鹽度對(duì)仿刺參免疫指標(biāo)的影響

王玉鳳，楊 金，胡雅瀟，張紅斌，丁 君，王 犖，仇雪梅

鹽度對(duì)仿刺參免疫指標(biāo)的影響

王玉鳳1，楊 金1，胡雅瀟1，張紅斌1，丁 君2，王 犖2，仇雪梅1

（1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023；2. 大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023）

【】研究不同鹽度下對(duì)攻毒燦爛弧菌（）前后的仿刺參免疫指標(biāo)的影響。將平均體質(zhì)量（6.16 ± 1.86）g的仿刺參150頭隨機(jī)分為5組，分別置于鹽度25、27、29、31、33的海水中暫養(yǎng)，注射200 μL 3.98×108CFU/mL致病菌，在0、6、12、24、48 h采集體腔液，測(cè)定相關(guān)免疫指標(biāo)。攻毒前，各鹽度下仿刺參超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、呼吸暴發(fā)力（RB）差異不顯著（> 0.05）。仿刺參吞噬活力在鹽度25、27、29、31條件下，隨鹽度的升高吞噬活力顯著升高（< 0.05），鹽度33條件下，仿刺參吞噬活力隨鹽度的升高而降低；仿刺參酚氧化物（PO）活力在鹽度25、27、29條件下，隨鹽度的升高PO活力顯著升高（< 0.05），鹽度31、33條件下，仿刺參PO活力隨鹽度的升高而降低。攻毒后，仿刺參SOD活力變化明顯，鹽度25、27、33條件下，仿刺參SOD活力在48 h顯著降低（< 0.05），鹽度29、31條件下，攻毒后仿刺參SOD活力顯著降低時(shí)間提前；仿刺參ACP活力變化明顯，鹽度25、27條件下，攻毒后仿刺參ACP活力在12 h顯著升高（< 0.05），鹽度29、31、33條件下，攻毒后仿刺參ACP活力在6 h顯著升高（< 0.05）；CAT活力無(wú)變化規(guī)律；鹽度25、27條件下，攻毒后仿刺參吞噬活力在6 h顯著升高（< 0.05），鹽度29、31條件下，攻毒6、12、24、48 h后與0 h相比仿刺參吞噬活力無(wú)顯著性差異（> 0.05）；鹽度對(duì)仿刺參RB有顯著性影響（< 0.05），但無(wú)變化規(guī)律；攻毒后，不同鹽度下的仿刺參PO活力在不同時(shí)間點(diǎn)較0 h均有升高，但沒(méi)有規(guī)律性。鹽度對(duì)仿刺參的吞噬活力、PO的影響，可以為選擇適宜鹽度水域養(yǎng)殖仿刺參提供依據(jù)；仿刺參在攻毒燦爛弧菌后SOD、ACP具有較高的敏感性。

仿刺參；免疫相關(guān)酶；鹽度；燦爛弧菌

仿刺參（）屬于棘皮動(dòng)物門(mén)，海參綱，循手目，刺參科，仿刺參屬，其性溫補(bǔ)，足敵人參，是藥食兩用的海珍品[1]。仿刺參作為我國(guó)北方沿海地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)品種，其養(yǎng)殖現(xiàn)已成為遼寧和山東省重要的支柱產(chǎn)業(yè)之一。仿刺參養(yǎng)殖業(yè)在迅速發(fā)展的過(guò)程中，病害問(wèn)題頻發(fā)，嚴(yán)重制約產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2-3]。近年來(lái)，在我國(guó)遼寧大連、山東榮成、蓬萊等養(yǎng)殖區(qū)常常暴發(fā)明顯的腐皮潰爛癥，導(dǎo)致仿刺參大規(guī)模死亡[4]。

