米 凱， 黃 銳

1 核工業(yè)四一六醫(yī)院(成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院) 普外科， 成都 610500；2 四川省人民醫(yī)院 肝膽外科， 成都 610007

在進(jìn)行肝臟手術(shù)的過程中，肝臟往往因缺血再灌注造成損傷，這被認(rèn)為是手術(shù)失敗的主要原因之一[1]。近年來，由于晚期肝病患者逐年增多，導(dǎo)致需要進(jìn)行肝臟手術(shù)的人數(shù)大幅上漲，因此，尋找預(yù)防或治療肝缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI)的藥物尤為重要。

尿石素A(Urolithin A，Uro-A)是鞣花酸被腸道微生物代謝后生成的一種物質(zhì)[2]。鞣花酸存在于多種堅(jiān)果、漿果和石榴中，是一種多酚物質(zhì)[3]。有研究[4]證實(shí)Uro-A具有降低血漿中炎癥因子、減少細(xì)胞炎癥反應(yīng)并抑制細(xì)胞凋亡的作用，且比其前體鞣花酸效果更顯著。Uro-A能減輕腦神經(jīng)炎癥與損傷[5]，在腎臟缺血再灌注中發(fā)揮預(yù)防與治療作用[6]，亦能減輕其他疾病的炎癥反應(yīng)[7]。但其在預(yù)HIRI方面目前未見相關(guān)報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)從控制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞凋亡方面探討Uro-A對(duì)HIRI的預(yù)防與治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，平均體質(zhì)量(260±20)g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2015-030，使用許可證號(hào)：SYXK(川)2014-189。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 Uro-A，純度≥98%，購于上海甄準(zhǔn)生物有限公司(批號(hào)：20190203)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所，IL-1β、IL-6、TNFα、TUNEL測定試劑盒購于武漢博士德生物公司，CHOP、GRP78、Caspase-12、β-actin和羊抗兔二抗均購于abcam公司。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 全自動(dòng)生化分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)、切片機(jī)(德國徠卡公司)、酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)、光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)、全功能成像儀(美國Bio-Rad公司)、蛋白質(zhì)電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及構(gòu)建大鼠HIRI模型[8]將40只大鼠按隨機(jī)數(shù)法隨機(jī)分成4組，即假手術(shù)組、模型組、Uro-A低劑量組(1 mg/kg)與Uro-A高劑量組(3 mg/kg)，每組10只。Uro-A低、高劑量組手術(shù)前分別灌胃溶于生理鹽水的對(duì)應(yīng)藥物，模型組與假手術(shù)組灌胃等體積生理鹽水，持續(xù)5 d，1次/d。最后1天預(yù)處理完畢后1 h，腹腔注射戊巴比妥(40 mg/kg)，在上腹正中打開腹腔，小心暴露肝臟，然后游離肝周韌帶。模型組與Uro-A低、高劑量組夾閉肝左葉和肝中葉入肝血管阻斷血流，60 min后松開血管夾恢復(fù)血流。假手術(shù)組僅游離肝門而不阻斷血流。再灌注6 h后，收集下腔靜脈血液用于生化指標(biāo)檢測；分離部分肝臟組織于-80 ℃儲(chǔ)存，用于炎癥因子、氧化應(yīng)激因子和相關(guān)凋亡蛋白的檢測；剩余肝臟組織儲(chǔ)存在4%多聚甲醇中進(jìn)行固定，用于病理學(xué)檢測。

1.2.2 血清ALT、AST、乳酸脫氫酶(LDH)檢測 將下腔靜脈血以3000 r/min離心10 min，取上層血清，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用全自動(dòng)血液生化儀測定各組血清中AST、ALT和LDH水平。

1.2.3 肝臟中IL-1β、IL-6、TNFα檢測 將肝組織制備10%的組織勻漿，3000 r/min離心10 min，取上清液按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測定肝臟中IL-1β、IL-6、TNFα含量。

1.2.4 肝臟中SOD、MDA、CAT檢測 取肝組織制備10%的組織勻漿，3000 r/min離心10 min，取上清液按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測定肝臟中SOD、MDA、CAT含量。

