楊承霖，吳聰明，王爽，林居純*

四川省食品動物源大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs菌株CTX–M基因的分子流行特征

楊承霖1，吳聰明2，王爽1，林居純1*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

2010—2016年，從四川省不同養(yǎng)殖場的食品動物源(豬源、雞源)中分離和純化并最終獲得123株大腸埃希菌產(chǎn)超廣譜β–內(nèi)酰胺酶(ESBL–EC)菌株，采用PCR法，并通過測序檢測其CTX–M基因，采用脈沖場凝膠電泳法(PFGE)分析33株不同來源菌株的親緣關(guān)系。結(jié)果顯示：123株菌株中CTX–M檢出率高達(dá)91.9%(113/123)，其中以CTX–M–55和CTX–M–65基因型為主；CTX–M流行率呈逐年上升的趨勢；不同動物源菌株中CTX–M流行情況不同；12株菌中CTX–M基因發(fā)生了9種類型的突變，其中有10株菌為有義突變，導(dǎo)致7種類型氨基酸被取代；33株不同來源菌株共有32種PFGE型?？梢?，四川省食品動物源產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌中CTX–M基因型復(fù)雜且存在變異，在不同遺傳背景的ESBL–EC菌株間廣泛流行。

豬；雞；食品動物源；大腸埃希菌；β–內(nèi)酰胺酶；CTX–M；分子流行特征；四川

自2000年以來，CTX–M型超廣譜β–內(nèi)酰胺酶(ESBLs)在世界各地均有報道。尤其在發(fā)展中國家，由于抗生素濫用和較低衛(wèi)生防疫水平，導(dǎo)致包括CTX–M在內(nèi)的多重耐藥基因在人、動物和環(huán)境中廣泛傳播，給公共衛(wèi)生安全帶來威脅[1]。近年來，CTX–M型已取代TEM和SHV，成為最流行的ESBLs，CTX–M型以對頭孢噻肟高水平耐藥為主要表型特征[2]。由于CTX–M基因極易發(fā)生突變，已報道的CTX–M已超過150種亞型，分屬于6群(CTX–M–1、CTX–M–2、CTX–M–8、CTX–M–9、CTX–M–25和KLUC)[3]。CTX–M基因通常位于可移動質(zhì)粒上，而這些質(zhì)?？膳c耐四環(huán)素類、氨基糖苷類、氯霉素類、磺胺–甲氧芐啶耐藥基因發(fā)生共轉(zhuǎn)移，使用以上任何1種抗生素都可誘導(dǎo)和篩選出CTX–M菌株[4-5]。CTX–M可借助插入序列、轉(zhuǎn)座子、整合子等多種可移動基因元件，如IS可在質(zhì)粒間、質(zhì)粒與染色體間轉(zhuǎn)移，也可在不同菌株和菌種間進(jìn)行水平傳播[6]。

食品動物與人類有密不可分的聯(lián)系，耐藥細(xì)菌可通過人與動物直接接觸或食物鏈完成耐藥基因從動物到人類轉(zhuǎn)移，對人類健康造成威脅[1]。大腸埃希菌作為動物體內(nèi)常見共生菌和致病菌，承受著多種抗菌藥物的誘導(dǎo)及選擇壓力，形成了嚴(yán)重的耐藥性，某些菌株甚至對所有的抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性。在抗生素持續(xù)誘導(dǎo)和選擇壓力下，導(dǎo)致了CTX–M基因突變，也出現(xiàn)了一些新的流行類型，如在中國CTX–M–55已經(jīng)超過CTX–M–15，成為僅次于CTX–M–14的流行類型，該酶對頭孢他定具有高水解活性。而CTX–M–65型在中國動物源菌株中快速傳播[7]。目前，對于CTX–M的流行特征研究主要集中在醫(yī)學(xué)臨床分離菌株，而食品動物源菌株相關(guān)報道較少，尤其有關(guān)四川省產(chǎn)CTX–M菌株及其基因型流行特征和擴(kuò)散演化變遷的研究鮮有報道。本研究中，以四川省豬、雞源產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌為研究對象，分析CTX–M基因在不同來源菌株中的分子流行特征，旨在為科學(xué)應(yīng)對食品動物源菌株產(chǎn)CTX–M在四川省的流行提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　菌株來源

2010—2016年，從四川省不同養(yǎng)殖場分離和純化444株大腸埃希菌臨床菌株。經(jīng)雙紙片確認(rèn)試驗(yàn)，獲得123株產(chǎn)ESBLs菌株，其中雞源菌95株，豬源菌28株。

1.2　blaCTX–M基因檢測

使用OMEGA小量質(zhì)粒提取試劑盒，提取123株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌質(zhì)粒DNA，并以此為模板，對其進(jìn)行不同群CTX–MPCR擴(kuò)增[8-10]。PCR引物序列及擴(kuò)增條件見表1。將獲得的目的片段送往上海英駿生物技術(shù)有限公司(北京)進(jìn)行雙向測序，測序結(jié)果通過GenBank進(jìn)行比對分析。