仿刺參健康狀態(tài)主要受到環(huán)境因子和病害的影響。環(huán)境因子對(duì)水生動(dòng)物的攝食、生長(zhǎng)發(fā)育、代謝和免疫等方面有很大的影響。常見(jiàn)的環(huán)境因子如：鹽度、溫度、pH、光照、溶解氧等[5]。其中，鹽度是影響水生生物生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖以及分布的重要環(huán)境因子[6]。在自然環(huán)境中，由于養(yǎng)殖海域位于潮間帶、可流淡水的流入、夏季汛期的來(lái)臨造成鹽度波動(dòng)變化，而仿刺參體腔中不具有特定的器官來(lái)調(diào)節(jié)滲透壓[7]，導(dǎo)致滲透壓的改變，進(jìn)而引起免疫力下降，增加感染病原微生物的幾率[8-9]。外來(lái)入侵的微生物致病菌對(duì)機(jī)體的致病影響是直接的。Deng等[10]發(fā)現(xiàn)“腐皮綜合征”是由不同種類的病原菌共同引起。李強(qiáng)等[11]列舉了9種與仿刺參患病有關(guān)的細(xì)菌性病原致病菌。其中，由燦爛弧菌引起的“腐皮綜合征”最為嚴(yán)重[12]；燦爛弧菌具有強(qiáng)致病力、傳染性和死亡率，患病仿刺參出現(xiàn)腫嘴、黏附力下降、皮膚潰爛最后死亡，溶化為鼻涕狀的膠體等癥狀[13]。

仿刺參的免疫防御主要是通過(guò)體液和細(xì)胞免疫協(xié)同介導(dǎo)，即機(jī)體對(duì)外來(lái)入侵物進(jìn)行識(shí)別、吞噬、包裹、分泌一些免疫因子完成自身防御功能以及對(duì)創(chuàng)口進(jìn)行修復(fù)[14-15]。可用來(lái)衡量仿刺參生長(zhǎng)狀況的免疫指標(biāo)主要有酸性磷酸酶（ACP）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、酚氧化酶（PO）、吞噬活力和呼吸暴發(fā)力[16]。

為了解鹽度對(duì)仿刺參免疫力的影響，本研究對(duì)不同鹽度條件下，攻毒燦爛弧菌前后的仿刺參進(jìn)行免疫指標(biāo)的測(cè)量和分析。旨在發(fā)現(xiàn)鹽度對(duì)仿刺參免疫指標(biāo)影響的變化規(guī)律，找到適合仿刺參生存的鹽度范圍，以及在感染燦爛弧菌后仿刺參不同時(shí)間的各項(xiàng)免疫指標(biāo)的變化規(guī)律，為建立仿刺參抗?fàn)N爛弧菌病害預(yù)警模型提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

健康養(yǎng)殖仿刺參150頭，7月齡，體質(zhì)量約（6.16 ± 1.86）g，購(gòu)自于鑫玉龍生物有限公司。所用致病菌燦爛弧菌（）菌株，由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大連生物技術(shù)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)在大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，規(guī)格為290 mm × 220 mm × 337 mm，15 L的水族箱中進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)設(shè)33、31、29、27、25等5個(gè)鹽度梯度；實(shí)驗(yàn)用水為鹽度31.5的天然海水，用經(jīng)充分曝氣的自來(lái)水、海水晶調(diào)鹽度，經(jīng)便攜式溶解氧測(cè)量?jī)x（YSI）測(cè)量與校對(duì)，配制48 h后使用。水溫12 ℃，密度為15頭/箱，飼養(yǎng)3 d，連續(xù)充氣。

暫養(yǎng)結(jié)束后，采用體腔注射方式，注射經(jīng)2216E培養(yǎng)基活化后的200 μL燦爛弧菌，菌液濃度為3.98×108CFU/mL。在注射后0（未攻毒前記為0 h）、6、12、24、48 h分別采集體腔液，每次取3頭，用于免疫指標(biāo)的測(cè)定，并比較攻毒前及攻毒后各時(shí)間點(diǎn)、各鹽度之間的變化情況。

1.2.2 樣品的制備 采用“斷尾法”[17]，在冰浴條件下，5個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別采集仿刺參的體腔液，部分體腔液加入等體積的抗凝劑（0.48 mol/L NaCl，0.019 mol/L KCl，0.02 mol/L EGTA，0.068 mol/L Tris-HCl，pH = 7.6），制成仿刺參體腔細(xì)胞抗凝液[18-19]，用于吞噬活力和呼吸暴發(fā)力的測(cè)定；另一部分以4 ℃、3 000離心10 min，取上清液分裝，制得無(wú)細(xì)胞體腔液，保存于-20 ℃，用于其他免疫酶活力的測(cè)定。

