背景熒光猝滅-免疫層析法定量檢測(cè)唾液中的安非他明

郭 暢，周 浩，許 芳，李新霞，李久彤，，李建光*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.上海鑫譜生物科技有限公司，上海 201318)

安非他明(Amphetamine,AMP)即苯丙胺，又稱苯基乙丙胺、α-甲基苯乙胺，分子式為C9H13N，游離態(tài)AMP為無色或淡黃色揮發(fā)性油狀物，味酸苦且?guī)в邪烦簦Ｒ娭苿槠淞蛩猁}或磷酸鹽[1]。AMP類藥物最初用于治療嗜睡癥、帕金森氏綜合征、早發(fā)性癡呆和器質(zhì)性精神病等，但由于其對(duì)機(jī)體造成的不可逆損傷，如興奮毒性、氧化應(yīng)激和代謝紊亂等，而被列為毒品[2-3]?！?019年世界毒品報(bào)告》[4]顯示，全世界大約有2 900萬人正在使用AMP類藥物，其中，歐洲約有290萬人使用過AMP。2018年，歐洲廢水分析結(jié)果顯示，AMP的人均使用量是冰毒的2.6倍。

目前，檢測(cè)AMP類藥物主要采用氣相色譜法(GC)[5]、高效液相色譜法(HPLC)[6]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[7]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(UPLC-MS/MS)[8]、毛細(xì)管電泳法(CE)[9]、酶聯(lián)免疫分析法(EIA)[10]和熒光偏振免疫分析法(FPIA)[11]。相較于檢測(cè)時(shí)程長且消耗大量有機(jī)試劑的色譜法，免疫分析法因其高特異性、高靈敏度、快速等優(yōu)點(diǎn)近年來在毒品濫用監(jiān)測(cè)方面得到廣泛研究。

作者采用膠體金標(biāo)記技術(shù)[12-14]，將單克隆抗體AMP-mAb標(biāo)記到膠體金上，制備金標(biāo)探針；再將AMP完全抗原AMP-BSA和羊抗鼠抗體IgG 依次包被到膜面熒光硝酸纖維素(NC)膜的檢測(cè)線和控制線上，與金標(biāo)探針等組裝制備試紙條；結(jié)合全自動(dòng)干式熒光免疫分析儀創(chuàng)建背景熒光猝滅-免疫層析法，對(duì)唾液中AMP進(jìn)行快速定量檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

HF 13502S20型硝酸纖維素膜，Millipore公司；SI31-40型聚氯乙烯(PVC)膠板，韓感中國；吸水紙，上海捷寧生物科技有限公司；Fusion 5型樣品墊，Whatman公司；KB50型玻纖,上海良值科技公司。

AMP標(biāo)準(zhǔn)品，Cerilliant公司；AMP抗體和抗原試劑，杭州隆基生物科技公司；小分子封閉劑DB1130，Blockmaster公司；碳酸鉀、檸檬酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、硫氰酸鉀(KSCN)、磷酸氫二鉀、尿素(NH2CONH2)、十水硫酸鈉、氯化銨、二水氯化鈣、碳酸氫鈉、氯金酸，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

Simp 4型全自動(dòng)干式熒光免疫分析儀，上海鑫譜生物科技有限公司；VELOCITY 14R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司；BSM-220.4型電子天平，上海卓精電子科技有限公司；MS-H280-Pro型數(shù)顯加熱型磁力攪拌器、MX-F型振蕩器，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；L6S型紫外可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；Tecnai G2S-TWIN型透射電子顯微鏡，美國FEI公司；C6型切條機(jī)、T-DOA型臺(tái)式點(diǎn)膜噴金一體機(jī)，韓感中國。

1.2 人工唾液的配制

取NaCl 0.126 g、KCl 0.964 g、KSCN 0.189 g、KH2PO40.654 g、NH2CONH20.200 g、Na2SO4·10H2O 0.763 g、NH4Cl 0.178 g、CaCl2·2H2O 0.228 g、NaHCO30.630 g，加入去離子水并定容至1 000 mL，用鹽酸調(diào)pH值至6.8，混勻，即得人工唾液。

1.3 AMP系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將1 mg·mL-1AMP標(biāo)準(zhǔn)溶液用人工唾液稀釋成濃度(ng·mL-1)分別為0、10、25、50、100、200、400的AMP系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 膠體金的制備與表征

采用檸檬酸鈉還原法[15]制備膠體金。取198 mL純化水，加入2 mL 1%HAuCl4溶液，混勻后置于磁力攪拌器上加熱至沸騰；然后快速加入5 mL 1%檸檬酸鈉水溶液，繼續(xù)加熱至溶液呈酒紅色；持續(xù)煮沸20 min后攪拌冷卻至室溫，即得膠體金。

