王顥霖

關(guān)鍵詞：普魯蘭酶;克隆;畢赤酵母;誘導(dǎo)表達

在淀粉的加工行業(yè)中，高壓酸解法作為葡萄糖生產(chǎn)的老工藝具有需要設(shè)備少、耗時短的優(yōu)點，但其副產(chǎn)物較多，耗費的酸和堿的量較高，而且為了去除苦味必須采用嚴(yán)格控制溫度、緩慢結(jié)晶的辦法，需要淀粉加工工廠投入較高的人力資源和設(shè)備成本;如果運用a-淀粉酶作用于較長的淀粉分子使其斷裂成小分子，使高濃度的淀粉糊在高溫下糊化液化，再運用糖化型淀粉酶，就可以高效地得到目的產(chǎn)物。此法具有生產(chǎn)率高、成本低、副產(chǎn)物少、結(jié)晶快等優(yōu)點，對于生產(chǎn)實踐具有很大的意義。

普魯蘭酶最早是在肺炎克雷伯氏菌中被發(fā)現(xiàn)，并且被發(fā)現(xiàn)可以水解支鏈淀粉中的a-1，6糖苷鍵，不僅能夠極大提高淀粉的水解效率，還能得到具有高特異性的產(chǎn)物，對于淀粉的糖化步驟十分重要。自然界中的天然酶一般都具有含量低、提取較難、不易制備的弊端，通常在自然界中篩選特定性質(zhì)酶的效率很低。而研究酶在工程菌株中的克隆與表達，選育出更好的產(chǎn)酶菌株，對于獲得更高酶活性，更高表達量的性能優(yōu)良的酶具有非常重要的意義。

各項研究表明，普魯蘭酶可被許多菌種表達，如緩和鏈球菌，大腸桿菌，耐熱產(chǎn)硫梭菌，枯草芽孢桿菌，酵母菌等等。在原核表達系統(tǒng)中，大腸桿菌表達系統(tǒng)作為研究較為深入的表達系統(tǒng)，在1984年最早成功異源表達了普魯蘭酶，但是其翻譯后修飾的過程比較簡單，表達量也很低。經(jīng)過科研人員的不斷努力，對表達宿主大腸桿菌進行優(yōu)化和對發(fā)酵條件進行改善，生產(chǎn)出的酶活力曾經(jīng)高達502U/mL，具有很強的工業(yè)應(yīng)用前景。但是其高密度發(fā)酵時的溫度一般是低于37℃的，不利于細(xì)菌的快速生長;枯草芽孢桿菌也具有清晰的遺傳背景和生理特性，未經(jīng)優(yōu)化的情況下，表達普魯蘭酶的活力可達到10.94U/mL。兩者都具有一定的工業(yè)生產(chǎn)普魯蘭酶的潛力。

真核生物Pichia pastoffs最早是在1987年被Cregg研究將其作為宿主成功的進行了外源蛋白的表達實驗，被發(fā)現(xiàn)其在外源表達方面所具有的潛力。隨著人們對Piehia pas-toffs研究的深入，發(fā)現(xiàn)Pichiapastoffs在外源表達方面的獨特優(yōu)勢，與其他表達系統(tǒng)比較起來的優(yōu)點大體上為：對細(xì)胞沒有毒害，是一種安全的表達宿主。表達的量通常較高，可以獲得大量的目的蛋白，部分蛋白的表達量高至12g/L。不但可以用于分泌型表達，還可以用于細(xì)胞內(nèi)表達。表達出的蛋白易于分離純化。某些在細(xì)菌系統(tǒng)中表達不好的真核基因，在酵母系統(tǒng)中表達情況良好。能夠在廉價的培養(yǎng)基上生長，十分節(jié)省實驗成本，方便用于外源基因的操作。作為真核生物，其轉(zhuǎn)錄翻譯后加工、外分泌、翻譯后修飾以及糖基化修飾的性能良好，可以使表達產(chǎn)物更加接近于天然蛋白質(zhì)，甚至與天然蛋白質(zhì)一樣。利用高表達的啟動子MOX、AOX、LAC4等，外源基因可同源重組到Pichia pastoris的基因組中進行穩(wěn)定復(fù)制，有利于外源基因的表達。曾用于生產(chǎn)SCP，有著清晰的遺傳背景和良好的發(fā)酵基礎(chǔ)。細(xì)胞生長速度快，適用于高密度發(fā)酵能夠移去起始Met，使重組蛋白在用于臨床應(yīng)用時不引起免疫反應(yīng)。因此，對醫(yī)療行業(yè)起到很大的貢獻。

實驗前期將來自于本實驗室的普魯蘭酶基因在大腸桿菌BL21 DE3中進行表達，其表達量非常低。換用能緩解大腸桿菌稀有密碼子問題大腸桿菌Rossta DE3也未能明顯提高蛋白的表達量。

本實驗旨在通過以更換表達宿主的方式提高蛋白的表達量。即將目的基因同源重組入PichiapastorisGSll5，對重組菌進行誘導(dǎo)表達，分析其蛋白產(chǎn)率。