1.2.3 免疫酶活力測(cè)定 使用南京建成生物工程研究所的試劑盒（編號(hào)分別為A001-1-2，A060-2-2，A007-1-1）測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、過(guò)氧化氫酶（CAT）免疫酶活力，SOD活力的測(cè)定采用羥胺法，ACP活力的測(cè)定采用磷酸苯二鈉法，CAT活力的測(cè)定采用鉬酸銨比色法，均按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，每個(gè)樣本重復(fù)3次。酚氧化物酶（PO）活力的測(cè)定參考Ashida M[20]和張琴[21]的方法，每個(gè)樣本做3次重復(fù)。

1.2.4 吞噬活力的測(cè)定 仿刺參體腔細(xì)胞的吞噬活力采用吞噬中性紅的方法測(cè)定[19,22]，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入100 μL仿刺參體腔細(xì)胞抗凝液，培養(yǎng)30 min，棄上清液，加入預(yù)先配置好的中性紅溶液，培養(yǎng)30 min，使體腔細(xì)胞吞噬中性紅，再用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗去未被吞噬的中性紅，最后加入細(xì)胞裂解液（冰乙酸∶無(wú)水乙醇的體積比為1∶1）[23]，裂解20 min，每個(gè)樣本重復(fù)做3次，使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)540 nm下測(cè)定光密度值，以每106個(gè)體腔細(xì)胞的光密度值表示仿刺參體腔細(xì)胞吞噬活力。

1.2.5 呼吸暴發(fā)力的測(cè)定 參考Song[24]的方法并稍作修改，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中先加入50 μL體積分?jǐn)?shù)為0.2%的多聚賴氨酸，后加入100 μL體腔細(xì)胞抗凝液，離心，去除上清，加入100 μL丙二醇甲醚醋酸酯（PMA），37 ℃溫育30 min后加入100 μL體積分?jǐn)?shù)為0.3%的氮藍(lán)四唑（NBT），37 ℃溫育30 min；離心去除上清后加入200 μL純甲醇終止反應(yīng)，離心去除上清，再用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇洗滌3次，離心去除上清后，室溫下晾干。干燥后，加入120 μL 2 mol/L KOH和140 μL二甲基亞砜（DMSO），充分溶解孔內(nèi)物質(zhì)，每個(gè)樣本重復(fù)做3次，在630 nm下測(cè)量光密度值，以每106個(gè)體腔細(xì)胞的光密度值表示仿刺參體腔細(xì)胞呼吸暴發(fā)活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度變化對(duì)仿刺參攻毒前后SOD活力的影響

圖1可見(jiàn)，攻毒前（0 h），鹽度25、27、29條件下，仿刺參SOD活力隨鹽度的升高而升高，無(wú)顯著性差異（> 0.05）；鹽度31、33條件下，仿刺參SOD活力隨鹽度的升高而降低，無(wú)顯著性差異（> 0.05）。

鹽度25條件下，攻毒燦爛弧菌6、12、24 h后與0 h相比仿刺參的SOD活力無(wú)顯著性差異（> 0.05），但仿刺參SOD活力在48 h顯著降低（< 0.05）；鹽度27、33條件下，攻毒6、12、24、48 h后與0 h相比SOD活力降低，48 h SOD活力顯著降低（< 0.05）；鹽度29條件下，攻毒6、12、24、48 h后與0 h相比SOD活力降低，6 h SOD活力顯著降低（< 0.05）；鹽度31條件下，攻毒6、12、24、48 h后與0 h相比SOD活力降低，24 h SOD活力顯著降低（< 0.05）。

小寫(xiě)字母表示相同鹽度、不同時(shí)間差異顯著性的比較；大寫(xiě)字母表示相同時(shí)間、不同鹽度差異顯著性的比較；凡含一個(gè)相同字母者表示不同處理組間差異不顯著(P > 0.05)。

綜上，攻毒前（0 h），隨鹽度的變化，仿刺參SOD活力無(wú)顯著性差異（> 0.05）。攻毒后鹽度25、27、33條件下，仿刺參SOD活力在48 h顯著降低（< 0.05）；鹽度29、31條件下，攻毒后仿刺參SOD活力顯著降低時(shí)間提前。

