謝海偉 馮嘉琪 付曉晴 江坤生 陳佳茹

摘要：植物內(nèi)生真菌廣泛存在于藥用植物體內(nèi)，具有豐富的生物多樣性，對(duì)寄主植物有著積極的作用，內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物有著抗腫瘤、抗氧化、抗菌等活性，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品等行業(yè)有著巨大的應(yīng)用前景。本文綜述了近年來(lái)藥用植物內(nèi)生真菌的研究進(jìn)展，在藥用植物內(nèi)生真菌的分離篩選技術(shù)、檢測(cè)方法、鑒定技術(shù)等方面進(jìn)行闡述，在藥用植物內(nèi)生真菌的種屬多樣性、代謝產(chǎn)物生物多樣性方面進(jìn)行分析;對(duì)藥用植物內(nèi)生真菌在醫(yī)藥行業(yè)和農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用等進(jìn)行總結(jié)，并對(duì)現(xiàn)今藥用植物內(nèi)生真菌的相關(guān)研究存在的問(wèn)題進(jìn)行分析，并對(duì)內(nèi)生真菌的未來(lái)應(yīng)用提出展望。

關(guān)鍵詞：藥用植物;內(nèi)生真菌;分離篩選;多樣性;應(yīng)用

中圖分類(lèi)號(hào)： Q949.95;S182? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2020）14-0001-05

收稿日期：2019-07-24

藥用植物內(nèi)生真菌是天然藥物的重要組成部分，其活性代謝產(chǎn)物豐富多樣，包括各種結(jié)構(gòu)類(lèi)型獨(dú)特、具有潛在應(yīng)用前景的活性物質(zhì)，已成為發(fā)現(xiàn)新高效、新穎、低毒的天然活性物質(zhì)的重要資源。目前發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌的種類(lèi)多達(dá)100萬(wàn)種[1]。目前的主要研究集中于宿主植物與內(nèi)生真菌共生機(jī)制和內(nèi)生真菌天然代謝產(chǎn)物的功能關(guān)系等方面，植物內(nèi)生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有抗氧化性、抑制病原微生物、抗腫瘤、抗蟲(chóng)等功能，能被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護(hù)等方面。近年來(lái)，藥用植物的內(nèi)生菌已成為研究熱點(diǎn)之一，如內(nèi)生真菌天然代謝產(chǎn)物的生物活性、藥用內(nèi)生真菌促進(jìn)新型藥物的開(kāi)發(fā)、藥用植物內(nèi)生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)宿主植物的生長(zhǎng)和抗病蟲(chóng)害機(jī)制等方面的研究。而藥用植物內(nèi)生真菌在藥用、醫(yī)用等方面的作用更為顯著，部分藥用內(nèi)生真菌可以分泌與寄主相同或相似的藥用成分。在藥用植物自然更新慢、有效藥用成分提取率低、人為采取過(guò)度導(dǎo)致生物多樣性降低的背景下，開(kāi)發(fā)藥用內(nèi)生真菌是一個(gè)有效保護(hù)珍稀藥用植物、大規(guī)模開(kāi)發(fā)生產(chǎn)藥用活性成分的途徑。本文以藥用植物內(nèi)生真菌為對(duì)象，就其分離篩選、多樣性、在不同行業(yè)中應(yīng)用及存在的問(wèn)題進(jìn)行分析和闡述。

1 藥用植物內(nèi)生真菌篩選

藥用植物內(nèi)生真菌分離流程包括藥用植物樣本采集，樣本消毒處理，內(nèi)生真菌的分離及培養(yǎng)，內(nèi)生真菌的鑒定，內(nèi)生真菌及代謝產(chǎn)物性能分析。

1.1 藥用植物內(nèi)生真菌篩選預(yù)處理

藥用植物內(nèi)生真菌分離篩選預(yù)處理是控制藥用植物表面的殺菌強(qiáng)度，防止誤殺部分內(nèi)生真菌或者混入表生真菌，影響植物內(nèi)生菌分離效果的操作。根據(jù)植物類(lèi)別及植物組織類(lèi)型，可以采用75%乙醇+次氯酸鈉溶液的表面消毒和75%乙醇+氯化汞2種表面消毒方式。75%乙醇與氯化汞的結(jié)合消毒較徹底，缺點(diǎn)是氯化汞的毒性大并且對(duì)環(huán)境有一定的危害作用。Adeyemi等在研究?jī)?nèi)生真菌篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)，在徹底表面滅菌的前提下，殺菌劑高濃度短時(shí)間處理，藥用植物內(nèi)生真菌的分離效果更顯著[2]。藥用植物內(nèi)生真菌的表面滅菌效果檢測(cè)方法有3種，分別是漂洗液檢驗(yàn)法、組織印跡法和超凈工作臺(tái)無(wú)菌狀態(tài)檢測(cè)對(duì)照法。