1.2.5 肝臟病理學(xué)分析 所有組織病理學(xué)檢查均由對(duì)研究組不知情的研究人員進(jìn)行。將固定好的各組肝臟標(biāo)本用石蠟包埋，切片后行HE染色，使用光學(xué)顯微鏡在200倍放大下進(jìn)行病理學(xué)分析，評(píng)價(jià)肝臟組織被膜、肝索、核膜等損傷情況。

1.2.6 肝細(xì)胞凋亡率計(jì)算 各組肝臟標(biāo)本用石蠟包埋切片后，按照TUNEL染色試劑盒說明書進(jìn)行染色操作，使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況，每例標(biāo)本的切片隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野，按每100個(gè)細(xì)胞中含凋亡細(xì)胞數(shù)計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 Western Blot檢測各組大鼠肝臟調(diào)亡蛋白情況 提取肝臟的總蛋白同時(shí)測定蛋白濃度。蛋白樣品(20 μg)在10% SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜完成后室溫下用5%脫脂奶粉封閉60 min，4 ℃過夜孵育下列一抗：兔抗大鼠下游應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子(CHOP)(1∶1000)、兔抗大鼠葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)(1∶1000)、兔抗大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-12(Caspase-12)(1∶1000)、兔抗大鼠β-actin(1∶1000)。使用TBST將膜清洗干凈后在羊抗兔IgG(1∶10 000)中室溫孵育2 h，最后使用ECL試劑盒曝光顯影，在凝膠成像系統(tǒng)下對(duì)條帶進(jìn)行分析。

1.3 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(批號(hào)：2020163A)，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

2 結(jié)果

2.1 Uro-A預(yù)處理對(duì)大鼠肝臟功能的保護(hù)作用 與假手術(shù)組相比，模型組與Uro-A低、高劑量組大鼠血清ALT、AST與LDH水平顯著升高(P值均<0.01)；與模型組相比，Uro-A低、高劑量組ALT、AST與LDH水平顯著降低(P值均<0.05)；與Uro-A低劑量組相比，高劑量組ALT、AST與LDH水平顯著降低(P值均<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠血清ALT、AST、LDH水平比較

2.2 Uro-A預(yù)處理對(duì)大鼠炎癥因子的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠肝臟中IL-1β、IL-6、TNFα水平明顯升高(P值均<0.01)；與模型組相比，Uro-A高劑量組大鼠肝臟中的IL-1β、IL-6、TNFα水平顯著降低，Uro-A低劑量組大鼠肝臟中僅TNFα水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表2)。

表2 各組大鼠肝臟中IL-1β、IL-6、TNFα水平比較

2.3 Uro-A預(yù)處理對(duì)大鼠肝臟氧化應(yīng)激因子的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠肝臟中SOD含量降低，MDA與CAT含量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；與模型組相比，Uro-A低、高劑量組SOD含量明顯升高(P值均<0.01)，Uro-A高劑量組MDA與CAT含量顯著降低(P值均<0.01)(表3)。

表3 各組大鼠肝臟中SOD、MDA、CAT水平比較

2.4 Uro-A預(yù)處理對(duì)大鼠肝臟形態(tài)學(xué)的影響 光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組肝臟被膜完整，肝索排列較為整齊；肝細(xì)胞形態(tài)正常，胞質(zhì)染色均勻，核膜完整；肝竇無明顯擴(kuò)張、淤血及炎細(xì)胞浸潤；門管區(qū)結(jié)構(gòu)完整，小葉間動(dòng)脈、靜脈、膽管結(jié)構(gòu)完整清晰，未見明顯的纖維組織增生及炎性滲出(圖1a)。模型組肝臟被膜完整，肝索排列較為紊亂；大量肝細(xì)胞氣球樣變，可見細(xì)胞嚴(yán)重腫脹，體積明顯變大，胞質(zhì)染色明顯變淺或幾乎透明，呈“氣球樣”，胞核位于中央或被擠于一側(cè)；少量肝細(xì)胞壞死，胞核固縮；肝竇無明顯擴(kuò)張、淤血及炎細(xì)胞浸潤；門管區(qū)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞少量脫落，門管區(qū)周圍可見較多中性粒細(xì)胞浸潤，陽性率達(dá)90%(圖1b)。Uro-A低劑量組肝臟被膜完整，肝索排列較為整齊；肝細(xì)胞空泡變性，部分細(xì)胞腫脹明顯；肝竇無明顯擴(kuò)張、淤血及炎細(xì)胞浸潤；門管區(qū)周圍少量肝細(xì)胞呈點(diǎn)狀壞死并伴少量淋巴細(xì)胞浸潤，陰性率達(dá)80%(圖1c)。Uro-A高劑量組肝臟被膜完整，肝索排列較為整齊；肝細(xì)胞空泡變性，部分細(xì)胞輕微腫脹，偶見少量肝細(xì)胞呈點(diǎn)狀壞死；肝竇無明顯擴(kuò)張、淤血及炎細(xì)胞浸潤；門管區(qū)結(jié)構(gòu)完整，小葉間動(dòng)脈、小葉間靜脈、小葉間膽管結(jié)構(gòu)完整清晰，未見明顯的纖維組織增生及炎性滲出(圖1d)。