2.2 鹽度變化對(duì)仿刺參攻毒前后ACP活力的影響

圖2可見(jiàn)，攻毒前（0 h），鹽度25、27條件下，仿刺參ACP活力隨鹽度的升高而升高，無(wú)顯著性差異（> 0.05）；鹽度29、31、33條件下，仿刺參ACP活力隨鹽度的升高而降低，無(wú)顯著性差異（> 0.05）。

鹽度25、27條件下，攻毒6 h后與0 h相比ACP活力差異不顯著（> 0.05），攻毒12、24、48 h后與0 h相比ACP活力顯著升高（< 0.05）；鹽度29、31、33條件下，攻毒6、12、24、48 h后與0 h相比ACP活力升高，6 h ACP活力顯著升高（< 0.05）。

綜上，攻毒前（0 h），隨鹽度的變化，仿刺參ACP活力無(wú)顯著性差異（> 0.05）。鹽度25、27條件下，攻毒后仿刺參ACP活力在12 h顯著升高（< 0.05）；鹽度29、31、33條件下，攻毒后仿刺參ACP活力在6 h顯著升高（< 0.05）。

2.3 鹽度變化對(duì)仿刺參攻毒前后CAT活力的影響

圖3可見(jiàn)，攻毒前（0 h），隨鹽度的升高仿刺參CAT活力變化無(wú)規(guī)律，無(wú)顯著性差異（> 0.05）。

鹽度25條件下，攻毒6、24、48 h后與0 h相比CAT活力無(wú)顯著差異（> 0.05），但仿刺參CAT活力在12 h顯著降低（< 0.05）；鹽度27、29、31條件下，攻毒6、12、24、48 h與 0 h相比CAT活力差異不顯著（>0.05）；鹽度33條件下，攻毒6、12 h與0 h相比CAT活力差異不顯著，但24 h時(shí)CAT活力顯著降低（< 0.05）。

小寫(xiě)字母表示相同鹽度、不同時(shí)間差異顯著性的比較；大寫(xiě)字母表示相同時(shí)間、不同鹽度差異顯著性的比較；凡含一個(gè)相同字母者表示不同處理組間差異不顯著(P > 0.05)。

綜上，攻毒前（0 h），隨鹽度的變化，仿刺參CAT活力無(wú)顯著性差異（> 0.05）。在鹽度27、29、31條件下，攻毒后仿刺參CAT活力無(wú)顯著性差異（>0.05），無(wú)變化規(guī)律；鹽度25、33條件下，攻毒后仿刺參CAT活力有顯著性降低（< 0.05），但無(wú)變化規(guī)律。

2.4 鹽度變化對(duì)仿刺參攻毒前后吞噬活力的影響

圖4可見(jiàn)，攻毒前（0 h），鹽度25、27、29、31條件下，仿刺參吞噬活力隨鹽度的升高而升高，鹽度31與25~27 相比，仿刺參吞噬活力顯著升高（< 0.05）；鹽度33條件下，仿刺參吞噬活力隨鹽度的升高而降低，無(wú)顯著性差異（> 0.05）。

鹽度25、27條件下，攻毒6、12、24、48 h后吞噬活力均高于0 h，攻毒6 h吞噬活力顯著升高（< 0.05）；鹽度29、31條件下，攻毒6、12、24、48 h后與0 h相比仿刺參吞噬活力先升高后降低，但差異不顯著（> 0.05）；鹽度33條件下，攻毒6、12、24 h后與0 h相比仿刺參吞噬活力無(wú)顯著性差異（> 0.05），攻毒48 h吞噬活力顯著降低（< 0.05）。

小寫(xiě)字母表示相同鹽度、不同時(shí)間差異顯著性的比較；大寫(xiě)字母表示相同時(shí)間、不同鹽度差異顯著性的比較；凡含一個(gè)相同字母者表示不同處理組間差異不顯著(P > 0.05)。

綜上，攻毒前（0 h），在25～31鹽度的范圍內(nèi)隨著鹽度的升高仿刺參吞噬活力有顯著性升高（< 0.05）。鹽度25、27條件下，攻毒后仿刺參吞噬活力在6 h顯著升高（< 0.05）；鹽度29、31條件下，攻毒6、12、24、48 h后與0 h相比仿刺參吞噬活力無(wú)顯著性差異（> 0.05）。