1.2 藥用植物內(nèi)生真菌分離篩選

藥用植物內(nèi)生真菌的分離篩選一般是采用組織分離法和研磨涂布法，其中組織分離法的操作工序較為簡(jiǎn)便，因此目前多采用組織分離法。分離藥用植物內(nèi)生真菌的常用培養(yǎng)基有馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）[3]、玉米粉瓊脂（CMA）、麥稈煎液瓊脂（WSA）、麥芽浸出液瓊脂、水瓊脂（WA）、沙氏葡萄糖瓊脂、沙氏麥芽糖瓊脂、以及查氏瓊脂（CAZ）培養(yǎng)基，其中以PDA培養(yǎng)基最為常用。此外在培養(yǎng)基中加入100 μg/mL氨芐青霉素或（和）100 μg/mL硫酸鏈霉素等抗生素可有效抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。分離出的內(nèi)生真菌一般采用PDA培養(yǎng)基純化培養(yǎng)。章苗等采用拮抗試驗(yàn)和體外抗菌測(cè)試方法，利用馬鈴薯葡萄糖雙抗培養(yǎng)基在22 ℃低溫條件培養(yǎng)下從無(wú)患子內(nèi)成功篩選出6株內(nèi)生真菌[3]。藥用植物內(nèi)生真菌的篩選包括內(nèi)生真菌產(chǎn)生長(zhǎng)激素活性物質(zhì)篩選、內(nèi)生菌拮抗病原真菌篩選、抑菌活性篩選、抗腫瘤細(xì)胞活性篩選以及促生特性的篩選等。張亮等對(duì)分離得到的杜仲內(nèi)生真菌進(jìn)行活性篩選，發(fā)現(xiàn)有18個(gè)菌株對(duì)病原真菌具有顯著的拮抗作用[4]。魏練平等從山蒼子葉中分離篩選出2株內(nèi)生真菌，它們對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞有明顯抑制作用[5]。

1.3 藥用植物內(nèi)生真菌的鑒定

藥用植物內(nèi)生真菌的鑒定方法主要有形態(tài)學(xué)鑒定、理化鑒定和分子生物學(xué)鑒定，具體包括[6]：（1）形態(tài)學(xué)鑒定。主要根據(jù)菌株個(gè)體和菌落群體的形態(tài)特征進(jìn)行鑒定，觀察內(nèi)生真菌菌落的形狀、大小、顏色等特征，結(jié)合在光學(xué)顯微鏡或電子掃描電鏡下觀察到的菌株個(gè)體的孢子、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等特征，依據(jù)真菌鑒定手冊(cè)對(duì)其進(jìn)行鑒定。（2）酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（ELISA）法。ELISA技術(shù)因準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)、適用范圍廣、檢測(cè)樣本多、速度快，并且條件要求比較低，方便操作，被廣泛運(yùn)用在藥用內(nèi)生真菌的檢測(cè)分析上。（3）利用次生代謝物間接檢測(cè)。產(chǎn)生次生代謝物是藥用內(nèi)生真菌最重要的特征，也是采用這種方法檢測(cè)內(nèi)生真菌的重要依據(jù)。通過(guò)氣相色譜（GC）、質(zhì)譜方法（MS）以及高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)次生代謝物的含量可間接地檢測(cè)內(nèi)生真菌。這些藥用內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的檢測(cè)方法可間接證明內(nèi)生真菌是否存在。（4）分子檢測(cè)法。可以通過(guò)保守基因測(cè)序進(jìn)行內(nèi)生真菌種類(lèi)鑒定;通過(guò)各種分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行內(nèi)生真菌基因型分析;通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)、基因組測(cè)序技術(shù)，對(duì)內(nèi)生真菌的系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行深入分析，可為尋找內(nèi)生真菌與藥用植物相互作用的基因奠定重要的基礎(chǔ)。

2 藥用植物內(nèi)生真菌多樣性的研究

2.1 內(nèi)生真菌種屬類(lèi)型

近年來(lái)，科學(xué)家從各種藥用植物當(dāng)中分離出來(lái)的內(nèi)生真菌共171屬。植物內(nèi)生真菌豐富多樣，大多數(shù)植物體內(nèi)含有內(nèi)生真菌，且種類(lèi)繁多。在多數(shù)植物中，內(nèi)生真菌分屬于以下幾個(gè)屬，即擬隱孢霉屬、擬莖點(diǎn)霉屬、半殼霉屬、葉點(diǎn)霉屬等。目前研究的植物內(nèi)生真菌絕大多數(shù)屬于子囊菌類(lèi)的核菌綱、腔菌綱和盤(pán)菌綱，無(wú)孢菌群的多類(lèi)真菌和半知菌中的鏈格孢屬、青霉屬、鐮刀菌屬等。