利用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定膠體金的紫外可見吸收光譜，利用透射電子顯微鏡觀察膠體金粒徑大小。

1.5 金標(biāo)探針的制備

取1 mL膠體金溶液，加入5 μL 0.1 mol·L-1K2CO3溶液、5 μg 單克隆抗體AMP-mAb，混勻后加入10 μL 10%的小分子封閉劑DB1130，充分混勻后于4 ℃、12 000 r·min-1離心12 min，棄去上清液，沉淀用純水定容至200 μL，即得金標(biāo)探針，即金標(biāo)AMP-mAb 溶液，4 ℃儲(chǔ)存，備用。

1.6 試紙條的制備及結(jié)果判讀

試紙條包括PVC膠板、樣品墊、鋪金墊、膜面熒光硝酸纖維素(NC)膜和吸水墊等5部分，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 試紙條的結(jié)構(gòu)

制備：將NC膜貼到PVC板中間，用臺(tái)式點(diǎn)膜噴金一體機(jī)先將1 mg·mL-1的AMP完全抗原AMP-BSA和0.5 mg·mL-1的羊抗鼠抗體IgG先后包被在NC膜的檢測(cè)線(T線)和控制線(C線)處；再將金標(biāo)探針包被在玻纖材料上，置于37 ℃烘箱內(nèi)干燥4 h后取出；將鋪金墊、樣品墊和吸水墊依次貼于NC 膜的兩端，相互重疊1.0 mm；用切條機(jī)切割成3.4 mm寬，并與干燥劑一起放入鋁箔袋中，密封，備用。

結(jié)果判讀：取待測(cè)樣品溶液60 μL，滴加至試紙條的樣品墊上，此時(shí)樣品溶液會(huì)因毛細(xì)作用沿試紙條向前移動(dòng)。當(dāng)樣品溶液中沒有目標(biāo)毒品AMP時(shí)(圖1b)，溶液流經(jīng)鋪金墊后會(huì)溶解事先固定好的金標(biāo)探針，隨后金標(biāo)探針會(huì)和T線上的AMP-BSA結(jié)合而顯現(xiàn)膠體金的紫紅色；剩余的探針繼續(xù)向前移動(dòng)，被C 線的二抗捕獲，C線也出現(xiàn)紫紅色條帶；當(dāng)樣品溶液中含有AMP時(shí)(圖1a)，部分金標(biāo)探針會(huì)因優(yōu)先與樣品溶液中的AMP結(jié)合而不停留在T線上，T線顏色將變淺或消失。無論樣品中是否含有AMP，C線都應(yīng)該出現(xiàn)紫紅色，否則該試紙條結(jié)果判定為無效。

1.7 背景熒光猝滅-免疫層析法的構(gòu)建

在制備了AMP層析試紙條后，結(jié)合全自動(dòng)干式熒光免疫分析儀創(chuàng)建背景熒光猝滅-免疫層析法檢測(cè)唾液中的AMP。按1.6方法操作，室溫層析5 min后，將試紙條插入全自動(dòng)干式熒光免疫分析儀，掃描結(jié)束后自行記錄F0(背景熒光強(qiáng)度)和F1(T 線熒光強(qiáng)度)及F0/F1值(T 線的熒光猝滅信號(hào))。

1.8 背景熒光猝滅-免疫層析法的條件優(yōu)化

1.8.1 試紙條的AMP-BSA最佳包被濃度

在試紙條的T 線上分別包被0.75 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1和2.0 mg·mL-1的AMP-BSA，C線上包被0.5 mg·mL-1的羊抗鼠抗體IgG。按1.6方法操作，測(cè)定F0/F1值，篩選AMP-BSA的最佳包被濃度。

1.8.2 金標(biāo)探針的K2CO3最佳加量

取1 mL膠體金溶液4份，分別加入4 μL、5 μL、6 μL、7 μL 0.1 mol·L-1K2CO3溶液，再向各管加入5 μg AMP-mAb，混勻后加入10 μL 10%的小分子封閉劑 DB1130，充分混勻后于4 ℃、12 000 r·min-1離心12 min，觀察各管顏色。以膠體金全部沉于底部且無膠體金貼壁現(xiàn)象發(fā)生時(shí)的K2CO3加量為最佳。

1.8.3 金標(biāo)探針的AMP-mAb最佳加量

取1 mL膠體金溶液3份，加入5 μL 0.1 mol·L-1K2CO3溶液，再分別加入3 μg、5 μg、7 μg的AMP-mAb，按1.6方法操作，測(cè)定F0/F1值，篩選AMP-mAb的最佳加量。