2.5 鹽度變化對(duì)仿刺參攻毒前后RB的影響

圖5可見(jiàn)，攻毒前（0 h）時(shí)，隨鹽度的升高，仿刺參RB無(wú)顯著性變化（> 0.05）。

鹽度25條件下，攻毒6、12、24 h后與0 h相比仿刺參RB無(wú)顯著性差異（> 0.05），48 h RB顯著降低（< 0.05）；鹽度29條件下，攻毒6、12、24 h后與0 h相比仿刺參RB無(wú)顯著性差異（> 0.05），48 h RB顯著升高（< 0.05）；鹽度27、31條件下，攻毒6、12、24、48 h后仿刺參RB 無(wú)變化規(guī)律，但有顯著性差異（< 0.05），鹽度27條件下攻毒24 h與0 h相比仿刺參RB顯著升高，鹽度31條件下攻毒12 h與0 h相比仿刺參RB顯著升高（< 0.05）；鹽度33條件下，攻毒6、12、24、48 h后與0 h相比仿刺參RB無(wú)顯著性變化（> 0.05）。

綜上，攻毒前（0 h）時(shí)，隨鹽度的升高，仿刺參RB無(wú)顯著性變化（> 0.05）。攻毒后，鹽度對(duì)仿刺參RB有顯著性影響（< 0.05），但無(wú)變化規(guī)律。

小寫(xiě)字母表示相同鹽度、不同時(shí)間差異顯著性的比較；大寫(xiě)字母表示相同時(shí)間、不同鹽度差異顯著性的比較；凡含一個(gè)相同字母者表示不同處理組間差異不顯著(P > 0.05)。

2.6 鹽度變化對(duì)仿刺參攻毒前后PO活力的影響

圖6可見(jiàn)，攻毒前（0 h），鹽度25、27、29條件下，仿刺參PO活力隨鹽度的升高而升高，鹽度29與25相比，PO活力顯著升高（< 0.05）；鹽度29、31、33條件下，仿刺參PO活力隨鹽度的升高而降低，無(wú)顯著性差異（> 0.05）。

鹽度25條件下，攻毒6、12、24、48 h仿刺參PO活力先升高后降低，6 h與0 h相比PO活力顯著升高（< 0.05）；鹽度27條件下，攻毒后48 h與0 h相比顯著升高（< 0.05）；鹽度29、33條件下，攻毒后6、12、24、48 h與0 h相比仿刺參PO活力無(wú)顯著性差異（> 0.05）；鹽度31條件下，攻毒6、12、24、48 h仿刺參PO活力先升高后降低，12 h與0 h相比PO活力顯著升高（< 0.05）。

綜上，攻毒前（0 h），鹽度25、27、29條件下，隨鹽度的升高仿刺參PO活力升高（< 0.05）。鹽度29條件下仿刺參PO活力達(dá)到最大值。攻毒后，不同鹽度下的仿刺參PO活力在不同時(shí)間點(diǎn)較0 h均有升高，但沒(méi)有規(guī)律性。

小寫(xiě)字母表示相同鹽度、不同時(shí)間差異顯著性的比較；大寫(xiě)字母表示相同時(shí)間、不同鹽度差異顯著性的比較；凡含一個(gè)相同字母者表示不同處理組間差異不顯著(P > 0.05)。

3 討論

3.1 鹽度變化對(duì)未攻毒仿刺參免疫指標(biāo)的影響

海洋生物病害的產(chǎn)生與生活環(huán)境密切相關(guān)。仿刺參是狹鹽性海洋動(dòng)物，鹽度是仿刺參養(yǎng)殖過(guò)程中重要的環(huán)境因子之一，鹽度的改變直接或間接引起海洋動(dòng)物免疫機(jī)能的改變，進(jìn)而造成病原微生物的感染。

攻毒前，各鹽度下仿刺參SOD、ACP、CAT、RB差異不顯著（> 0.05），說(shuō)明這四個(gè)免疫酶對(duì)鹽度變化不敏感，鹽度的改變不會(huì)導(dǎo)致它們產(chǎn)生顯著性變化。