孫璐等從毛序棘豆的根、莖和葉中分離得到的內(nèi)生真菌共有29株，經(jīng)鑒定分屬于4綱、5目、6科、10屬，優(yōu)勢(shì)菌屬是鐮刀菌屬和鏈格孢屬，分布最廣泛的為木霉菌屬[7]。艾洪蓮等從馬鈴薯植株中分離得到44株具有生物活性的內(nèi)生真菌，分屬于21個(gè)屬，分別是毛殼菌屬、籃狀菌屬、曲霉屬、鏈格孢屬、螺旋聚孢霉屬、裂褶菌屬、枝孢屬、單端孢屬、莖點(diǎn)霉屬、離蠕孢屬、殼二孢屬、炭角菌屬、白僵菌屬、鐮孢菌屬、附球菌屬等，其中毛殼菌屬、籃狀菌屬和附球菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬[8]。李盼盼等從傳統(tǒng)藥用植物煙草中共分離得到539株內(nèi)生真菌，經(jīng)過(guò)rDNA-ITS系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定為31屬、73種，其中曲霉屬和鐮孢屬為煙草的優(yōu)勢(shì)菌群[9]。唐青等從艾納香的根、莖和葉中分離得到內(nèi)生真菌共152株，經(jīng)鑒定分屬于11個(gè)屬，分別是鐮刀菌屬、木霉菌屬、脈孢菌屬、間座殼屬、多節(jié)孢屬、曲霉屬、青霉屬、彎孢菌屬、莖點(diǎn)霉屬、煙管霉屬和蠟質(zhì)菌屬，其中鐮刀菌屬、曲霉屬、木霉菌屬和彎孢菌屬為艾納香內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)菌屬[10]。Manganyi采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)研究天竺葵內(nèi)生真菌的生物多樣性，共分離鑒定出真菌133株，其中青霉屬真菌占優(yōu)勢(shì)[11]。

2.2 內(nèi)生真菌組織分布多樣性

藥用植物內(nèi)生真菌的多樣性決定了其次生代謝產(chǎn)物的多樣性。內(nèi)生真菌在藥用植物中存在組織分布差異性。裴梟鑫等從黑果枸杞植株的果、根、莖、葉中分離得到內(nèi)生真菌43株[12]。曹丹丹等從莖直黃芪中分離得到內(nèi)生真菌336株，研究表明，莖直黃芪不同組織部位內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)不同，其中花中的多樣性指數(shù)最高，葉次之，莖最低[13]。劉軍等從檀香中分離到325株檀香內(nèi)生菌，其中根部?jī)?nèi)生真菌的物種多樣性明顯較莖和葉豐富[14]。岳海梅等從西藏砂生槐中分離出77株內(nèi)生真菌，其中莢果中內(nèi)生真菌的分離率最高，且多樣性指數(shù)也最高，而其他部位則差異不明顯[15]。

2.3 內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物多樣性

目前，從植物內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離得到的化合物主要有聚酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、萜類(lèi)和甾類(lèi)等，這些化合物表現(xiàn)出良好的抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗病毒、殺蟲(chóng)等生物活性。內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物具有不同的生物活性、多元的結(jié)構(gòu)特性及多樣的合成途徑等特征。按照化學(xué)結(jié)構(gòu)劃分，藥用植物內(nèi)生真菌的主要代謝產(chǎn)物包括有機(jī)酸、揮發(fā)性物質(zhì)、脂類(lèi)和酶類(lèi)、類(lèi)固醇、多糖類(lèi)和蛋白質(zhì)類(lèi)等初級(jí)代謝產(chǎn)物;還包括生物堿類(lèi)、萜類(lèi)、甾體類(lèi)、黃酮類(lèi)等次級(jí)代謝產(chǎn)物。Elaine等綜述了近年來(lái)藥用植物內(nèi)生真菌微生物分類(lèi)、化合物分類(lèi)和細(xì)胞毒性的研究進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)次生代謝產(chǎn)物主要包括生物堿、萜類(lèi)、甾類(lèi)、聚酮類(lèi)、醌類(lèi)、異香豆素、酯類(lèi)等化合物[16]。Peng等綜述分析了從海藻內(nèi)生真菌中分離得到的182個(gè)天然產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)這些代謝產(chǎn)物具有獨(dú)特化學(xué)多樣性以及相關(guān)的生物活性[17]。Schulz等研究了植物內(nèi)生菌及其生物活性代謝產(chǎn)物與宿主的關(guān)系，從藥用的草本植物中分離得到6 500個(gè)內(nèi)生真菌，對(duì)其進(jìn)行生物活性篩選，根據(jù)不同生物合成途徑其次級(jí)代謝產(chǎn)物可分為異戊二烯、聚酮、氨基酸衍生物[18]。

