膜苞鳶尾不同極性部位的抗炎活性研究

常利華，南禧辰，張曼瑞，趙勁竹，嚴敏，楊陽

（西安醫(yī)學院藥學院，陜西西安 710000）

炎癥是具有血管系統(tǒng)的活體組織對各種損傷因子的刺激所產(chǎn)生的防御反應，臨床表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛等癥狀。目前在改善炎癥的藥物中，合成的化學抗炎藥均具有明顯的不良反應，而天然藥物具有資源豐富、療效確切、副作用小等優(yōu)點，故成為當前研究熱點[1-2]。

膜苞鳶尾（Iris scariosaWilld .exLink）屬于鳶尾科鳶尾屬植物，主要分布于新疆等地區(qū)，其根狀莖和根是新疆中草藥鐮葉馬藺根的藥材基源，具有清熱解毒、利咽等功效，可治療癌癥、炎癥、細菌和病毒感染等多種疾病[3-4]。膜苞鳶尾中分離得到的天然產(chǎn)物以黃酮為主，而黃酮的抗炎活性是其最主要的生物活性之一[5]。鳶尾屬植物根及根狀莖在世界上許多國家和地區(qū)都被用于治療炎癥相關(guān)疾病，但目前尚未有文獻報道過其對活化巨噬細胞炎性遞質(zhì)生成的影響。

本實驗通過脂多糖（LPS）刺激RAW264.7小鼠巨噬細胞系建立炎癥細胞模型[6]，檢測從膜苞鳶尾根狀莖提取分離得到的5種不同極性部位對炎癥模型細胞中炎癥介質(zhì)NO分泌量的影響[7-8]，為后續(xù)分離純化具有抗炎活性的天然產(chǎn)物以及進一步開發(fā)利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

膜苞鳶尾的根及根狀莖采自新疆察布查爾錫伯自治縣，經(jīng)北京師范大學生命科學學院植物分類學教授劉全儒鑒定為鳶尾科鳶尾屬植物膜苞鳶尾（Irisscariosa Willd. exLink）；RAW264.7細胞，購自中國北京協(xié)和細胞資源中心。

1.2 儀器與試藥

Multiskkango1510全波長酶標儀，ThermoScientific；MCO-15AC型CO2恒溫培養(yǎng)箱，日本Sanyo公司；SW-CJ-1F型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Ti-u型倒置顯微鏡，日本Nikon公司；UV-1780紫外分光光度計，日本島津公司；BS124S電子天平，北京賽多利斯天平有限公司。

脂多糖（LPS），Sigma公司；二甲基亞砜（DMSO），99.7%，MkSeal；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT），純度≥98.0%，上海滬震實業(yè)有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，北京協(xié)和細胞資源中心；NO檢測試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；鳶尾苷標準品（批號：JZ15020119），南京景竹生物科技有限公司，HPLC≥98%。

1.3 膜苞鳶尾提取物溶液的制備

1.3.1 膜苞鳶尾不同極性部位提取物的制備

取膜苞鳶尾藥材粉碎，過20目篩，儲于干燥器中備用。將藥材粉末分別加入到石油醚（沸程30～60）、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水中，料液比1∶30（g∶mL），于溫度40 ℃、功率450 W下超聲提取30 min，布氏漏斗抽濾2次，50 ℃左右減壓濃縮至膏狀，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 提取物溶液配制

稱取膜苞鳶尾根及根狀莖的正丁醇極性部位、水極性部位、二氯甲烷極性部位、乙酸乙酯極性部位和石油醚極性部位，在1 mL EP管中用適量的DMSO溶解并制成200 μg/mL的工作液，現(xiàn)用現(xiàn)加10%FBS的DMEM培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，控制DMSO量在千分之一以下。

1.4 膜苞鳶尾提取物抗炎活性試驗

1.4.1 細胞培養(yǎng)與分組設計

RAW264.7細胞培養(yǎng)于含100 U/mL雙抗、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育生長，隔日傳代。取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞180μL，接種于96孔培養(yǎng)板。按照表1進行試驗設計，每個給藥組設置3個給藥濃度，每個濃度3個復孔，各孔加入10 μg提取物溶液，各孔終體積用DMEM培養(yǎng)基補充至200 μL。試驗中，以無細胞的培養(yǎng)基（處理0）為空白組，加細胞的培養(yǎng)基（處理1）為正常對照組。

表1 試驗設計

1.4.2 MTT法檢測提取物對細胞活力的影響

將表1中各組細胞于37 ℃、5% CO2條件下孵育24 h后，吸走細胞培養(yǎng)上清液，每孔加入100 μL濃度為5 mg/mL的MTT，培養(yǎng)4 h后，棄掉細胞上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩器上輕搖10 min，結(jié)晶溶解后，立即比色測定?？瞻捉M（處理0）調(diào)零后，用全波長酶標儀在490 nm波長處測出細胞對照組和各實驗組的吸光度A。根據(jù)公式1計算細胞存活率。

