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    風(fēng)干肉中產(chǎn)脂肪酶瑞士乳桿菌TR13全基因組測序及序列分析

    2020-08-26 03:49:40田建軍張開屏趙艷紅李權(quán)威馬牧然馬俊杰曹凱慧
    食品科學(xué) 2020年16期
    關(guān)鍵詞:毒力基因組脂肪酸

    田建軍,張開屏,趙艷紅,李權(quán)威,馬牧然,馬俊杰,曹凱慧,靳 燁,*

    (1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古商貿(mào)職業(yè)學(xué)院食品工程系,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010070)

    乳酸菌是一種在自然界廣泛存在的無芽孢、厭氧或兼性厭氧、主要用于發(fā)酵各種生食和飼料、代謝產(chǎn)物主要以乳酸為主的革蘭氏陽性細(xì)菌[1-3]。由于其在發(fā)酵食品生產(chǎn)中的作用和作為益生菌的用途,是食品微生物學(xué)研究中最重要的細(xì)菌之一[4-5]。瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)是具有良好益生特性的一種乳酸菌,在發(fā)酵牛奶的過程中可產(chǎn)生抗高血壓的肽[6],已被廣泛用于發(fā)酵和功能性食品當(dāng)中[7-10]。

    傳統(tǒng)風(fēng)干肉是以牛、羊、馬等反芻動物新鮮肉為主要原料,在適宜溫度和通風(fēng)良好的條件下,將牛羊肉割成小條,掛在陰涼處,自然晾曬、風(fēng)干,去除肉中部分水分而形成的風(fēng)味獨特的肉制品,它屬于自然條件下,依靠內(nèi)源酶和有益微生物的作用,發(fā)生一系列生化變化而制成的一類發(fā)酵肉制品[11]。發(fā)酵肉制品中含有豐富的微生物資源,且具有高度的微生物群落多樣性[12]。乳酸菌是最早從發(fā)酵肉制品中分離出來的微生物,是傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中重要的優(yōu)勢菌群,與產(chǎn)品品質(zhì)密切相關(guān)[13-14]。近幾年也有一些從發(fā)酵肉制品中篩選肉用乳酸菌發(fā)酵劑的相關(guān)報道[15-17]。脂肪酶能夠使發(fā)酵肉制品產(chǎn)生獨特的風(fēng)味。Fernández等[18]發(fā)現(xiàn)將脂肪酶添加到中式香腸中能夠有效加速香腸中脂肪降解,促進(jìn)香腸中脂質(zhì)來源的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的生成、減少成熟時間。Zalacain等[19]在發(fā)酵香腸中添加外源脂酶,發(fā)現(xiàn)脂 酶可促進(jìn)飽和脂肪酸釋放,改變游離脂肪酸組成且不飽和脂肪酸含量顯著增加。Horchani等[20]將1 株產(chǎn)脂肪酶的葡萄球菌用作香腸發(fā)酵劑以此來改善風(fēng)味品質(zhì)。Lorenzo等[21]把產(chǎn)脂肪酶的4 種不同商業(yè)發(fā)酵劑添加到發(fā)酵香腸中,對其游離脂肪酸含量和種類進(jìn)行分,發(fā)現(xiàn)加工過程中脂肪酸有顯著的逐漸釋放的現(xiàn)象,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),產(chǎn)脂肪酶微生物菌株不僅僅可改善風(fēng)味成分的變化,對其肉中油脂的特性也產(chǎn)生了一定的影響。

    全基因組測序技術(shù)可以將細(xì)菌DNA(完整基因組序列)全部檢測出來,便于揭示生物體的完整DNA組成,通過序列分析及其功能注釋,能夠更好地理解物種內(nèi)部和物種之間的變異。嗜血流感桿菌(Haemophilus influenzae)是世界上第1個測序完成全基因組序列的細(xì)菌[22]。Callanan等[23]完成了第1株L. helveticus DPC 4571的全基因組測序。Schmid等[24]對3 株L. helveticus進(jìn)行了全基因組測序分析。盡管完整的基因組序列在準(zhǔn)確描述核心基因組、鑒定特異基因以及作為功能基因組學(xué)研究方面具有特殊的價值,但它們在公共數(shù)據(jù)庫中的代表性仍然很低。NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse#!/eukaryotes/)數(shù)據(jù)庫顯示,截止2019年9月,乳桿菌屬(Lactobacillus)全基因組測序菌株為2 531 株,其中L. helveticus測序菌株僅有57 株,含有質(zhì)粒的L. helveticus有14 株。到目前為止,就L. helveticus而言,國內(nèi)外的研究主要集中在其發(fā)酵產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)對機(jī)體健康的促進(jìn)作用以及對腸道菌群的影響[25-26],有關(guān)L. helveticus全基因組測序分析為主題的國內(nèi)外文獻(xiàn)及研究報道較少。