3 藥用植物內(nèi)生真菌的應(yīng)用

3.1 抗腫瘤方面應(yīng)用

近來(lái)研究表明，從某些有抗腫瘤功能的藥用植物內(nèi)生真菌中提取出的活性物質(zhì)與宿主植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有高度相似性[19]，這打破了只能從天然藥用植物中提取或采用化學(xué)合成等途徑生產(chǎn)藥物的傳統(tǒng)，開(kāi)辟了一條新的抗腫瘤藥物生產(chǎn)路線。程玉鵬等研究表明，產(chǎn)柴胡皂苷內(nèi)生真菌抗腫瘤機(jī)制涉及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性和增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)功能等方面[20]。Li等從紅豆杉中分離得到內(nèi)生真菌紫杉霉（Taxomyces anreanae），紫杉霉產(chǎn)生的紫杉醇或其他紫杉烷類(lèi)化合物對(duì)乳腺癌等多種惡性腫瘤具有突出功效[21]。Tao等從篩選自紅樹(shù)林的內(nèi)生真菌鐮刀菌中分離到環(huán)肽白僵菌素（beauvericin），它對(duì)腫瘤細(xì)胞KB的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，主要通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對(duì)人體的多種腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用[22]。魏練平等從山蒼子葉中分離篩選出的內(nèi)生真菌，對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞抑制率達(dá)63.76%，具有明顯的抗腫瘤作用[5]。Made等研究番荔枝葉內(nèi)生真菌乙酸乙酯提取物的抗癌活性，當(dāng)提取物濃度為100 μg/mL 時(shí)，表現(xiàn)出對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的高抑制活性[23]。

3.2 抗氧化活性應(yīng)用

藥用植物及其內(nèi)生真菌是發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物的重要資源，多種內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物可成為新型天然抗氧化劑的潛在來(lái)源。目前已從多種藥用植物內(nèi)生菌及其次生代謝產(chǎn)物中得到諸多具有抗氧化活性的物質(zhì)，包括生物堿類(lèi)、酚酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、菇類(lèi)、香豆素類(lèi)化合物等。Huang等對(duì)29種中草藥的292株內(nèi)生真菌進(jìn)行了總抗氧化能力與總酚含量關(guān)系的研究，結(jié)果表明，內(nèi)生真菌培養(yǎng)物的抗氧化能力與其總酚含量顯著相關(guān)，酚類(lèi)物質(zhì)是內(nèi)生真菌的主要抗氧化成分[24]。鄭朝輝等發(fā)現(xiàn)，黃芩內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物具有抗氧化活性，從中分離得到的2種酚類(lèi)化合物具有較強(qiáng)抗氧化能力[25]。宋新月等從竹葉蘭中分離內(nèi)生真菌，篩選得到2株具有較強(qiáng)抗氧化活性的菌株Colletotrichum karstii和Phanerochaete sp.[26]。

3.3 抗菌活性應(yīng)用

大多數(shù)內(nèi)生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物中含有能夠抑制細(xì)菌、真菌等的生物活性物質(zhì)，其中發(fā)現(xiàn)最多的是內(nèi)生真菌產(chǎn)生的新型抗菌肽類(lèi)活性物質(zhì)。Li等從雷公藤中分離得到1株能產(chǎn)生一種新型環(huán)肽類(lèi)抗生素的內(nèi)生真菌，所產(chǎn)生的這種環(huán)肽類(lèi)抗生素含有很多稀有氨基酸，對(duì)人體中的病原真菌具有抑制作用[27]。魏永威從藿香植物的莖組織中分離出具有抑菌活性的內(nèi)生真菌[28]。劉雷等研究川麥冬內(nèi)生真菌的抑菌活性，結(jié)果表明，抑制白色念珠菌的菌株較多[29]。Atiphas-aworn等從羅勒葉中分離到14種內(nèi)生真菌，所有內(nèi)生真菌粗提物對(duì)9種人體細(xì)菌病原體金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌、霍亂弧菌和副溶血弧菌均有抑菌活性[30]。劉曉瑜等從22種藥用植物組織中分離出197株內(nèi)生菌，經(jīng)篩選獲得18株對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）有拮抗作用的菌株[31]。

