陳榮梅，蔣偉東，蔣備戰(zhàn)

(1.同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院兒童口腔醫(yī)學(xué)教研室，上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，上海 200072；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科教研室，南寧 530021)

氟斑牙是牙齒在發(fā)育礦化期機(jī)體攝入過量的氟化物而導(dǎo)致的成釉細(xì)胞損傷，釉基質(zhì)礦化障礙而表現(xiàn)出牙齒發(fā)育異常，在臨床上表現(xiàn)為牙齒失去正常的光澤，出現(xiàn)白堊色、著色、多孔樣病變[1]，影響牙齒的美觀和功能，給患者的身心和生活質(zhì)量帶來影響。氟斑牙一旦發(fā)生，臨床治療主要是冷光美白、釉質(zhì)微打磨、樹脂貼面及全冠進(jìn)行有創(chuàng)修復(fù)，而這些臨床操作帶來不同程度的牙齒損傷。多年來學(xué)者們一直在尋找方法減少氟斑牙的發(fā)生，以往研究表明，硒對過量氟化物導(dǎo)致的肝臟、腎臟、腦等氟中毒的損傷具有拮抗作用[2-4]，其拮抗機(jī)制可能通過調(diào)整細(xì)胞凋亡與自噬來實(shí)現(xiàn)。為進(jìn)一步研究硒對氟斑牙是否同樣具有拮抗作用，本研究通過建立ICR小鼠氟斑牙模型，在飲用水中同時(shí)加入氟化鈉和亞硒酸鈉來觀察硒對氟斑牙的拮抗效果，并通過免疫組化檢測Beclin1在各組切牙成釉細(xì)胞中的表達(dá)差異，初步探討自噬在硒拮抗氟斑牙的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)所用ICR小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；H-E試劑盒(No: KGA 224)購自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司；兔多克隆抗體Beclin1(PB0014)、即用型SABC試劑盒(SA-1021)、DAB顯色試劑盒(BM3847)購自武漢博士德生物工程有限公司。主要實(shí)驗(yàn)器材：組織處理儀(STP 120)購自美國Thermo Fisher公司，石蠟包埋機(jī)(LEICA EG 1150 H)、石蠟切片機(jī)(LEICA RM2235)、烤片機(jī)(LEICA HI 1220)購自德國Leica公司，立體顯微鏡(Stemi508)購自德國Carl Zeiss公司，數(shù)碼顯微鏡(Eclipse 80i)購自日本Nikon公司，μCT-50購自瑞士Scanco Medical公司。

1.2 氟斑牙模型建立與分組

1.2.1 氟斑牙模型的建立與分級 選用上海史萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供的SPF級2月齡雄性ICR小鼠36只，體重22～25g。經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，在預(yù)實(shí)驗(yàn)及前期課題組實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，隨機(jī)分為3組，每組12只，基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。對照組：實(shí)驗(yàn)室凈水儀提供的去離子水(ddH2O)；氟化鈉組：200mg/L氟化鈉配制去離子水溶液；硒組：200mg/L NaF+2mg/L Na2SeO3配制去離子水溶液。喂養(yǎng)8周，根據(jù)小鼠下頜切牙釉質(zhì)的透明度、白堊色斑塊、缺損等不同程度的變化，采用11級分級標(biāo)準(zhǔn)[5]記錄氟斑牙的發(fā)生情況，將1～3級定為極輕度氟斑牙，4～5級定為輕度氟斑牙，6～8級定為中度氟斑牙，9～10級定為重度氟斑牙。

1.2.2 下頜切牙牙齒增長率 實(shí)驗(yàn)第1天和實(shí)驗(yàn)結(jié)束(8周)，使用游標(biāo)卡尺測量小鼠下頜切牙齦緣最低點(diǎn)至切緣最高點(diǎn)的垂直距離，分別記為T1和T2，計(jì)算下頜切牙增長率(%)[6]。

1.3 micro-CT掃描

小鼠下頜骨分離后置于4%多聚甲醛固定 48h 后，進(jìn)行micro-CT掃描分析。圖像數(shù)據(jù)采用Mimics 13.0軟件重建分析。影像學(xué)分析指標(biāo)：以第一磨牙、第二磨牙牙尖平行為參照進(jìn)行三維重建，計(jì)算其唇側(cè)硬組織厚度(L/mm)及面積(BS/mm2)。

1.4 H-E染色方法

常規(guī)方法脫蠟至水，滴加蘇木精染液染色 5min，水洗，返藍(lán)10min，滴加伊紅染液20s，水洗2～3s，沖洗掉多余染液后放入梯度乙醇中脫水，置于二甲苯中，封片，鏡檢拍照。