2.5 Uro-A預(yù)處理對(duì)大鼠肝臟細(xì)胞凋亡的影響 熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組細(xì)胞核多數(shù)呈藍(lán)色，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完好，凋亡細(xì)胞少(圖2a)；模型組大部分細(xì)胞核呈黃色，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，凋亡細(xì)胞大量生成(圖2b)；Uro-A低劑量和高劑量組細(xì)胞核大部分呈藍(lán)色，部分細(xì)胞核呈黃色(圖2c、d)。與假手術(shù)組相比，模型組肝臟細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，Uro-A低、高劑量組肝臟細(xì)胞凋亡率顯著降低(P值均<0.01)；與Uro-A低劑量組相比，Uro-A高劑量組細(xì)胞凋亡率亦明顯下降(P<0.05)(表4)。

表4 各組大鼠肝細(xì)胞凋亡率比較

2.6 Uro-A預(yù)處理對(duì)大鼠肝臟凋亡蛋白的影響 蛋白檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組中CHOP、GRP78和Caspase-12表達(dá)均明顯增多(P值均<0.01)；與模型組相比，Uro-A高劑量組中CHOP、GRP78和Caspase-12表達(dá)均顯著下降(P值均<0.05)(表5，圖3)。

表5 各組大鼠肝臟中CHOP、GRP78、Caspase-12水平比較

3 討論

本研究的主要目的是探討Uro-A對(duì)HIRI的預(yù)防效果，筆者在Cui等[9]使用Uro-A治療大鼠動(dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)上，選取了1 mg/kg和3 mg/kg兩個(gè)濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Uro-A是一種鞣花酸代謝產(chǎn)物，口服進(jìn)入體內(nèi)后需要消化代謝后才能發(fā)揮藥效?？诜ro-A經(jīng)尿液排出體外的含量很少，經(jīng)過胃-十二指腸-小腸的代謝吸收后，會(huì)運(yùn)輸?shù)礁闻K儲(chǔ)存，而且不會(huì)對(duì)胃腸道產(chǎn)生不良反應(yīng)[10]，這為評(píng)價(jià)Uro-A的預(yù)防作用提供了天然的條件，結(jié)合中藥成分的吸收速度，本研究選用術(shù)前連續(xù)灌胃5 d Uro-A作為給藥方式。

肝功能檢測是評(píng)價(jià)HIRI模型是否構(gòu)建成功的方法之一。本實(shí)驗(yàn)在夾閉大鼠肝左葉與中葉血管后，通過肉眼觀察肝臟組織發(fā)現(xiàn)，肝臟呈暗紅色，證明已經(jīng)造成肝臟缺血。能夠反映肝損傷的指標(biāo)包括血清ALT、AST與LDH含量，損傷后血清中ALT和AST水平異常升高[11]，LDH能側(cè)面反映肝細(xì)胞的受損程度[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組ALT、AST、LDH水平較假手術(shù)組顯著性升高(P值均<0.01)，說明大鼠HIRI模型構(gòu)建成功。在此基礎(chǔ)上，Uro-A低劑量組與高劑量組均能降低血清中ALT、AST與LDH水平，且高劑量組效果更為明顯，表明對(duì)大鼠提前給予Uro-A可預(yù)防HIRI。