1.9 背景熒光猝滅-免疫層析法的性能評(píng)價(jià)

以人工唾液為建標(biāo)基質(zhì)，配制AMP系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1.6方法操作，采用背景熒光猝滅-免疫層析法測(cè)定AMP系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的F0/F1值。以AMP濃度(ng·mL-1)為橫坐標(biāo)、有效試紙條上F0/F1值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，運(yùn)用 Origin 8.6軟件進(jìn)行擬合，得到AMP的擬合方程及相關(guān)系數(shù)。

對(duì)背景熒光猝滅-免疫層析法進(jìn)行方法學(xué)考察，如重復(fù)性、檢出限、加標(biāo)回收率及特異性等，并與UPLC-MS/MS法進(jìn)行比對(duì)，分析兩種方法的相關(guān)性和一致性。

2 結(jié)果與討論

2.1 膠體金的表征

膠體金的紫外可見吸收光譜與TEM照片如圖2所示。

從圖2可知，膠體金的最大吸收峰位于520 nm處，吸光度為0.9(圖2a)；膠體金顆粒呈規(guī)整的圓形，粒徑在22 nm左右(圖2b)。

圖2 膠體金的紫外可見吸收光譜(a)與TEM照片(b)

2.2 背景熒光猝滅-免疫層析法的條件

2.2.1 試紙條的AMP-BSA最佳包被濃度

不同AMP-BSA包被濃度對(duì)應(yīng)F0/F1值與AMP濃度的關(guān)系曲線如圖3 所示。

圖3 不同AMP-BSA包被濃度對(duì)應(yīng)F0/F1值與AMP濃度的關(guān)系曲線

從圖3可知，當(dāng)AMP-BSA包被濃度為 0.75 mg·mL-1時(shí)，F(xiàn)0/F1值與AMP濃度的變化關(guān)系不明顯；當(dāng)AMP-BSA包被濃度為1.5 mg·mL-1時(shí)，陰性和10 ng·mL-1AMP的F0/F1值區(qū)別不大；當(dāng)AMP-BSA包被濃度為1.0 mg·mL-1時(shí)，F(xiàn)0/F1值與AMP濃度的變化關(guān)系最明顯，且低濃度AMP的F0/F1值差異較AMP-BSA包被濃度為2.0 mg·mL-1時(shí)更顯著。因此，確定最佳AMP-BSA包被濃度為1.0 mg·mL-1。

2.2.2 金標(biāo)探針的K2CO3最佳加量

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)K2CO3加量為4 μL時(shí)，離心后有部分膠體金貼壁，且棄去上清液后，貼壁膠體金不能完全復(fù)溶于純水中；當(dāng)K2CO3加量為5 μL、6 μL和7 μL時(shí)，離心后的膠體金全部均勻沉淀在試管底部，無貼壁現(xiàn)象，且上層溶液干凈、透亮。因此，確定金標(biāo)探針的K2CO3最佳加量為5 μL。

2.2.3 金標(biāo)探針的AMP-mAb最佳加量

不同AMP-mAb加量對(duì)應(yīng)F0/F1值與AMP濃度的關(guān)系曲線如圖4 所示。

圖4 不同AMP-mAb加量對(duì)應(yīng)F0/F1值與AMP濃度的關(guān)系曲線

從圖4可知，當(dāng)AMP-mAb加量為5 μg時(shí)，不同濃度AMP的F0/F1值差異最顯著，且每個(gè)濃度點(diǎn)的兩次測(cè)量結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定。因此，AMP-mAb最佳加量為5 μg，即每標(biāo)記1 mL膠體金溶液加入5 μg AMP-mAb。

2.3 背景熒光猝滅-免疫層析法的性能評(píng)價(jià)

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

AMP的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示。

圖5 AMP的標(biāo)準(zhǔn)曲線

用Logistic模型(四參數(shù))對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行擬合，得到方程y=A2+(A1-A2)/[1+(x/x0)P]，R=0.9993，其中，A1=5.64403，A2=0.95357，x0=36.634，P=1.04805。表明，AMP濃度在0～400 ng·mL-1范圍內(nèi)與F0/F1值呈良好的相關(guān)性。

不同濃度AMP層析試紙條檢測(cè)結(jié)果如圖6所示。

1～7，AMP濃度(ng·mL-1)：0、10、25、50、100、200、400

2.3.2 重復(fù)性

按1.6方法操作，用背景熒光猝滅-免疫層析法測(cè)定10 ng·mL-1和 50 ng·mL-1AMP溶液各10次，F(xiàn)0/F1平均值分別為5.0129±0.0913、3.0485±0.1333，測(cè)得濃度分別為(7.28±0.89)ng·mL-1、(46.31±5.16)ng·mL-1，RSD 分別為12.23%、11.14%。表明，背景熒光猝滅-免疫層析法的重復(fù)性較好。