    本課題組從自然風(fēng)干羊肉中篩選到1 株L. helveticus TR13,前期研究表明,該菌株產(chǎn)脂肪酶能力較強(qiáng)且發(fā)酵特性良好,接種量2%、36 ℃發(fā)酵培養(yǎng)48 h,酶活性為10.89 U/mL,所產(chǎn)脂肪酶對中短鏈及長鏈底物均有降解作用,且對硝基苯酚棕櫚酸酯(C16)降解效果較好。為深入研究TR13的代謝機(jī)制,采用PacBio Illumina HiSeq測序平臺對細(xì)菌TR13進(jìn)行全基因組測序分析和GO(Gene Ontology)、COG(Cluster of Orthologous Groups)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫基因組基本功能注釋,以期為深入了解TR13在羊肉發(fā)酵香腸生成過程中代謝機(jī)理的研究提供生物信息學(xué)基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    L. helveticus TR13,內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院肉品科學(xué)技術(shù)團(tuán)隊前期從自然風(fēng)干肉制品中分離、篩選獲得。

    DNA抽提試劑盒(細(xì)菌)Wizard?Genomic DNA Purification Kit 美國Promega公司;DNA純化試劑盒DNA Clean Beads 中國諾唯贊公司;AP151-03 TransStart TopTaq DNA Polymerase 中國TransGene公司;二代建庫試劑盒NEXTflex? Rapid DNA-Seq Kit美國Biooscientific公司;三代建庫試劑盒SMRTbell Sample and Template Preparation Reagent Kits 美國Pacbio公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    MISEQ測序儀 美國Illumina公司;Pacbio RSII測序儀 美國Pacific Biosciences公司;GeneAmp?9700聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀美國ABI公司;5424R高速臺式冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司;TBS-380熒光儀 中國Sunnyvale公司;Covaris M220超聲 波破碎儀 中國Gene Company Limited。

    1.3 方法

    1.3.1L. helveticusTR13基因組DNA的提取

    用M R S固體培養(yǎng)基(含1 5%瓊脂粉)活化L. helveticusTR13,挑取單菌落接種于10 mL滅菌MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h,按2%接種量接種于500 mL MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),24 h后8 000 r/min離心8 min收集菌體,根據(jù)Bacterial Genomic DNA Isolation Kit試劑盒說明書,提取菌體基因組,并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組質(zhì)量,保證進(jìn)行后續(xù)實驗的DNA質(zhì)量足夠高。純化的基因組DNA采用TBS-380熒光儀進(jìn)行定量。高質(zhì)量的DNA(OD260nm/OD280nm=1.8~2.0,DNA總量≥15 μg,質(zhì)量濃度≥50 ng/μL)用于后面的建庫測序。

    1.3.2 文庫構(gòu)建

    基因組測序使用PacBio RS II單分子實時測序(SMRT)和Illumina測序平臺組合,Illumina的數(shù)據(jù)被用來評估基因組雜合度、基因組重復(fù)度、基因組大小、是否存在質(zhì)粒及污染,同時保證更完整更精確的組裝。

    Illumina文庫構(gòu)建:取至少1 μg基因組DNA,利用超聲波破碎儀進(jìn)行基因組DNA片段化,將DNA樣本剪切成小于400 bp的片段。使用NEXT flex?Rapid DNA-Seq試劑盒進(jìn)行文庫制備。具體步驟如下:連接A&B接頭;篩選去除接頭自連片段;瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段篩選,保留一端是A接頭、一端是B接頭的片段;氫氧化鈉變性,產(chǎn)生單鏈DNA片段;橋式PCR擴(kuò)增。

    單分子文庫建庫:取至少15 μg基因組DNA,利用超聲波破碎儀將基因組DNA處理成0~10 kb的片段,然后根據(jù)PacBio說明書進(jìn)行片段純化,末端補(bǔ)平,兩端分別連接SMRT bell測序接頭。