4 藥用植物內(nèi)生真菌應(yīng)用研究中存在的問(wèn)題及解決方案

4.1 內(nèi)生真菌研究存在的技術(shù)問(wèn)題

（1）藥用植物內(nèi)生真菌的分離篩選方法存在著明顯的技術(shù)問(wèn)題。目前，普遍采用組織塊分離法分離藥用植物內(nèi)生真菌，在分離過(guò)程中，不徹底的表面消毒會(huì)造成內(nèi)生真菌中混有雜菌，影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性;這種分離方法只能分離得到部分內(nèi)生真菌，難以分離得到生長(zhǎng)緩慢且容易被優(yōu)勢(shì)菌種覆蓋的內(nèi)生真菌。（2）藥用植物內(nèi)生真菌的培養(yǎng)存在技術(shù)問(wèn)題。有些內(nèi)生真菌在人工合成的培養(yǎng)基上無(wú)法正常生長(zhǎng)、無(wú)法獲得純培養(yǎng)物，不利于保存與研究[32]，在表面消毒時(shí)部分敏感株容易被殺死等，導(dǎo)致仍然在存在大量的未被發(fā)現(xiàn)的新物種，仍然還有數(shù)量巨大的內(nèi)生真菌資源有待研究。（3）目前，對(duì)內(nèi)生真菌菌株的培養(yǎng)條件以及菌株自身遺傳背景進(jìn)行的深入研究較少，應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)產(chǎn)活性物質(zhì)菌株穩(wěn)定性、菌株培養(yǎng)條件以及菌株誘變改造等方面的深入研究。（4）分離出來(lái)的內(nèi)生真菌，當(dāng)脫離宿主植物后，在體外進(jìn)行傳代培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)某些重要的生物學(xué)特性退化和消失，甚至死亡現(xiàn)象。解決辦法是減少傳代次數(shù)，盡量模擬內(nèi)生真菌在宿主植物內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)條件。（5）內(nèi)生真菌鑒定方法存在技術(shù)問(wèn)題。目前，主要依靠真菌形態(tài)學(xué)對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行歸類(lèi)和鑒定，同時(shí)采用分子生物學(xué)方法輔助鑒定。真菌的形態(tài)學(xué)主要是以孢子形態(tài)進(jìn)行鑒定的，但有的真菌在人工培養(yǎng)條件下不形成孢子，所以誘導(dǎo)內(nèi)生真菌產(chǎn)生孢子是有必要的。盡管可利用多種方法進(jìn)行誘導(dǎo)，但仍有很多內(nèi)生真菌無(wú)法產(chǎn)生孢子，因此有部分分離得到的內(nèi)生真菌無(wú)法進(jìn)行分類(lèi)鑒定。

4.2 內(nèi)生真菌在應(yīng)用中出現(xiàn)的問(wèn)題

當(dāng)前，已有的研究結(jié)果顯示，內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化等活性，具有巨大的藥用價(jià)值[33]，可應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)，但內(nèi)生真菌尤其代謝產(chǎn)物在產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用方面仍存在很多問(wèn)題需要解決。（1）目前，許多研究只是通用分離篩選得到具有活性的內(nèi)生真菌，并未對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，且未對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步的探討。（2）內(nèi)生菌與宿主植物在共同進(jìn)化中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有高度相似性，但是內(nèi)生菌生產(chǎn)的次級(jí)代謝產(chǎn)物極不穩(wěn)定，活性成分的含量較低，且在頻繁傳代過(guò)程中易發(fā)生突變，導(dǎo)致代謝產(chǎn)物出現(xiàn)變化或可能會(huì)消失，難以進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。發(fā)酵時(shí)間不同，產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物不盡一致。（3）植物內(nèi)生真菌發(fā)酵可以產(chǎn)生與宿主植物相似的次生代謝活性產(chǎn)物，但仍然有許多次級(jí)代謝產(chǎn)物尚待明確，目前尚未深入研究?jī)?nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物中起到抑制作用的大量活性物質(zhì)。有些次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)酵水平很低，1 L內(nèi)生菌發(fā)酵液中僅能獲得微量的活性成分，其發(fā)酵優(yōu)選工藝還有待進(jìn)一步研究[32]。（4）內(nèi)生真菌與宿主植物共生生態(tài)機(jī)制以及共同具有相似次級(jí)代謝產(chǎn)物的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。（5）大多數(shù)藥用植物特別是一些珍貴的藥用植物尚未開(kāi)展內(nèi)生真菌方面的研究，且對(duì)某些活性菌株的研究?jī)H停留在實(shí)驗(yàn)室層面，尚未進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)。（6）內(nèi)生真菌本身可促進(jìn)藥用植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗病蟲(chóng)害的能力以及活性成分的合成與分泌，在栽培藥用植物防治病蟲(chóng)害等方面有著顯著的促進(jìn)效果[33]。目前，對(duì)于內(nèi)生真菌與寄主植物的相互作用機(jī)制尚不明確，藥用植物內(nèi)生真菌產(chǎn)生與寄主相同或相似成分的機(jī)制還不清楚[34]，這限制了藥用內(nèi)生真菌在實(shí)際中的應(yīng)用。