攻毒前，鹽度25、27、29、31條件下仿刺參吞噬活力隨鹽度的升高而升高，說(shuō)明一定范圍內(nèi)隨著鹽度的升高仿刺參體內(nèi)吞噬細(xì)胞的吞噬能力變強(qiáng)，鹽度31條件下吞噬能力最強(qiáng)。王方雨在刺參鹽度（20、25、30）脅迫實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，刺參體腔液內(nèi)吞噬活力隨鹽度的升高而升高，與本研究結(jié)果相似[25]。鹽度33條件下，仿刺參吞噬活力降低，可能是由于仿刺參長(zhǎng)時(shí)間處于高鹽條件下細(xì)胞失水，滲透壓升高，造成仿刺參吞噬細(xì)胞吞噬能力降低。

鹽度25、27、29、31、33 條件下仿刺參PO活力，隨鹽度的升高先升高后降低，在鹽度29條件下PO活力達(dá)到最大值，說(shuō)明隨著鹽度的升高，在鹽度29條件下仿刺參免疫力最強(qiáng)。鹽度31、33條件下隨鹽度的升高仿刺參PO活力降低，可能是因?yàn)辂}度升高造成酚氧化物酶應(yīng)答系統(tǒng)受到抑制。

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從低鹽到適鹽時(shí)，鹽度升高仿刺參的吞噬能力增強(qiáng)；鹽度脅迫下，影響仿刺參的吞噬活力。也提示我們?cè)谶x擇海域養(yǎng)殖仿刺參時(shí)，選擇適宜鹽度水域，仿刺參機(jī)體免疫力最強(qiáng)，利于其生長(zhǎng)發(fā)育。另外，依據(jù)鹽度對(duì)酚氧化物酶（PO）的影響，可以選其用作監(jiān)測(cè)養(yǎng)殖海域海水適宜度的指標(biāo)。

3.2 鹽度變化對(duì)攻毒后仿刺參免疫指標(biāo)的影響

仿刺參作為海洋底棲生物，能夠在高密度病原微生物致病菌環(huán)境中生存與它特有的免疫機(jī)制不無(wú)關(guān)系[26]。其免疫系統(tǒng)主要是由體壁防御和體內(nèi)免疫共同作用。體內(nèi)免疫防御機(jī)制主要是以細(xì)胞免疫和體液免疫為基礎(chǔ)的先天性免疫，也叫非特異性免疫[27]；在免疫系統(tǒng)中，體腔液是抵抗外源病原菌的重要防線，在免疫屏障方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用；它自身可以吞噬、內(nèi)陷和清除病原微生物，也可分泌免疫因子（各種酶）來(lái)抑制殺傷病原菌[28-29]。

超氧化物歧化酶（SOD）具有抗菌、抗病毒、抗衰老等作用[26]；它既可以直接參與病原菌的殺傷，也可以清除體內(nèi)多余的自由基，起到自我保護(hù)的作用。在超氧化物歧化酶（SOD）活力的測(cè)定中，攻毒后，鹽度25條件下，在24 h前SOD活力差異不顯著（> 0.05），之后活力隨時(shí)間的延長(zhǎng)顯著降低（< 0.05），可看出當(dāng)注射燦爛弧菌后激活了仿刺參自身的免疫系統(tǒng)，免疫活性提高以抵抗致病菌的蔓延。但由于長(zhǎng)時(shí)間處于鹽度較低的環(huán)境中造成機(jī)體吸水，體內(nèi)的滲透壓降低，進(jìn)而影響了免疫相關(guān)的細(xì)胞活性，削弱了仿刺參SOD系統(tǒng)的應(yīng)答能力，導(dǎo)致SOD活性在48 h下降[28-29]。鹽度29、31條件下，攻毒后仿刺參SOD活力較鹽度25、27、33條件下活力顯著降低時(shí)間提前，說(shuō)明鹽度29、31條件下仿刺參免疫能力最強(qiáng)，且鹽度29條件下最先（6 h）顯著降低（< 0.05）（袁秀堂在鹽度對(duì)刺參呼吸和排泄影響的研究中認(rèn)為，刺參最適的生長(zhǎng)鹽度為鹽度29~31.5）[8]。鹽度27、29、31、33條件下，攻毒后仿刺參SOD活力降低，與蔣經(jīng)偉對(duì)仿刺參攻毒燦爛弧菌后，體內(nèi)SOD活力降低的結(jié)果相一致[29]；在鹽度25條件下，SOD響應(yīng)的時(shí)間較其他幾個(gè)鹽度遲緩，但也參與到免疫應(yīng)答中。無(wú)論高鹽還是低鹽環(huán)境下，感染燦爛弧菌后仿刺參體內(nèi)的SOD活力均呈下降趨勢(shì)，這與廖明玲研究仿刺參人工感染燦爛弧菌時(shí)，體內(nèi)SDO活力下降的結(jié)果相一致[30]。超氧化物歧化酶是反應(yīng)機(jī)體免疫抵抗力的重要指標(biāo)，是急性應(yīng)激類蛋白[29]；研究結(jié)果表明鹽度脅迫下，應(yīng)激活力持續(xù)升高，增強(qiáng)機(jī)體的抗菌、抗病毒、抗衰老等作用。在適宜的29、31鹽度下，可以迅速消除應(yīng)激高活力。