1.5 免疫組化染色方法

本實(shí)驗(yàn)采用SABC法進(jìn)行Beclin1的免疫組化染色。具體操作：常規(guī)脫蠟至水；0.2% Triton X-100室溫孵育10min裂解細(xì)胞膜；3%過氧化氫溶液室溫孵育10min以滅活組織中的內(nèi)源性過氧化物酶；將切片浸沒于枸櫞酸鈉緩沖溶液中，微波爐熱修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，常溫徹底冷卻，重復(fù)3次；5% BSA室溫孵育30min；加入一抗兔多克隆抗體，4℃孵育過夜；室溫生物素鼠抗兔IgG二抗孵育20min；滴加SABC(鏈霉親和素標(biāo)記的過氧化物酶)反應(yīng)，室溫20min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染。中性樹膠封片劑封片，鏡檢拍照[7]。陰性對照以山羊血清代替一抗。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 23.0軟件，利用Student’st檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用ImageJ 1.52t對免疫組化結(jié)果進(jìn)行灰度值的測定。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同組別小鼠切牙的形態(tài)學(xué)改變

對照組切牙發(fā)育良好，有光澤，透明度好，實(shí)驗(yàn)過程無明顯變化(圖1A)。氟化鈉組小鼠隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長，牙面由棕黃色逐漸呈現(xiàn)淡黃色，4周時(shí)出現(xiàn)明顯的著色不均，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，呈白堊色改變，牙面粗糙，呈現(xiàn)中度的氟斑牙癥狀(100%)，下頜切牙較對照組短，且切端磨耗較重，未露髓(圖1B)。硒組下頜切牙形態(tài)、色澤與正常組接近，氟斑牙分級介于正常與極輕度之間，其切端可見輕度磨耗(圖1C)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，小鼠氟斑牙分級和小鼠下頜切牙增長率見表1，硒組下頜切牙增長率與正常組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；氟化鈉組與正常組、硒組與氟化鈉組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 3組小鼠下頜切牙氟斑牙形成的分級評分和增長率

圖1 小鼠下頜切牙不同組別的差異

2.2 micro-CT分析

2月齡小鼠喂養(yǎng)8周后取小鼠下頜骨，固定后進(jìn)行micro-CT掃描分析，對照組小鼠切牙唇側(cè)硬組織最厚(圖2A、E)，氟化鈉組小鼠切牙牙唇側(cè)硬組織正常組最薄(圖2B、F)，硒組介于其余兩組之間(圖2C、G)。3組間唇側(cè)硬組織厚度和面積比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2D、H。

圖2 micro-CT三維重建后3組小鼠切牙唇側(cè)硬組織厚度以及面積的比較(標(biāo)尺: 1.0mm)

2.3 成釉細(xì)胞在3組中排列方式的差異

正常組小鼠成釉細(xì)胞呈柵欄狀排列，胞核位于基底部，極性明顯(圖3A)；氟化鈉組成釉細(xì)胞排列紊亂，見空泡性改變(圖3B)；硒組與正常組成釉細(xì)胞排列相似，胞核位于基底部，呈柵欄狀排列(圖3C)。而有趣的是3組成牙本質(zhì)細(xì)胞的極化與排列基本一致，未見明顯差異。

圖3 3組小鼠切牙成釉細(xì)胞H-E染色(×100)

2.4 Beclin1在3組小鼠切牙成釉細(xì)胞中的表達(dá)差異

Beclin1在3組小鼠切牙成釉細(xì)胞中的表達(dá)趨勢基本一致，3組小鼠切牙成釉細(xì)胞從分泌期到成熟期Beclin1的陽性表達(dá)逐漸增強(qiáng)，但氟化鈉組的表達(dá)最為明顯，硒組的陽性表達(dá)趨勢與對照組基本接近(圖4A、B、C)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4D)；在分泌前期氟化鈉組Beclin1在成釉細(xì)胞中的表達(dá)明顯強(qiáng)于另外兩組，且在星網(wǎng)狀層中表達(dá)也很明顯(圖4E、F、G)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4H)；分泌期Beclin1在成釉細(xì)胞中正常組(圖4I)和硒組(圖4K)表達(dá)趨勢基本一致，成釉細(xì)胞全層均有表達(dá)，但氟化鈉組(圖4J)在中間層細(xì)胞表達(dá)組較另外兩組明顯，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4L)。成熟期中Beclin1在3組中成釉細(xì)胞全程均有表達(dá)，在氟化鈉組，由于成釉細(xì)胞排列紊亂，部分區(qū)域呈空泡狀，此處未檢測到Beclin1的表達(dá)，但其余部分高于正常組，這種現(xiàn)象雖在硒組中也有發(fā)現(xiàn)，但相對較少，表達(dá)量低于氟化鈉組(圖4I、J、K)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4P)。