4.3 可行的解決方案

隨著現(xiàn)代技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，內(nèi)生真菌的研究和應(yīng)用等方面存在的問(wèn)題已有初步的解決方案。在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代技術(shù)手段如高通量測(cè)序技術(shù)、現(xiàn)代色譜技術(shù)、生物化學(xué)技術(shù)等進(jìn)行研究，有利于突破當(dāng)前的研究現(xiàn)狀。在傳統(tǒng)研究方法的基礎(chǔ)上，利用現(xiàn)代技術(shù)手段，將成為解決內(nèi)生真菌在科研和應(yīng)用上存在問(wèn)題的有利手段。（1）設(shè)計(jì)新型培養(yǎng)基，適于篩選出來(lái)的內(nèi)生真菌繁殖生長(zhǎng)、積累代謝產(chǎn)物，并對(duì)體外培養(yǎng)條件、發(fā)酵條件進(jìn)行工藝優(yōu)化。（2）內(nèi)生真菌的培養(yǎng)方式由體外純培養(yǎng)轉(zhuǎn)為多元混合培養(yǎng)，對(duì)篩選分離出來(lái)的內(nèi)生真菌進(jìn)行復(fù)配，進(jìn)行混合發(fā)酵。（3）采用高通量測(cè)序技術(shù)鑒定真菌，獲得未培養(yǎng)菌株。在內(nèi)生真菌鑒定的方面，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的逐漸應(yīng)用，采用轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列、大亞基（LSU）基因等分析對(duì)形態(tài)相似的內(nèi)生真菌進(jìn)行鑒定[35]，同時(shí)，DNA測(cè)序結(jié)合變形凝膠電泳技術(shù)也開(kāi)始應(yīng)用于內(nèi)生真菌的鑒定中。丁小麗等采用變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析對(duì)丹參葉片內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究[36]。（4）通過(guò)代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)，獲得有價(jià)值的次級(jí)代謝產(chǎn)物。從種類(lèi)繁多的內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物中篩選出生物活性物質(zhì)也是一個(gè)加快次生代謝產(chǎn)物研究的突破點(diǎn)?；蚝Y選[37]是指將特定基因作為篩選標(biāo)記，在基因水平上評(píng)估微生物產(chǎn)生某種代謝物的可能性及其產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的潛力。任丹等通過(guò)對(duì)川楝內(nèi)生真菌進(jìn)行基因篩選發(fā)現(xiàn)，次生代謝產(chǎn)物具有活性的可疑菌屬為曲霉屬和青霉屬[38]。（5）運(yùn)用誘變技術(shù)或基因工程技術(shù)對(duì)分類(lèi)篩選的內(nèi)生真菌進(jìn)行體外菌種改良，獲得遺傳穩(wěn)定、代謝活性物質(zhì)含量高的改良菌株。如在內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物開(kāi)發(fā)利用方面，為提高活性物質(zhì)的含量，達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)水平，應(yīng)將傳統(tǒng)的育種技術(shù)與現(xiàn)代育種相結(jié)合，利用基因工程等現(xiàn)代生物技術(shù)改良具有活性的菌株，優(yōu)化生產(chǎn)工業(yè)。

5 結(jié)論與展望

藥用植物內(nèi)生真菌具有豐富的生物多樣性，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有著積極的作用，能夠產(chǎn)生與寄主植物相同或相似的具有生物活性的產(chǎn)物，在抗腫瘤、抗菌、抗氧化等方面有著明顯的效果，是醫(yī)藥行業(yè)開(kāi)發(fā)新藥的新型途徑。藥用植物內(nèi)生真菌的研究雖然處于起步階段，但其實(shí)用價(jià)值和社會(huì)價(jià)值己經(jīng)受到越來(lái)越多的重視，從藥用植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物中篩選有效的活性物質(zhì)或新型化合物以研究新的藥物，將在很大程度上豐富人類(lèi)醫(yī)藥寶庫(kù)，解決自然資源不足等問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展。隨著技術(shù)的進(jìn)步和植物次生代謝研究的深入，對(duì)藥用植物內(nèi)生真菌的開(kāi)發(fā)和研究必將成為重點(diǎn)，藥用植物內(nèi)生真菌具有極大的開(kāi)發(fā)利用潛力和價(jià)值。

目前，對(duì)于內(nèi)生真菌的研究與應(yīng)用也存在著一些問(wèn)題，如大多數(shù)藥用植物尚未開(kāi)展內(nèi)生真菌方面的研究，這將是未來(lái)開(kāi)發(fā)內(nèi)生真菌資源的重要寶庫(kù);對(duì)部分活性菌株僅停留在實(shí)驗(yàn)室研究層面，尚未進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)[30];藥用植物內(nèi)生真菌產(chǎn)生與宿主植物相似或相同的次生代謝產(chǎn)物的遺傳機(jī)制尚不清楚;藥用植物內(nèi)生真菌與其他內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生放線菌互作的多樣性及分子機(jī)制鮮有報(bào)道等。關(guān)于這些方面的深入研究將是未來(lái)藥用內(nèi)生真菌研究、開(kāi)發(fā)的方向。另外，如何高效準(zhǔn)確地分離與篩選出內(nèi)生真菌還有待進(jìn)一步研究，且內(nèi)生真菌與寄主之間的作用機(jī)制尚不清晰，具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不明晰。利用先進(jìn)的現(xiàn)代生物技術(shù)手段，系統(tǒng)并全面地研究與開(kāi)發(fā)藥用植物內(nèi)生真菌有待進(jìn)一步開(kāi)展。