在海參（）的吞噬細(xì)胞中有多種溶酶體酶類，其中酸性磷酸酶（ACP）被認(rèn)為是溶酶體中的標(biāo)志酶，協(xié)助吞噬細(xì)胞完成防御外源異物入侵和消化表面帶有磷酸基團(tuán)的異物，從而達(dá)到預(yù)防感染的目的[31]；Dybas等在加州刺參（）體內(nèi)的吞噬細(xì)胞中檢測(cè)到了酸性磷酸酶[32]。在酸性磷酸酶（ACP）活力的測(cè)定中，攻毒后，其中鹽度29、31、33條件下仿刺參ACP活力首次在6 h時(shí)顯著升高，而鹽度25、27條件下仿刺參ACP活力首次在12 h顯著升高。說(shuō)明鹽度29、31、33條件下，仿刺參ACP免疫反應(yīng)更為迅速。這與叢聰和蔣經(jīng)偉的研究結(jié)果一致，叢聰和蔣經(jīng)偉在研究仿刺參體腔液抗菌性的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，仿刺參在受到燦爛弧菌刺激后，ACP活力顯著升高[33-34]。攻毒后仿刺參會(huì)產(chǎn)生一種應(yīng)激和保護(hù)反應(yīng)，加強(qiáng)自身免疫能力，在鹽度31條件下免疫應(yīng)答迅速。

仿刺參喜棲環(huán)境中分布著高密度的微生物致病菌，而仿刺參的體腔內(nèi)可以保持無(wú)菌，這與它所具有的吞噬作用不無(wú)關(guān)系。體內(nèi)的吞噬細(xì)胞可以直接或間接的對(duì)外來(lái)物進(jìn)行清除、抑制[35]。在吞噬活力的測(cè)定中，攻毒后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，鹽度29和鹽度31條件下吞噬活力無(wú)顯著性變化。細(xì)胞的吞噬活力在鹽度29時(shí)差異較小，是因?yàn)樵谶m宜環(huán)境下，仿刺參自身的免疫能力和生存狀態(tài)能夠及時(shí)抵抗外源物的入侵。鹽度25、27條件下，攻毒后仿刺參吞噬活力首次在6 h時(shí)顯著升高（< 0.05）；鹽度29、31、33條件下，攻毒6、12、24、48 h后與0 h相比仿刺參吞噬活力無(wú)顯著性差異（> 0.05）。說(shuō)明在鹽度25、27條件下，仿刺參吞噬活力能力較強(qiáng)。鹽度低時(shí)，仿刺參吞噬活力應(yīng)激能力更強(qiáng)，能夠在更短時(shí)間內(nèi)消滅等量的病原微生物。