氧化應(yīng)激失衡是引起HIRI的主要原因，因?yàn)槿毖鯐?huì)使線粒體產(chǎn)生大量氧自由基同時(shí)發(fā)生脂質(zhì)過氧化過程[13]，進(jìn)而激活下游通路，促進(jìn)炎性細(xì)胞生成、炎癥因子的釋放等，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡和組織壞死。SOD、MDA與CAT是檢測氧化應(yīng)激的常用指標(biāo)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)防給藥Uro-A能提高肝臟再灌注后SOD含量(P<0.01)，避免肝臟受到進(jìn)一步損傷，同時(shí)Uro-A可清除再灌注后生成的MDA，高劑量組更為明顯(P<0.01)。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，預(yù)防給藥后肝組織CAT含量減少(P<0.01)，說明Uro-A能夠清除肝臟組織中異常生成的過氧化氫，導(dǎo)致CAT合成減少。另外有研究[15]發(fā)現(xiàn)，肝臟中的巨噬細(xì)胞會(huì)在缺血再灌注后產(chǎn)生大量的炎癥因子與趨化因子，如IL-1β、IL-6和TNFα等，造成組織出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，損傷肝細(xì)胞。本研究對(duì)炎癥因子檢測發(fā)現(xiàn)，高劑量Uro-A預(yù)防給藥能減少肝臟缺血再灌注后IL-1β、IL-6和TNFα的含量(P值均<0.01)，減輕炎癥因子對(duì)肝臟造成的損傷。

病理學(xué)觀察能直觀地反映器官組織狀態(tài)，對(duì)評(píng)價(jià)藥物的治療效果十分關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)Uro-A組大鼠肝臟組織的“氣球樣”細(xì)胞明顯減少，炎性細(xì)胞浸潤程度下降，細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)也恢復(fù)整齊，高劑量組變化尤為明顯。由此表明Uro-A可以預(yù)防缺血再灌注帶來的肝損傷。

肝臟缺血再灌注后會(huì)激活某些凋亡通路，誘導(dǎo)正?；蚴軗p的肝細(xì)胞死亡[16]。本研究發(fā)現(xiàn)Uro-A組中肝細(xì)胞的凋亡數(shù)量明顯減少，凋亡率也明顯降低(P<0.01)，說明Uro-A可以防止肝細(xì)胞在缺血再灌注中發(fā)生凋亡，但其中機(jī)制尚未明確。有研究[17]報(bào)道，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)調(diào)控凋亡通路，其中GRP78和CHOP能在應(yīng)激狀態(tài)下誘導(dǎo)Caspase-12的釋放，加快細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)檢測肝組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與凋亡相關(guān)蛋白后發(fā)現(xiàn)，Uro-A高劑量組中GRP78與CHOP蛋白表達(dá)量明顯下降，其下游的Caspase-12蛋白表達(dá)量也隨之降低(P值均<0.05)，表明Uro-A能通過抑制GRP78/CHOP內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，導(dǎo)致Caspase-12生成減少，產(chǎn)生抗凋亡的效果。故Uro-A能預(yù)防肝臟缺血再灌注后的細(xì)胞凋亡，減少肝細(xì)胞的凋亡數(shù)量，其作用機(jī)制是抑制GRP78/CHOP內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路。

綜上所述，HIRI是一種由多種因素造成的損傷，是缺血與再灌注共同影響的動(dòng)態(tài)過程，涉及代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞凋亡等多個(gè)途徑。本研究采用中藥有效提取成分Uro-A作為研究藥物，對(duì)大鼠進(jìn)行預(yù)防給藥，發(fā)現(xiàn)該藥物能在缺血再灌注中起到保護(hù)肝臟的作用，主要表現(xiàn)為提高肝功能、平衡氧化應(yīng)激、減少炎癥因子的釋放、降低肝細(xì)胞凋亡等，其作用途徑可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)，為今后研究開發(fā)相關(guān)藥物提供了一種可行性。目前關(guān)于Uro-A的肝毒性反應(yīng)尚無報(bào)道，但由于Uro-A在體內(nèi)會(huì)被吸收轉(zhuǎn)移到肝臟，因此預(yù)防給藥的劑量需要嚴(yán)格控制，既要有藥效又不能造成肝臟損傷，這是今后需要進(jìn)一步研究的問題。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻(xiàn)聲明：米凱、黃銳負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文，修改論文并最后定稿。