    1.3.3 Illumina預(yù)測

    制備的文庫在Illumina HiSeq X Ten儀器上進(jìn)行雙端測序(2×150 bp),利用PacBio RS II和Illumina平臺生成的數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。經(jīng)過一系列的質(zhì)量剪切之后得到的高質(zhì)量reads,稱之為clean data。利用canu及HGAP軟件進(jìn)行PacBio數(shù)據(jù)組裝,將reads組裝成contigs,然后人工判斷成環(huán),得到完整的染色體和質(zhì)粒基因組。最后利用Illumina測序數(shù)據(jù)對組裝結(jié)果進(jìn)行校正。本次測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

    1.3.4 基因預(yù)測與注釋

    利用Glimmer對基因組中的編碼序列(coding sequence,CDS)進(jìn)行預(yù)測,質(zhì)?;虿捎肎eneMarkS軟件預(yù)測,tRNAscan-SE進(jìn)行tRNA預(yù)測,Barrnap進(jìn)行rRNA預(yù)測。利用BLAST、Diamond、HMMER等序列比對工具,將獲得的基因提交COG[27]、GO[28]、KEGG[29-30]數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,獲得功能注釋信息。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 基因組組裝與預(yù)測

    采用PacBio和Illumina HiSeq測序平臺,對細(xì)菌TR13進(jìn)行完成圖測序,測序及預(yù)測結(jié)果如表1所示。TR13染色體基因組為環(huán)狀分子,染色體總數(shù)為1,基因組序列總長度為2 172 224 bp,GeneMarkS軟件預(yù)測沒有發(fā)現(xiàn)質(zhì)?;?。平均GC含量為36.82%。對細(xì)菌的編碼基因進(jìn)行預(yù)測,獲得編碼基因(CDS數(shù))2 356 個,編碼基因總長度為1 883 532 bp,平均長度為799.46 bp,基因密度(即基因組中每1 kb的堿基中所對應(yīng)的基因數(shù)目)為1.08 個/kb,占基因組百分比為86.71%,編碼基因GC含量為37.47%,基因間區(qū)長度為288 692 bp,基因間區(qū)GC含量為32.57%,基因間區(qū)占基因百分比為13.29%。

    表1 基因組統(tǒng)計及預(yù)測Table 1 Genome statistics and prediction

    表2 編碼基因長度分布Table 2 Length distribution of protein-coding genes

    如表2所示,序列長度分布在1 000 bp以上的基因數(shù)最多,數(shù)值為678,占全部編碼基因的28.78%。其中最小基因序列長度為114 bp,對應(yīng)蛋白質(zhì)序列長度為37 aa;最大基因序列長度為5 184 bp,對應(yīng)蛋白質(zhì)序列長度為1 727 aa。對應(yīng)蛋白質(zhì)平均序列長度為265 aa。TR13基因組中含串聯(lián)重復(fù)序列36 個,重復(fù)序列占基因組的總長度5 249 bp,占基因組百分比為0.28%。重復(fù)序列長度最小為40 bp,最大為702 bp,36 個重復(fù)序列平均長度為145.8 bp。

    2 356 個編碼基因中,有1 891 個基因的起始密碼子為ATG,其中有1 286 個基因的終止密碼子為TAA、385 個為TAG、220 個為TGA;154 個基因的起始密碼子為GTG,其中有97 個基因的終止密碼子為TAA、42 個為TAG、15 個為TGA;311 個基因的起始密碼子為TTG,其中有175 個基因的終止密碼子為TAA、84 個為TAG、52 個為TGA。

    TR13基因組中含有15 個rRNA操縱子基因,分別由5 個5S rRNA、5 個16S rRNA、5 個23S rRNA組成,其中3 個分布于負(fù)義鏈,5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA各1 個。TR13基因組中含有63 個tRNA基因,tRNA類型及其數(shù)量如表3所示。

    表3 tRNA預(yù)測結(jié)果統(tǒng)計Table 3 Statistics of tRNA prediction

    由表3可知,tRNA基因分別轉(zhuǎn)運Arg、Gly、Leu、Ser等20 種不同的氨基酸,其中轉(zhuǎn)運Arg、Gly、Leu、Ser的基因數(shù)最多,均為5 個,轉(zhuǎn) 運Cys和Trp的基因最少僅有1 個。

    2.2 基因組圈圖分析

    基因組圈圖可以全面展示基因組的特征,如基因在正、反義鏈上的分布情況、基因的COG功能分類情況、GC含量、基因組島、同源基因等。通過CGView軟件繪制基因組圈圖,如圖1所示。

