.

[5] FREITAS D， NARDIN I， SHIMOYAMA N， et al. First report of Tomato chlorosis virus in potato in Brazil [J]. Plant Disease， 2012， 96（4）： 593-594.

[6] 周濤， 楊普云， 趙汝娜， 等. 警惕番茄褪綠病毒在我國(guó)的傳播和危害[J]. 植物保護(hù)， 2014， 40（5）： 196 -199.

[7] 李潔， 李慧， 丁天波， 等. 膠東半島地區(qū)番茄褪綠病毒的快速檢測(cè)與鑒定[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015， 47（2）： 86-89.

[8] JACQUEMOND M， VERDINER E， DALMON A， et al. Serological and molecular detection of Tomato chlorosis virus and Tomato infectious chlorosis virus in tomato [J]. Plant Pathology， 2009， 58（2）： 210-220.

[9] 吳耀東， 徐民俊， 鄭文斌， 等.重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)及其在動(dòng)物病原快速檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2016， 36（10）： 1797-1802.

[10]樊曉旭， 趙永剛， 李林， 等.重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)在疾病快速檢測(cè)中的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫， 2016， 33（8）： 72-77.

[11]鄧婷婷， 黃文勝， 程奇， 等.重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻中的Cry1Ab/c 基因[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)， 2015， 15（3）： 187-193.

[12]劉靜， 武國(guó)干， 吳瀟， 等.重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米Bt11[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2018， 34（1）： 20-24.

[13]HIROTA T， NATSUAKI T， MURAI T， et al. Yellowing disease of tomato caused by Tomato chlorosis virus newly recognized in Japan [J]. Journal of General Plant Pathology， 2010， 76（2）： 168-171.

（責(zé)任編輯：楊明麗）