表1　blaCTX–M基因PCR引物及擴(kuò)增條件

1.3　親緣關(guān)系鑒定

采用脈沖場凝膠電泳(PFGE)對挑選的33株不同來源、攜帶CTX–M的菌株進(jìn)行分子分型[11]，以確定這些菌株的遺傳相關(guān)性或差異性，從而了解CTX–M在菌株間的擴(kuò)散是垂直還是水平傳播。

2　結(jié)果與分析

2.1　不同來源菌株blaCTX–M的流行特點(diǎn)

從123株ESBLs大腸埃希菌中檢出CTX–M113株(檢出率91.9%)，其中CTX–M–1群83株(73.5%)，CTX–M–9群30株(26.5%)，CTX–M–2、CTX–M–8/25群尚未檢出。測序結(jié)果顯示，CTX–M–1群以CTX–M–55為主(44/113)，其次是CTX–M–65(23/113)、CTX–M–15(8/113)和CTX–M–123(8/113)；CTX–M–9群以CTX–M–14為主(20/113)，其次是CTX–M–24(6/113)和CTX–M–121(4/113)。

從表2可知，CTX–M檢出率呈逐年上升的趨勢，2013—2016年，分離菌株檢出的CTX–M基因型逐年增多。如圖1所示，豬源和雞源菌均是CTX–M–55檢出率最高，其余基因型檢出率呈菌株來源性差異，雞源菌比豬源菌檢出更復(fù)雜的基因型。

表2　2010—2016年blaCTX–M基因型的檢測結(jié)果

圖1　豬和雞源菌株blaCTX–M基因型的檢測結(jié)果

2.2　不同blaCTX–M基因的突變特點(diǎn)

將113株菌株擴(kuò)增獲得的CTX–M測序結(jié)果與GenBank收錄序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)其中12株菌攜帶的4種CTX–M基因發(fā)生了9種突變，其中10株發(fā)生了有義突變，導(dǎo)致7種氨基酸被取代(表3)。

表3　不同菌株blaCTX–M基因的突變及氨基酸取代特征

2.3　blaCTX–M陽性菌株的PFGE分型結(jié)果

所選取的33株不同時間、不同動物源菌株共產(chǎn)生32種不同PFGE譜型，即便是攜帶相同CTX–M基因型菌株，但其PFGE譜型也不相同，這說明檢測到的CTX–M陽性菌不存在克隆關(guān)系，遺傳背景具有多樣性(圖2)。

圖2　33株blaCTX–M菌株的PFGE聚類分析結(jié)果

3　討論與結(jié)論

本研究中，在123株ESBLs動物源大腸埃希菌中檢出113株攜帶CTX–M，檢出率達(dá)91.9%，與其他報道[12–14]的CTX–M檢出率84.8%~94.6%相符，說明食品動物源大腸埃希菌是CTX–M主要宿主菌，該類基因在產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌中已獲得穩(wěn)固傳播能力。本研究檢出的CTX–M主要分屬于CTX–M–1群(73.5%)和CTX–M–9群(26.5%)，其中CTX–M–55(44/113)、CTX–M–65(23/113)和CTX–M–14(20/113)檢出率較高，為優(yōu)勢基因型，CTX–M–15、CTX–M–123、CTX–M–24也有檢出?？梢姡谒拇ㄊ∈称穭游镌吹姆蛛x菌株中，檢出的CTX–M–55、CTX–M–65基因型已經(jīng)超過了CTX–M–14，尤其是CTX–M–65基因，作為CTX–M–14的突變體，具有水解頭孢噻肟、頭孢曲松的能力，而且該基因常常與其他耐藥基因，如KPC–2、NDM–5、、SHV和共同存在于同一質(zhì)粒，呈多重耐藥性，這給耐藥性防控和臨床感染治療帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[15]，故獸醫(yī)臨床上對新型CTX–M基因流行、對其介導(dǎo)耐藥性及耐藥機(jī)制的研究應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)。

自2000年后CTX–M型ESBLs流行逐年上升。RAO等[7]對分離自2003—2012年間中國食品動物源產(chǎn)CTX–M大腸埃希菌動態(tài)監(jiān)測結(jié)果顯示，產(chǎn)CTX–M菌株從2003—2005年的5.7%顯著上升到2009—2012年的35.3%。本研究結(jié)果也顯示，2010—2016年，CTX–M流行逐年上升，且基因型更加復(fù)雜。CTX–M流行特點(diǎn)除與菌株分離時間有關(guān)外，還與菌株分離自不同動物有關(guān)。本研究中，除CTX–M–55在不同動物源檢出率均較高外，雞源菌比豬源菌檢出更復(fù)雜的基因型。這可能與養(yǎng)雞場使用抗菌藥物種類較多且交叉或輪換使用藥物更頻繁有關(guān)。