式中，A給藥組為處理2～6的吸光度數(shù)值，A空白為處理0的吸光度數(shù)值；A正常對照組為處理1的吸光度數(shù)值。

1.4.3 Griess法測定提取物對RAW264.7細胞NO釋放的影響

LPS可以刺激誘導RAW264.7細胞產(chǎn)生多種與炎癥相關(guān)的遞質(zhì)和細胞因子，從而建立炎癥細胞模型。因此，用LPS誘導的RAW264.7炎癥細胞代替表1中2～6組的正常細胞進行試驗，并設置未給藥的LPS誘導RAW264.7炎癥細胞作為模型對照組。

在炎癥反應中，NO是炎癥反應與免疫調(diào)節(jié)的效應因子和調(diào)節(jié)因子。NO參與多種炎癥信號轉(zhuǎn)導，與多種炎癥因子互相作用。NO在炎癥反應每一階段都有產(chǎn)生，NO的過量產(chǎn)生與炎癥密切相關(guān)，而抑制NO生成則是抗炎活性的直接指標[9-10]。用NO檢測試劑盒按照說明書要求進行標準曲線的繪制，得到標準曲線為Y=0.007 7X+0.073 8，r=0.998 4。將表1中各組細胞于37 ℃、5% CO2條件下孵育24 h后，每孔取50 μL上清液按照NO檢測試劑盒說明書的要求進行測定，根據(jù)標準曲線得到NO濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAW264.7細胞活力測定結(jié)果

采用MTT法檢測膜苞鳶尾不同極性部位對RAW264.7炎癥細胞活力的影響，結(jié)果如圖1顯示。當石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和水部位在質(zhì)量濃度為5～20 μg/mL范圍內(nèi)，作用于RAW264.7炎癥細胞24 h，給藥組細胞的存活率均大于100%，且在5 μg/mL和15 μg/mL濃度下可刺激RAW264.7細胞增殖，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。正丁醇部位在質(zhì)量濃度為50～200 μg/mL范圍內(nèi)，給藥組細胞的存活率大于100%，且在50 μg/mL和100 μg/mL濃度下可刺激RAW264.7細胞增殖，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。實驗結(jié)果表明，本實驗濃度范圍內(nèi)膜苞鳶尾的不同極性部位對細胞均無毒性作用。

2.2 RAW264.7炎癥細胞NO生成量測定結(jié)果

在確定膜苞鳶尾不同極性部位的無毒性劑量范圍后，研究了膜苞鳶尾不同極性提取物對LPS誘導的RAW264.7小鼠巨噬細胞NO生成量的影響，結(jié)果如圖2所示。當細胞未受到外界LPS刺激時，細胞基本不表達NO；在終濃度為1 μg/mL的LPS刺激24 h后，細胞NO含量明顯上升，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），表明LPS刺激RAW264.7巨噬細胞后，能誘導細胞釋放大量炎性介質(zhì)NO。經(jīng)過膜苞鳶尾不同極性部位作用后，巨噬細胞中NO的釋放受到不同程度的抑制，且5種提取物的抑制作用均呈現(xiàn)出劑量依賴效應。當藥物濃度為5～20 μg/mL時，石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、水部位NO生成量明顯降低（P＜0.001）。當濃度為5 μg/mL時，抑制NO的效果為石油醚部位＞乙酸乙酯部位＞二氯甲烷部位＞水部位；當藥物濃度為15 μg/mL時，抑制NO的效果為乙酸乙酯部位＞二氯甲烷部位＞石油醚部位＞水部位；當藥物濃度為20 μg/mL時，抑制NO的效果乙酸乙酯部位＞二氯甲烷部位＞石油醚部位＞水部位。當藥物濃度在50～200 μg/mL時，正丁醇部位才能夠顯著抑制炎癥模型細胞中NO的生成，說明正丁醇部位抗炎效果最差。

圖1 膜苞鳶尾不同極性部位對RAW264.7炎癥細胞活力的影響

膜苞鳶尾根狀莖乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷部位抗炎活性較強，分析原其因可能是因為相同質(zhì)量下的不同極性部位的浸膏，極性小的部位所含的黃酮類成分較高，而極性大的水和正丁醇部位中因含有大量的多糖類成分，黃酮類含量相對較低，因此抗炎活性較弱。

圖2 膜苞鳶尾不同極性部位對LPS誘導的RAW264.7細胞NO生成的影響

3 結(jié)論

膜苞鳶尾的不同極性部位對細胞均無毒性作用，且乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷部位抗炎活性較強，這為后續(xù)抗炎活性導向下的單體分離以及藥理研究工作提供了理論依據(jù)。