    CGView圈圖最外面一圈為基因組大小的標(biāo)識,L. helveticusTR13基因組為1 套環(huán)狀無質(zhì)粒分子,基因總長度為2 172 224 bp。第2圈和第5圈為正鏈、負(fù)鏈上的CDS,不同的顏色表示不同的COG功能分類,編碼基因的數(shù)量為2 356 個,其中COG注釋的基因為1 942 個,占編碼基因的82.43%,分別從新陳代謝、信息存儲與處理、細(xì)胞作用與信號傳遞和無明顯特征4 大分類,復(fù)制、重組和修復(fù),翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生,碳水化合物運輸和代謝等18 個類型上得到了注釋。第3圈和第4圈分別為正鏈負(fù)鏈上的CDS、tRNA、rRNA,TR13細(xì)菌基因組中含有15 個rRNA操縱子,分別由5 個5S rRNA、5 個16S rRNA、5 個23S rRNA組成,含有63 個tRNA基因,分別轉(zhuǎn)運Arg、Gly、Leu、Ser等20 種不同的氨基酸。第6圈為GC含量,向外的部分表示該區(qū)域GC含量高于全基因組平均GC含量,峰值越高表示與平均GC含量差值越大,向內(nèi)的部分表示該區(qū)域GC含量低于全基因組平均GC含量,峰值越高表示與平均GC含量差值越大,基因組平均GC含量為36.82%。第7圈為GC-skew值,具體算法為(G-C)/(G+C),在生物意義上該值為正值時正鏈更傾向于轉(zhuǎn)錄CDS,為負(fù)值時負(fù)鏈更傾向于轉(zhuǎn)錄CDS;最內(nèi)一圈為基因組大小標(biāo)識?;蚪M圈圖可以使研究者對菌株基因組的特征有更全面、更直觀的認(rèn)識。

    圖1 基因組CGViieeww圈圖Fig. 1 Graphical representation of the genome of strain TR13

    2.3 基因組的功能注釋

    對預(yù)測得到的編碼基因進(jìn)行基礎(chǔ)的功能注釋,通過與COG、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫比對進(jìn)行功能注釋。TR13基因組中所有基因能夠注釋到GO信息的基因數(shù)目為1 972 個,能夠注釋到COG信息的基因數(shù)目為1 942 個,與KEGG數(shù)據(jù)庫比對能夠定位到具體Pathway的基因數(shù)目有1 143 個。

    2.3.1 GO注 釋結(jié)果

    根據(jù)對比結(jié)果,采用BLAST2go對比軟件,在數(shù)據(jù)庫中對TR13進(jìn)行GO注釋,如 圖2所示。TR13基因組中含細(xì)胞組成、生物過程、分子功能3大類型,在GO分類中共有1 792 個基因得到了功能注釋,占所有編碼基因(2 356 個)的百分比為76.06%。其中:細(xì)胞組成相關(guān)的基因數(shù)量878 個;生物過程相關(guān)的基因數(shù)量1 295 個;分子功能相關(guān)的基因數(shù)量1 478 個。1 792 個基因共注釋了40 種功能特性。

    在生物過程這一層面分別得到代謝過程、細(xì)胞過程和單一生物過程等18 種功能注釋,其中和代謝有關(guān)基因數(shù)量最多為1 019 個,與細(xì)胞過程相關(guān)基因855 個,與單一生物過程相關(guān)基因609 個。

    在細(xì)胞組成層面得到10 種功能注釋,其中細(xì)胞膜和細(xì)胞膜組分功能相關(guān)的基因最多。在分子功能層面分共得到12 種功能注釋,其中與催化活性有關(guān)的基因最多為1 083 個,其次為細(xì)胞附著相關(guān)基因861 個。功能基因中與抗氧化活性相關(guān)的基因有硫氧還原蛋白-二硫鍵還原酶、谷胱甘肽還原酶、NAD(FAD)依賴性脫氫酶等7 個基因,信息如表4所示。

    2.3.2 COG注釋結(jié)果

    采用Diamond軟件,參數(shù)設(shè)置為E-value 10-5,在數(shù)據(jù)庫eggNOG(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)中對TR13進(jìn)行COG注釋,如表5所示。