一、材料與方法

（一）材料

1、菌株和質(zhì)粒。含有Thermogota thermarum中獲取的普魯蘭酶基因的重組質(zhì)粒pET21a-TT由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)推廣樓酶工程504實驗室構(gòu)建和保存，畢赤酵母（Piehia pasto-ris P.pastoris）GSll5和表達載體pPIC3.5K由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程實驗室保存。

2、工具酶和主要試劑。山梨醇（D-Sorbit01），瓊脂（Agar Powder），酵母提取物（Yeast Extract），質(zhì)粒小提試劑盒，PCR產(chǎn)物回收試劑盒，膠回收DNA試劑盒，椰油醇硫酸鈉（SDS）胰蛋白胨（Ttyton），瓊脂糖（Agarose），三羥基甲基氨基甲烷（riffs），氨芐青霉素（Ampicillin），甘氨酸（Glycine），三羥甲基氨基甲烷（Tris），乙二胺四乙酸（EDTA）等。甲醇，異丙醇等普通試劑均為分析純試劑。各種工具酶購自SMOBIL公司。設(shè)計引物如下：

TF-EcoRI-F：CCGGAATFCGCCACCATGAAAAGGCTAC-337TACTCATCGTCATAACTTGTACAG

Tr-NotI-R：ATAAGAATGCGGCCGCTCAGTGGTGGTGG-TGGTGG

5"AOX GACTGGTTCCAATYGACAAGC;

3"AOX GCAAATGGCATTCTGACATCC

引物交由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。目的基因和載體測序以及轉(zhuǎn)化子測序由鄭州何澤公司完成。

（二）方法

1、含目的基因載體的驗證。從-80℃冰箱取出10%甘油菌保存的重組菌劃線于帶氨芐抗性的LB平板，在恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)活化12～16h。挑取單菌落于5mL帶氨芐抗性LB培養(yǎng)試管中，放置于搖床37℃，220 rpm培養(yǎng)12～16h。提取質(zhì)粒。測定濃度并進行瓊脂糖凝膠電泳，將位置正確的質(zhì)粒送去測序公司進行測序。

2、重組質(zhì)粒的構(gòu)建。使用引物TT-EcoRI-F與TT-No.tI-R擴增目的基因片段。按如下體系將樣品加入PCR管：ddH20 38 txL;TT-EcoRI-F 2.5μL;TY-Nod-R 2.5μL;pET21a-TY 1μL;10xQ5聚合酶緩沖液5μL;Q5聚合酶1μL。設(shè)置程序：98℃預(yù)變性2 min;98～C變性15 s，66℃退火15 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán);72℃再延伸2 min;16℃保存，完成后取3tμL瓊脂糖凝膠電泳驗證擴增結(jié)果。

擴增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠回收純化后，與抽提好的pPIC3.5K質(zhì)粒同時進行EcoRI與NotI雙酶切，酶切體系：ddH20 23 ILL;TT或pPIC3.5K 20μL;EcoRI IμL;NotI1μL;10xCutsmart 5μL。設(shè)置酶切程序：37℃酶切1 h，80℃滅活15 min。酶切產(chǎn)物經(jīng)由核酸吸附柱回收后，測定濃度。按如下體系加入樣品進行酶連;TT 8.5 μL;pPIC3.5K 8.5 μL;連接酶1μL;10x連接酶緩沖液2μL。設(shè)置酶連程序：16℃ 3 h，65℃30 min。酶連完成后全部轉(zhuǎn)化200μL感受態(tài)大腸桿菌中，涂布帶氨芐的LB平板，37℃培養(yǎng)活化12～16 h，挑取轉(zhuǎn)化子以TF-EeoRI-F與3AOX為引物進行菌落PCR，瓊脂糖凝膠電泳驗證轉(zhuǎn)化子。挑取能擴增出正確條帶的轉(zhuǎn)化子于帶氨芐抗性的LB培養(yǎng)液中，放置于搖床37℃，220 rpm培養(yǎng)12～16 h。提取質(zhì)粒。測定濃度并送去測序。

3、重組酵母菌株的構(gòu)建與驗證。畢赤酵母感受態(tài)制備，質(zhì)粒的線性化與畢赤酵母的電轉(zhuǎn)參照文獻2中的方法進行。將長出的畢赤酵母轉(zhuǎn)化子點到提前準(zhǔn)備好的濃度為0.5 g/L的G418抗性平板上，做好標(biāo)記。30℃培養(yǎng)3～5d后正常生長出的轉(zhuǎn)化子繼續(xù)點到0.75 g/L的G418抗性平板上，逐步提升濃度篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子。用無菌牙簽將高拷貝轉(zhuǎn)化子挑到5μL無菌水中混勻，放置在PCR儀中95℃處理5min。然后取其中1μL作為模板進行PCR。以5AOX與3AOX為引物，驗證基因是否插入基因組。