酚氧化物酶（PO）又稱酪氨酸酶，是酚氧化酶原級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的主要組成成分，一般以無(wú)活性酶原（PPO）的形式存在[23]。系統(tǒng)作用時(shí)產(chǎn)生的中間免疫活性物質(zhì)可直接參與機(jī)體免疫，起快速清除病原菌的作用[9]。在酚氧化物酶（PO）測(cè)定中，攻毒后，在前述5個(gè)鹽度條件下，6、12、24、48 h仿刺參PO活力均高于0 h值。說(shuō)明當(dāng)燦爛弧菌入侵仿刺參時(shí)，仿刺參體內(nèi)的酚氧化物酶能夠產(chǎn)生免疫應(yīng)答。其中，鹽度25、31時(shí)，攻毒后仿刺參PO活力在12 h達(dá)到最高值后降低，而鹽度27、29、33分別在48 h、48 h和24 h達(dá)到最高值，說(shuō)明鹽度25、31脅迫下，仿刺參PO免疫能力更強(qiáng)，能夠提前啟動(dòng)酚氧化物酶原級(jí)聯(lián)系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。

綜上，仿刺參在攻毒燦爛弧菌后免疫相關(guān)酶發(fā)生了明顯的變化，其中SOD、ACP活力敏感性較其他免疫酶迅速靈敏，可以作為監(jiān)測(cè)養(yǎng)殖仿刺參是否感染燦爛弧菌的預(yù)測(cè)指標(biāo)，為仿刺參的健康養(yǎng)殖提供參考。

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Effects of Salinities on Immune-related Indicators of Sea Cucumber ()

WANG Yu-feng1, YANG Jin1, HU Ya-xiao1, ZHANG Hong-bin1, DING Jun2, WANG Luo2, QIU Xue-mei1

(1.,,116023,; 2.,116023,)

To study the effects of different salinities on immune-related indicators of sea cucumber challenged with.We randomly divided 150 sea cucumbers with an average body weight of (6.16 ± 1.86) g into 5 groups. Each group was placed in seawater with salinity 25, 27, 29, 31 and 33 for temporary cultivation. Each sea cucumber was injected with 200 μL 3.98×108CFU/mL. The cavity fluid was collected after 0, 6, 12, 24 and 48 hours and the relevant immune indicators were determined.When not challenged, there were no significant differences in superoxide dismutase (SOD), acid phosphatase (ACP), catalase (CAT), and respiratory burst (RB) at each salinity (> 0.05). Under salinity of 33, the phagocytic activity of the sea cucumber decreased as the salinity increased. Under salinity of 25, 27 and 29, PO activity increased significantly with the increase of salinity (< 0.05). Under salinity of 31 and 33, PO activity decreased with increasing salinity. After challenge, SOD activity changed apparently. Under salinity of 25, 27, and 33, SOD activity decreased significantly at 48 h (< 0.05). Under salinity of 29 and 31, the time for SOD activity to decrease significantly was advanced. ACP changed obviously after challenge. Under salinity of 25 and 27, ACP activity increased significantly at 12 h (< 0.05). Under salinity of 29, 31, and 33, ACP activity increased significantly at 6 h (< 0.05). The change in CAT activity is irregular. Under salinity of 25 and 27, the phagocytic activity of sea cucumber was increased significantly after challenge (< 0.05). Under salinity of 29 and 31, there was no significant difference in phagocytic activity between 6, 12, 24, 48 h and 0 h (> 0.05). The salinity had a significant effect on the RB of the sea cucumber (< 0.05), but the change was irregular. After challenge, the PO activity of the sea cucumber in different salinities increased compared with 0 h, but there was no regularity.The effect of salinity on the phagocytosis activity and PO activity of sea cucumbers can provide a basis for selecting appropriate salinity water for sea cucumber breeding. After challenge, the SOD activity and ACP activity of the sea cucumber have quick responses.

;immune-related enzymes; salinity;

Q175

A

1673-9159（2020）03-0022-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.03.004

2019-09-19

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)（SQ2017YFSF070158）

王玉鳳（1993－），女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)楹Ｑ笊飳W(xué)。E-mail: wangyufeng0901@outlook.com

仇雪梅（1964－），女，博士，教授，主要研究方向?yàn)楹Ｑ笊飳W(xué)。E-mail: xmqiu@dlou.edu.cn

王玉鳳，楊金，胡雅瀟，等. 鹽度對(duì)仿刺參免疫指標(biāo)的影響[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，40（3）：22-29.