    表5 COG注釋結(jié)果詳情Table 5 COG annotation results

    TR13編碼基因在COG中的分類數(shù)量為4,COG的類型數(shù)量為18,編碼基因組中共有1 942 個基因在COG數(shù)據(jù)庫中得到了注釋,注釋基因占比為82.43%。

    COG分類分別為新陳代謝、信息存儲與處理、細(xì)胞作用與信號傳遞和無明顯特征4 種類型,其中和新陳代謝有關(guān)的基因數(shù)為615 個,分為8 種類型。信息存儲與處理相關(guān)基因565 個,分為3 種類型。細(xì)胞作用與信號傳遞相關(guān)基因261 個,分為6 種類型,特征較弱的未知功能基因有512 個,歸為1 種類型。

    表6 脂質(zhì)的運輸與代謝相關(guān)基因Table 6 Lipid transport- and metabolism-related genes

    新陳代謝COG聚類主要集中于碳水化合物的運輸與代謝(相關(guān)基因146 個)、氨基酸的運輸與代謝(相關(guān)基因143 個)、核苷酸的運輸與代謝(相關(guān)基因90 個)、無機(jī)離子的運輸與代謝(相關(guān)基因82 個)、脂質(zhì)的運輸與代謝(相關(guān)基因44 個)。其中脂質(zhì)的運輸與代謝如表6所示,gene0183、gene0428、gene2011分別為3 種不同酯酶的編碼基因,gene0893作為三酰甘油脂肪酶基因具有分解脂肪的作用。gene1050(mvaK2)、gene1052(mvaK1)、gene1915(dagK)為3 種不同的激酶基因,是一類可以從高能供體分子(如ATP)轉(zhuǎn)移磷酸基團(tuán)到特定靶分子(底物) 的酶,此過程為磷酸化。gene0547(bcrC)為磷酸酶基因,與激酶的作用相反。gene0301(acpS)為holo-?;d體蛋白合成酶基因,gene0931(acpP)和gene2286(acpP)為?;d體蛋白質(zhì)基因,具有合成脂肪酸的作用。

    2.3.3 KEGG注釋結(jié)果

    KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)是基因組研究方面的公共數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫是系統(tǒng)分析基因功能,聯(lián)系基因組信息和功能信息的大型知識庫。采用Diamond對比軟件,參數(shù)設(shè)置為E-value 10-5,在KEGG數(shù)據(jù)庫中對TR13進(jìn)行KEGG注釋。

    L. helveticusTR13在KEGG數(shù)據(jù)庫中共有1 144 個基因分別在代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過程、生物體系統(tǒng)、人類疾病6大功能35 個通路上得到功能注釋,結(jié)果如圖3所示。樣本中涉及的代謝通路總數(shù)以及參與每個代謝通路的基因組數(shù)目,分析發(fā)現(xiàn)在代謝途徑層面特別是碳水化合物代謝、核苷酸代謝和氨基酸代謝得到較多的基因功能注釋。其中634 個基因在代謝通路上得到注釋,占KEGG中全部注釋基因的55.42%,12 個代謝通路中,碳水化合物代謝相關(guān)的基因為132 個,占代謝通路注釋基因(634 個)的20.82%,與脂質(zhì)代謝通路有關(guān)的基因有48 個。110 個基因在環(huán)境信息處理層面得到注釋,其中與膜運輸有關(guān)的基因為86 個,與信號傳導(dǎo)有關(guān)的基因24 個。

    圖3 L. helveticus TR13的KEGG功能分類圖Fig. 3 KEGG functional classification of L. helveticus TR13

    表7 脂質(zhì)代謝通路及其相關(guān)基因Table 7 Lipid metabolism pathways and related genes

    如表7所示,TR13基因組中主要包含了脂肪酸合成、脂肪酸降解、不飽和脂肪酸合成、初級膽汁酸生物合成、次生膽汁酸生物合成、酮體的合成與降解、甘油脂類代謝、甘油磷脂代謝、鞘脂類代謝共9 條通路信息。其中ko00061通路為脂肪酸合成通路,TR13基因組序列分析共獲得gene0428、gene0931、gene1746等15 個相關(guān)基因,ko00071為脂肪酸生物降解通路,在TR13基因組中包含gene1800和gene1984相關(guān)基因2 個。

    表8 脂肪酸生物合成與降解通路信息Table 8 Information about fatty acid biosynthesis and degradation pathways