4、重組酵母菌株的誘導(dǎo)表達。將高拷貝轉(zhuǎn)化子及野生型GS115接種至50 mL（500 mL錐形瓶）BMGY培養(yǎng)液中，放置于搖床，30℃下250 rpm培養(yǎng)至0D600=2～6（16～18h），12000 rpm室溫離心5 min收集菌體。用無菌水12000 rpm室溫離心5 min清洗三次去除殘余甘油，最后用100 mL BMMY重懸細(xì)胞。于30℃，250 rpm的條件下誘導(dǎo)表達，每24 h取500μL菌液并補加500 μL甲醇。將取得的菌液12000 rpm離心2min，用40 txL無菌水重懸，加入10μL 5×蛋白上樣緩沖液后煮沸10 min，12000 rpm離心10 min，取10μL樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，分析目的蛋白的表達水平。

二、結(jié)果與分析

（一）目的基因的驗證

如圖2-1所示，對空載的質(zhì)粒pET21a和含有普魯蘭酶（pulA）的重組質(zhì)粒pET21a-TT進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以看到pET21a-TT因為質(zhì)量分?jǐn)?shù)較大所以其條帶遷移距離相對于空載質(zhì)粒更短，且提取的質(zhì)粒線性條帶位置符合理論值，用軟件DNAman對測序結(jié)果的序列進行比對，比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，測序結(jié)果顯示序列是完全正確的。說明含有目的基因的重組質(zhì)粒經(jīng)過驗證可以繼續(xù)進行實驗。

（二）重組質(zhì)粒的構(gòu)建

如圖2-2所示，基因的條帶遷移距離相對于Marker條帶的位置符合其序列長度，目的條帶切膠回收后測序結(jié)果正確。證明已經(jīng)成功的擴增出含有雙酶切位點的線性普魯蘭酶基因。如圖2-3所示，基因和載體雙酶切之后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的pulA基因大小是2556 bp，載體大小是9004 bp，對照marker條帶的結(jié)果，基因條帶位置與預(yù)期結(jié)果基本相同，證明基因和載體在大小上基本正確，可以進行下一步酶連。

（三）重組酵母菌的構(gòu)建與驗證

將含有正確重組質(zhì)粒的大腸桿菌進行大量的質(zhì)粒抽提，使用SacI線性化后電轉(zhuǎn)入畢赤酵母，涂布MD平板，30～C放置2～3d長出轉(zhuǎn)化子。對其中的高拷貝陽性轉(zhuǎn)化子進行了篩選，挑取能在2 g/L濃度的G418 YPD平板上生長的單菌落進行菌落PCR。菌落PCR電泳結(jié)果如圖2-4所示，可以看出擴增出了目的基因條帶，而且在2.1 kb處有明顯的甲醇利用快速型（Mut+）的特異性條帶醇氧化酶1的基因（aoxl）。

（四）誘導(dǎo)表達結(jié)果的分析

如圖2-5所示，在甲醇誘導(dǎo)過的SDS-PAGE電泳圖中可以觀察到誘導(dǎo)時間為48 h的時候隱約出現(xiàn)一條微弱的條帶，條帶所處的位置對應(yīng)marker的條帶位置符合目的蛋白分子量，大小是109kDa。說明在該位置出現(xiàn)的可能是本實驗中的目的蛋白，目的基因在GS115中得到了表達。從左至右1～5，6～10依次為每隔24h取得的樣品。

三、結(jié)論與討論

本實驗驗證了基因和載體序列的正確性，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒，對其進行線性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母，獲得的轉(zhuǎn)化子進行鑒定并測序，確認(rèn)該基因序列正確，成功篩選到陽性轉(zhuǎn)化子。對畢赤酵母進行普魯蘭酶的誘導(dǎo)表達，采用考馬斯亮藍(lán)法對不同時期的菌液蛋白質(zhì)含量進行SDS-PAGE分析，實驗確定目的蛋白的大小理論值在109 kDa左右。

通過SDS-PAGE分析的結(jié)果來看，曾嘗試加大點樣量反復(fù)進行實驗，結(jié)果仍顯示條帶微弱，蛋白質(zhì)表達量不高，分析可能是由于Pichia pastoris存在的密碼子偏好性。不同種生物對于密碼子的偏好存在區(qū)別。我們的目的基因與Pichia pastoris對于密碼子偏愛性存在著一定的差異。對于Pichia pastoris而言，有25個是其偏愛的密碼子。若本實驗所需要的目的蛋白用到Pichiapastoris中的大量稀有密碼子，可能會對翻譯過程的順利進行產(chǎn)生影響，導(dǎo)致相應(yīng)的tRNA不足以合成本實驗中的目的蛋白?？蓢L試解決的方案為：對密碼子進行優(yōu)化，將基因進行重新設(shè)計，過程中盡量使氨基酸組成與原來的氨基酸組成相同，通過把編碼外源基因的密碼子優(yōu)化為Piehiapastoris偏愛的密碼子使蛋白表達量增加;選用pPIC9K作為表達載體，嘗試將目的基因進行胞外表達。