圖4 Beclin1 3組小鼠切牙成釉細(xì)胞中表達(dá)

3 討 論

根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)，飲水中氟離子最高濃度為1.5～1.7mg/L，當(dāng)長期攝入氟量過多時(shí)，則發(fā)生氟中毒[3]。硒作為機(jī)體必需的微量元素，參與機(jī)體多種酶的合成，可提高機(jī)體免疫力，調(diào)節(jié)機(jī)體代謝，具有清除自由基和高抗氧化活性的功效，被稱為“天然解毒劑”[8]，但攝入量過多則造成硒中毒。課題組通過文獻(xiàn)回顧[2-4,6]及前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，200mg/L氟化鈉可以成功構(gòu)建飲水型小鼠氟斑牙模型。同時(shí)，在本次的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置了2、4mg/L亞硒酸鈉水溶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低濃度硒可以達(dá)到很好的拮抗氟中毒效果[9]。本實(shí)驗(yàn)通過同時(shí)喂養(yǎng)小鼠氟離子與硒離子混合水溶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硒組小鼠切牙的生長變化與正常組無明顯差異，而氟斑牙組在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)均發(fā)生典型的氟斑牙癥狀，表現(xiàn)為小鼠切牙切斷耗、變短，唇側(cè)牙釉質(zhì)呈白堊色改變。micro-CT結(jié)果顯示，氟化鈉組切牙唇側(cè)硬組織厚度比對照組薄，硒拮抗組介于兩者之間。H-E染色結(jié)果顯示，氟化鈉組成釉細(xì)胞排列紊亂，極性消失；而對照組與硒拮抗組成釉細(xì)胞呈柵欄狀，排列整齊規(guī)則。以上結(jié)果表明，氟離子干擾牙釉質(zhì)的形成，2mg/L亞硒酸鈉可以減輕過量氟離子對小鼠切牙的危害，但是否為最適濃度，還需要實(shí)驗(yàn)證實(shí)，也是課題組下一步的實(shí)驗(yàn)方向。

自從氟斑牙被證明是由于機(jī)體攝入過多氟所致[10]，各國學(xué)者對氟斑牙的發(fā)病機(jī)制展開廣泛研究，并提出一些可能機(jī)制，包括對基質(zhì)生物合成及分泌的影響、對基質(zhì)蛋白及蛋白酶的直接作用、氧化應(yīng)激反應(yīng)影響[11-12]等。有文獻(xiàn)提出，氟化鈉可以通過自噬進(jìn)而調(diào)節(jié)根尖牙乳頭細(xì)胞成牙和成骨分化[13]，同時(shí)，也有文獻(xiàn)表明，硒對過量氟離子的抑制功能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和自噬發(fā)揮作用[2-4]。由此，課題組大膽推測，硒對氟斑牙的拮抗效果也是通過協(xié)同或抑制作用發(fā)生的。自噬是細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)過程，是真核細(xì)胞特有的生命現(xiàn)象，自噬可在饑餓、缺氧、感染、老化和氧化應(yīng)激等各種應(yīng)激條件的刺激下被激活，是細(xì)胞對對內(nèi)外環(huán)境壓力變化的一種反應(yīng)，是一種細(xì)胞程序性死亡方式(Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡)[14]。Beclin1是細(xì)胞自噬的關(guān)鍵調(diào)控因子，是檢測自噬發(fā)生的關(guān)鍵標(biāo)志之一。大量實(shí)驗(yàn)研究表明，過量氟離子促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生。Yang等[15]提出，Beclin1可能在自噬與凋亡中有著至關(guān)重要的橋梁作用，參與了氟斑牙自噬過程中的調(diào)控；Lei等[16]發(fā)現(xiàn)氟化鈉促進(jìn)分泌期成釉細(xì)胞Beclin1的表達(dá)，且與氟劑量呈正相關(guān)，但該研究沒有分析分泌前期和成熟期成釉細(xì)胞中Beclin1的表達(dá)。此外，也有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)適量硒對小鼠氟斑牙有一定拮抗作用[17]，但對其機(jī)制并沒有進(jìn)行研究。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Beclin1在氟化鈉組的表達(dá)無論在分泌前期、分泌期及成熟期的特異性表達(dá)明顯高于正常組，而且也較硒組明顯，說明自噬參與了氟斑牙的形成過程。硒組Beclin1的表達(dá)與正常組空間表達(dá)相似，這提示硒離子可能通過拮抗氟誘導(dǎo)的成釉細(xì)胞的自噬而達(dá)到拮抗的效果。

綜上所述，適量濃度的硒離子對過量氟引起的小鼠氟斑牙確實(shí)存在一定的拮抗作用，自噬可能參與其中，但相關(guān)機(jī)制及硒離子拮抗氟的最適濃度還有待深入研究。