    如表8所示,ko0061為脂肪酸合成代謝通路,包含gene0428、gene0931、gene1746等15 個基因,基因大小分布于243~1 380 bp之間,其中g(shù)ene0931和gene2286為?;d體蛋白質(zhì)acpP基因,?;d體蛋白是脂肪酸合成中的關(guān)鍵蛋白質(zhì),作為脂?;妮d體將脂?;鶑囊粋€酶反應(yīng)轉(zhuǎn)移到另一個酶反應(yīng)。Ko00071為脂肪酸分解代謝通路,TR13基因組中包含了與其相關(guān)的基因有g(shù)ene1800乙酰CoA?;D(zhuǎn)移酶和乙醛脫氫酶/乙醇脫氫酶gene1984。ko01040為不飽和脂肪酸的生物合成代謝通路,TR13基因組中包含了gene1746和gene2284,均為?;d體蛋白還原酶基因(fabG)。

    2.3.4 毒力基因預(yù)測結(jié)果

    來源于微生物并對微生物自身侵染和引起特定宿主疾病具有促進(jìn)作用的物質(zhì)稱為毒力因子,主要包括細(xì)菌毒素、調(diào)節(jié)細(xì)菌黏附作用的細(xì)胞表面蛋白、對細(xì)菌本身具有保護(hù)作用的蛋白、細(xì)胞表面碳水化合物以及具有細(xì)菌致病性的水解酶等。毒力因子數(shù)據(jù)庫VFDB,是一個全面一體化的病原菌毒力因子信息管理網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫。利用軟件Diamond比對VFDB核心數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫,獲得毒力因子基因注釋概況并進(jìn)行統(tǒng)計結(jié)果如表9所示。L. helveticusTR13有對病毒相關(guān)基因的調(diào)控、防守毒力因子、進(jìn)攻毒力因子和非特異性毒性因子4 個類型的毒力基因,其中鐵吸收系統(tǒng)毒力因子基因數(shù)最多為24 個,其次為黏附毒力基因17 個,共預(yù)測到可能的毒力基因共75 個。

    表9 毒力基因預(yù)測分類統(tǒng)計Table 9 Classi fication statistics of the predicted virulence genes

    2.3.5 耐藥基因預(yù)測結(jié)果

    利用軟件Diamond,通過CARD數(shù)據(jù)庫注釋,獲得每個基因組中包含的耐藥基因的信息。L. helveticusTR13共預(yù)測到150 個耐藥基因,耐藥基因預(yù)測分類統(tǒng)計如圖4所示。主要有抗生素耐藥基因、變異或突變體耐藥基因、糖肽耐藥基因、通過分子旁路作用產(chǎn)生抗生素耐藥性的基因、調(diào)節(jié)抗生素外排的基因、四環(huán)素抗性基因、氨基糖苷類耐藥基因、內(nèi)酰胺耐藥基因等。

    圖4 耐藥基因預(yù)測分類統(tǒng)計Fig. 4 Classi fication statistics of the predicted drug resistance genes

    3 結(jié) 論

    L. helveticus TR13基因組為1 套環(huán)狀無質(zhì)粒分子,總長度為2 172 224 bp。GC含量為36.82%,預(yù)測到2 536個編碼基因,其中編碼基因總長度為1 883 532 bp,平均長度為799.46 bp,平均密度為1.08 個/kb,對應(yīng)蛋白質(zhì)平均序列長度為265 aa,占基因組百分比為86.71%,基因中包含15 個rRNA操縱子和63 個tRNA。

    TR13基因組中能夠注釋到GO信息的基因數(shù)目為1 972 個,包含了40 種功能特性,占所有編碼基因(2 356 個)的76.1%。能夠注釋到COG信息的基因數(shù)目為1 942 個,注釋基因占比為82.43%。在KEGG數(shù)據(jù)庫中共有1 144 個基因分別在代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過程、生物體系統(tǒng)、人類疾病6 大功能35 個通路上得到功能注釋。預(yù)測到可能的毒力基因75 個,耐藥基因150 個。

    脂質(zhì)代謝的通路信息分析顯示,TR13基因組中主要包含了脂肪酸合成、脂肪酸降解、不飽和脂肪酸合成、初級膽汁酸生物合成、次生膽汁酸生物合成、酮體的合成與降解、甘油脂類代謝、甘油磷脂代謝、鞘脂類代謝共9 條通路信息。TR13基因組中包含了ko00061脂肪酸合成通路相關(guān)的15 個基因,ko00071脂肪酸生物降解通路相關(guān)的gene1800和gene1984基因2 個。

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