解決上述問(wèn)題，不僅有利于對(duì)珍稀、瀕危藥用植物資源的保護(hù)，對(duì)減少野生藥用植物多樣性的破壞具有重要意義，而且可為利用藥用植物內(nèi)生真菌生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物提供參考依據(jù)。充分研究藥用植物內(nèi)生真菌及其次生代謝產(chǎn)物，可為后續(xù)發(fā)現(xiàn)新型菌株或新型化合物、篩選生物活性物質(zhì)提供一種新途徑，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等方面將會(huì)發(fā)揮巨大的作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]Gokhale M，Gupta D，Gupta U，et al. Patents on endophytic fungi[J]. Recent Patents on Biotechnology，2017，11（2）：120-140.

[2]Adeyemi A，Erute M，Abiodun T，et al. Isolation and screening of endophytic fungi from three plants used in traditional medicine in Nigeria for antimicrobial activity[J]. International Journal of Green Pharmacy，2015，9（1）：58-62.

[3]章 苗，章華偉，王 鴻. 無(wú)患子內(nèi)生真菌抗菌篩選與鑒定[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2017，29（6）：647-651.

[4]張 亮，桑曼曼，郭小偉，等. 杜仲內(nèi)生真菌的多樣性分析及其抗植物病原真菌的活性[J]. 生物資源，2017，39（1）：48-52.

[5]魏練平，魏洪璇，吳 丹，等. 山蒼子葉內(nèi)生真菌的純化與鑒定[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2013，25（10）：1131-1133.

[6]陳振江，魏學(xué)凱，曹 瑩，等. 禾草內(nèi)生真菌檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 草業(yè)科學(xué)，2017，34（7）：1419-1433.

[7]孫 璐，任禎慧，宋潤(rùn)杰，等. 毛序棘豆內(nèi)生真菌分離鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2018，49（9）：2025-2035.[HJ1.5mm]

[8]艾洪蓮，楊曼思，何 雋，等. 馬鈴薯內(nèi)生真菌的多樣性及抑菌活性研究[J]. 中南民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，36（4）：51-55.

[9]李盼盼，袁曉龍，李金海，等. 湖北煙草內(nèi)生真菌生物多樣性和種群結(jié)構(gòu)分析[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2018，58（10）：1853-1863.

[10]唐 青，周思旋，雷幫星，等. 貴州西南部艾納香內(nèi)生真菌多樣性研究[J]. 菌物學(xué)報(bào)，2017，36（11）：1498-1503.

[11]Manganyi M C，Regnier T，Tchatchouang C D K，et al. Antibacterial activity of endophytic fungi isolated from Sceletium tortuosum L.（Kougoed）[J]. Ann Microbiol，2019，69（6）：659-663.

[12]裴梟鑫，李玉芳，蔡德育，等. 黑果枸杞具抗氧化活性內(nèi)生真菌的篩選[J]. 西北民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，38（3）：62-66.

[13]曹丹丹，路 浩，李小蒙，等. 莖直黃芪內(nèi)生真菌分離鑒定及其多樣性分析[J]. 草地學(xué)報(bào)，2015，23（6）：1252-1258.

[14]劉 軍，劉艷明，徐在超，等. 檀香內(nèi)生真菌多樣性及其抗菌與促生特性的研究[J]. 中國(guó)中藥雜志，2018，43（17）：3477-3483.

[15]岳海梅，莊 華. 西藏砂生槐內(nèi)生真菌的分離鑒定及其多樣性分析[J]. 中國(guó)植保導(dǎo)刊，2018，38（3）：12-18.

[16]Elaine C J，Mohamed I M，Khoo C H，et al. Analysis of chemical constituents，antimicrobial and anticancer activities of dichloromethane extracts of Sordariomycetes sp. endophytic fungi isolated from Strobilanthes crispus[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2017，33（1）：1-19.

[17]Peng Z，Xin L，Bin-Gui W. Secondary metabolites from the marine algal-derived endophytic fungi：chemical diversity and biological activity[J]. Planta Medica，2016，82（9/10）：832-842.

[18]Schulz B，Boyle C，Draeger S，et al. Endophytic fungi：a source of novel biologically active secondary metabolites[J]. Mycological Research，2002，106（9）：996-1004.

[19]Li R Q，Li J F，Zhou Z Y，et al. Antibacterial and antitumor activity of secondary metabolites of endophytic fungi Ty5 from Dendrobium officinale[J]. Journal of Biobased Materials and Bioenergy，2018，12（2）：184-193.