對CTX–M基因遺傳結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，CTX–M型ESBLs的種類以驚人的速度發(fā)生變化。已報道的CTX–M亞型已超過150種[6]，這些亞型的產(chǎn)生，是在藥物選擇壓力下，同源基因發(fā)生變異并逐漸累積的結(jié)果，導(dǎo)致各亞型間水解活性也不盡相同。而基因發(fā)生變異多發(fā)生于CTX–M–1群和CTX–M–9群間，可能是這2個基因群具有更高的可塑性，能為基因進(jìn)化提供更多機(jī)會[16–17]。本研究中的113株CTX–M測序的結(jié)果表明，屬于CTX–M–1群的CTX–M–15、CTX–M–123、CTX–M–65和CTX–M–9群的CTX–M–14共4種亞型基因發(fā)生了突變，導(dǎo)致7種氨基酸被取代。這些位點(diǎn)氨基酸被取代對酶水解活性的影響有待進(jìn)一步研究。

盡管克隆株介導(dǎo)的垂直傳播對CTX–M流行起到了一定作用，但不同遺傳元件(結(jié)合型質(zhì)粒、插入序列、轉(zhuǎn)座子和整合子等)參與的傳播，在CTX–M基因傳播和表達(dá)中起到了更重要作用。從33株不同來源CTX–M菌株P(guān)FGE分型發(fā)現(xiàn)，除2株菌具有高度遺傳相似度外，其余菌株間親緣關(guān)系遠(yuǎn)，未發(fā)現(xiàn)四川地區(qū)優(yōu)勢克隆株。這也間接說明，CTX–M在本次研究的菌株中被廣泛檢出，可能存在質(zhì)粒等可移動基因元件參與的水平傳播。

CTX–M酶流行廣泛，具有較強(qiáng)的水平傳播能力，在四川省食源動物中檢出率高，且其亞型逐漸多樣化，水解底物種類逐漸增多，故需要重新審視β–內(nèi)酰胺類抗菌藥在獸醫(yī)臨床及畜牧業(yè)中的使用，特別是在禽類養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)禁止某些不規(guī)范使用藥物的現(xiàn)象，如作為飼料添加劑使用、盲目用藥及超量使用等，同時加強(qiáng)對大腸埃希菌CTX–M酶流行的監(jiān)測，以控制其進(jìn)一步發(fā)展。

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Molecular epidemiologic characteristics ofCTX-Mgenes of ESBLs-producingisolates from food animals in Sichuan province

YANG Chenglin1, WU Congming2, WANG Shuang1, LIN Juchun1*

(1.College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Chengdu, Sichuan 611130, China; 2.College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China)

123 extended-spectrum β-lactamase-producing(ESBL-EC) were isolated and collected from food-producing animals(swine and chicken) of different farms in Sichuan province from 2010 to 2016. PCR and DNA sequencing were performed to detectionCTX-Mgenes. Pulsed-field gel electrophoresis(PFGE) was used for molecular typing of 33 isolates of the 123 isolates with different sources. The results showed that prevalence ofCTX-Mwas 91.9%(113/123) in ESBL-EC isolates, among whichCTX-M-55andCTX-M-65were the dominant genotypes. The occurrence ofCTX-Mwas increasing yearly;CTX-Mvariants were observed in isolates from chicken and swine; 9 types of mutations ofCTX-Mgenes were found in 12 isolates, in which 10 were sense mutations, which made 7 types of amino acid substitutions; 33 isolates were classified into 32 types by PFGE. In sumary,CTX-Mgenotypes were mutated, and had spread widely among different molecular types of ESBL-EC isolates from food animals in Sichuan province.

swine; chicken; food animal;;β-lactamases;CTX-M; molecular epidemiologic characteristics; Sichuan

S852.61

A

1007-1032(2020)04-0456-05

10.13331/j.cnki.jhau.2020.04.012

楊承霖，吳聰明，王爽，林居純．四川省食品動物源大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs菌株CTX–M基因的分子流行特征[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2020，46(4)：456–460．

YANG C L, WU C M, WANG S, LIN J C. Molecular epidemiologic characteristics ofCTX-Mgenes of ESBLs-producingisolates from food animals in Sichuan province[J]. Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences), 2020, 46(4): 456–460.

http://xb.hunau.edu.cn

2019–09–26

2020–01–22

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃專項(xiàng)(2018YFD0500300)

楊承霖(1993—)，男，碩士，主要從事細(xì)菌耐藥性研究，377396380@qq.com；

，林居純，教授，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)研究，juchunlin@126.com

責(zé)任編輯：鄒慧玲

英文編輯：柳正