2.3.3 檢出限

取空白試樣，按1.6方法操作，用背景熒光猝滅-免疫層析法連續(xù)測(cè)定10次，F(xiàn)0/F1平均值為5.910 5，標(biāo)準(zhǔn)差(sd)為0.129 3，計(jì)算得到m-2sd，將其代入回歸方程得到對(duì)應(yīng)的濃度值，即為檢出限0.9 ng·mL-1。

2.3.4 加標(biāo)回收率

取500 ng·mL-1和1 000 ng·mL-1的AMP溶液各100 μL，分別加入到1 mL濃度為25 ng·mL-1的AMP 溶液中，混勻后記為樣品1和樣品2；取500 ng·mL-1和1 000 ng·mL-1的AMP溶液各100 μL，再分別加入到1 mL濃度為100 ng·mL-1的AMP溶液中，混勻后記為樣品3和樣品4。按1.6方法操作，用背景熒光猝滅-免疫層析法對(duì)4個(gè)樣品溶液重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表1。

從表1可知，4 個(gè)樣品溶液用背景熒光猝滅-免疫層析法測(cè)定的加標(biāo)回收率在86.66%～99.50%之間，均在85%～115% 之間。表明，用背景熒光猝滅-免疫層析法測(cè)定的加標(biāo)回收率較好。

表1 加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.3.5 特異性

分別取 5 mg·mL-1蔗糖，50 ng·mL-1的NaHCO3、薄荷醇和阿司匹林，非目標(biāo)毒品1 000 ng·mL-1的可卡因、嗎啡、美沙酮和氯胺酮，100 ng·mL-1的可替寧和芬太尼溶液，按1.6方法操作，重復(fù)測(cè)定3 次，檢測(cè)背景熒光猝滅-免疫層析法的特異性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10 種藥品和非目標(biāo)毒品對(duì)背景熒光猝滅-免疫層析法的檢測(cè)無干擾。

2.3.6 比對(duì)實(shí)驗(yàn)

分別采用背景熒光猝滅-免疫層析法與UPLC-MS/MS法同時(shí)檢測(cè)15例樣本，運(yùn)用SSPS 22.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)。結(jié)果顯示：t=0.969，P=0.349>0.05，表明背景熒光猝滅-免疫層析法與UPLC-MS/MS法無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

以背景熒光猝滅-免疫層析法檢測(cè)結(jié)果(x)為橫坐標(biāo)、UPLC-MS/MS 法檢測(cè)結(jié)果(y)為縱坐標(biāo)繪制關(guān)系曲線,如圖7所示。

圖7 兩種方法檢測(cè)AMP系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的直線相關(guān)性

對(duì)圖7進(jìn)行擬合，得到一元直線回歸方程y=0.91x+9.24，R=0.995>0.9，表明兩種方法相關(guān)性良好。

2.4 討論

近年來，免疫分析法在毒品濫用監(jiān)測(cè)、食品檢測(cè)[16]及疾病體外診斷[17]等方面得到廣泛研究。張喜芳[18]研制的膠體金檢測(cè)試劑能對(duì)尿液中的AMP進(jìn)行定性檢測(cè)。相比較而言，背景熒光猝滅-免疫層析法定量檢測(cè)AMP靈敏度高、專屬性強(qiáng)、檢測(cè)范圍較廣，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確且重復(fù)性好，檢測(cè)過程所需樣本量少，所用試劑安全、無毒且環(huán)保，可在5 min內(nèi)快速準(zhǔn)確檢測(cè)唾液中的AMP，打破了傳統(tǒng)免疫層析試紙條只能對(duì)生物樣本中的濫用藥物進(jìn)行定性檢測(cè)的局限，有望成為法庭供述的依據(jù)。

3 結(jié)論

創(chuàng)建了背景熒光猝滅-免疫層析法定量檢測(cè)唾液中的AMP。AMP濃度在0～400 ng·mL-1范圍內(nèi)與熒光猝滅信號(hào)呈良好的相關(guān)性，檢出限為0.9 ng·mL-1，加標(biāo)回收率為86.66%～99.50%，重復(fù)性RSD<13%，10 種常見毒品和藥品均對(duì)檢測(cè)結(jié)果無干擾，與UPLC-MS/MS法檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性良好。背景熒光猝滅-免疫層析法可以快速定量檢測(cè)唾液中的 AMP，具有良好的相關(guān)性、精密度和準(zhǔn)確性，操作簡便，成本低且儀器便于攜帶，適于快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和基層推廣。