[20]程玉鵬，任朋英，李弘棍，等. 產(chǎn)柴胡皂苷內(nèi)生真菌抗腫瘤作用機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，20（12）：59-62.

[21]Li Y C，Tao W Y，Long C. Paclitaxel production using co-culture of Taxus suspension cells and paclitaxel-producing endophytic fungi in a co-bioreactor[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2009，83（2）：233-239.

[22]Tao Y W，Lin Y C，She Z G，et al. Anticancer activity and mechanism investigation of beauvericin isolated from secondary metabolites of the mangrove endophytic fungi[J]. Anti-cancer Agents in Medicinal Chemistry，2015，15（2）：258-266.

[23]Made A I，Heddy J，Nurliani B，et al.Anticancer activity test of ethyl acetate extract of endophytic fungi isolated from soursop leaf （Annona muricata L.）[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine.2017，10（6）：566-571.

[24]Huang W Y，Cai Y Z，Jie X，et al. A potential antioxidant resource：endophytic fungi from medicinal plants[J]. Economic Botany，2007，61（1）：14-30.

[25]鄭朝輝，劉艷云，范 黎. 黃芩內(nèi)生真菌N.SBA10代謝產(chǎn)物抗氧化活性及結(jié)構(gòu)鑒定[J]. 菌物學(xué)報(bào)，2012，31（6）：917-923.

[26]宋新月，湯冰雪，邱君志，等. 竹葉蘭內(nèi)生真菌的分離鑒定及其抗氧化活性研究[J]. 現(xiàn)代食品科技，2018，34（2）：82-88.

[27]Li J Y，Strobel G，Harper J，et al. Cryptocin，a potent tetramic acid antimycotic from the endophytic fungus Cryptosporiopsis cf.quercina[J]. Organic Letters，2000，2（6）：767-770.

[28]魏永威. 藿香內(nèi)生真菌的分離純化及次級(jí)代謝產(chǎn)物生物活性研究[D]. 蘭州：蘭州理工大學(xué)，2018.

[29]劉 雷，潘 峰，楊遠(yuǎn)兵，等. 川麥冬內(nèi)生真菌分離和鑒定及抑菌活性初步研究[J]. 中草藥，2016，47（8）：1382-1391.

[30]Atiphasaworn P，Monggoot S，Gentekaki E，et al. Antibacterial and antioxidant constituents of extracts of endophytic fungi isolated from Ocimum basilicum var. thyrsiflora leaves[J]. Current Microbiology，2017，74（10）：1185-1193.

[31]劉曉瑜，馬玉超. 抗耐藥細(xì)菌藥用植物內(nèi)生菌的篩選與鑒定[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2015，31（3）：154-160.

[32]楊志軍，鄧 毅，曼 瓊，等. 內(nèi)生菌在天然藥物研究中的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2018，34（5）：593-596.

[33]鄭紅梅，葉耀輝，王 婷，等. 藥用植物內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物活性的研究概況[J]. 江西中醫(yī)藥，2016，47（4）：71-73.

[34]丁常宏，都曉偉，徐 瑩. 藥用植物內(nèi)生真菌的功能研究進(jìn)展[J]. 中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2013，41（3）：168-171.

[35]張黎光，魏希穎，馬彩霞. 藥用植物內(nèi)生真菌——生物活性物質(zhì)的新來(lái)源[J]. 藥物生物技術(shù)，2011，18（5）：453-456.

[36]丁小麗，孫建軍，梁 健，等. 丹參葉片內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)及其與有效成分相關(guān)性分析[J]. 中國(guó)中藥雜志，2015，40（14）：2800-2806.

[37]鄭有坤，劉 凱，熊子君，等. 藥用植物內(nèi)生放線菌多樣性及天然活性物質(zhì)研究進(jìn)展[J]. 中草藥，2014，45（14）：2089-2099.

[38]任 丹，張 波，張小平，等. 川楝內(nèi)生真菌的遺傳及PKS、NRPS基因的多樣性[J]. 中草藥，2014，45（10）：1461-1467.

陳洪凡，黃 蓉，胡建坤，等. 菊花病蟲(chóng)害防治化學(xué)農(nóng)藥減施替代技術(shù)綜述[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（14）：6-11.

基金項(xiàng)目：廣東省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（編號(hào)：201810577053、201810577007）;廣東省高校特色創(chuàng)新項(xiàng)目（編號(hào)：2017KTSCX172）;惠州學(xué)院教授/博士科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)（編號(hào)：2018JB002）。

作者簡(jiǎn)介：謝海偉（1978—），男，吉林樺甸人，博士，教授，主要從事微生物、抗菌肽研究。E-mail：xiehaiwei324@163.com。