劉業(yè)學 王穩(wěn)航

（1 天津科技大學食品科學與工程學院 天津300457 2 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室 天津科技大學生物工程學院 天津300457）

肉是一種兼具美味與口感并且營養(yǎng)豐富的動物源性食品。當今社會，肉不僅是人們健康飲食的重要組成部分，也是一類重要的工業(yè)產(chǎn)品，與人們的生活息息相關(guān)。 “肉”一般指豬、牛、羊等牲畜及禽類（有時也包括野味，而水產(chǎn)類一般排除在外）宰殺后肉尸的去骨部分以及可食的內(nèi)臟、 皮和脂肪組織等，狹義上以骨骼肌為主。肉類是人類蛋白質(zhì)的重要來源，富含多種微量元素和維生素，具有平衡膳食、增強體能的作用。 然而，一些研究表明肉類的不當加工和過量食用會對人體健康產(chǎn)生潛在的不良影響。

同大多數(shù)生物材料一樣，肉是一種多組成、多層次、各向異性的結(jié)構(gòu)體，其中所含的肌肉組織、結(jié)締組織和脂肪組織均起源于中胚層， 經(jīng)過一個復雜的生長與發(fā)育過程逐漸形成。動物屠宰后，肉需經(jīng)過宰后成熟、物理加工和熱處理3 個階段，才能成為被人們直接消費的肉制品。 在這個過程中原有肌肉的組織結(jié)構(gòu)會發(fā)生很大變化， 從而形成結(jié)構(gòu)迥異的不同肉類產(chǎn)品。

由于存在全球人口數(shù)量增加， 對糧食需求壓力增大，生產(chǎn)肉類對環(huán)境的不利影響，過度加工肉制品的潛在健康危害以及人們對新型食品的追求等諸多原因， 使得利用其它蛋白資源和相關(guān)技術(shù)模擬肉的色澤、風味和口感以開發(fā)仿肉產(chǎn)品，具有重要的社會意義。 生物體內(nèi)肌肉的生成是一個自組織（Self organization）過程，是建立在從分子水平到細胞器、細胞、器官和有機體的復雜層次結(jié)構(gòu)的基礎上， 由多個具有交互規(guī)則的系統(tǒng)在空間和時間上組織的過程。 雖然人們對此過程以及相關(guān)機理仍不清楚， 但是通過利用已知的食品大分子的熱力學性質(zhì)，包括無序分離、自組裝（Self assembly）等，以及外力輔助成型技術(shù)如螺桿擠出、紡絲等， 可以開發(fā)具有不同組織結(jié)構(gòu)的人造肉產(chǎn)品，如植物蛋白肉。 另外，直接利用生物合成系統(tǒng)可以生產(chǎn)高質(zhì)量的人造肉產(chǎn)品，其中菌蛋白（Myoprotein）已經(jīng)商業(yè)化；利用動物細胞真正合成肌肉組織已在實驗室取得成功。 這些研發(fā)成果豐富了人造肉的多樣性， 對推動人造肉產(chǎn)業(yè)發(fā)展起到重要作用。

如何開發(fā)質(zhì)地逼真、營養(yǎng)豐富、安全衛(wèi)生的人造肉產(chǎn)品， 在人們對健康食品具有迫切訴求的當今社會既是機遇又是挑戰(zhàn)。 本文從肌肉的結(jié)構(gòu)組成和發(fā)生機制出發(fā)， 針對肉制品的質(zhì)地和感官品質(zhì)的貢獻性，引入仿生學概念，評價目前已應用或具有潛在應用前景的人造肉生產(chǎn)策略與技術(shù)，并對未來的人造肉仿生技術(shù)進行展望， 為開發(fā)質(zhì)地紋理與組織結(jié)構(gòu)更為逼真的高質(zhì)量人造肉， 拓展健康仿生食品的研究與開發(fā)提供參考。

1 肉的結(jié)構(gòu)和生成

1.1 肉的形態(tài)結(jié)構(gòu)

骨骼肌是動物機體最大的組織， 具有收縮功能，是肉的重要來源，占產(chǎn)肉動物胴體體重的35%～65%。 骨骼肌由大約90%的肌纖維以及10%的結(jié)締組織和脂肪組織組成（圖1），其包括水分75%，蛋白質(zhì)19%，脂肪2.5%，碳水化合物1.2%，含氮浸出物1.65%，無機物0.65%[1]。 作為一種復雜的生物組織， 肌肉由存在于復雜結(jié)締組織網(wǎng)絡中高度收縮的肌原纖維結(jié)合形成， 其與結(jié)締組織相互交叉融合形成應力和粘連， 直接或間接地與骨骼相連。肌肉是一類典型的復雜黏彈性體，既具有固體的彈性性質(zhì)，又呈現(xiàn)液體的黏性性質(zhì)。

每塊肌肉的構(gòu)造基本相同，由外到內(nèi)依次為：肌肉→肌束→肌纖維（肌細胞）→肌原纖維→肌節(jié)（肌動蛋白和肌球蛋白）。如圖2 所示，整塊肌肉的外表面由一層結(jié)締組織——肌外膜包裹。在內(nèi)部，每塊肌肉被另一層結(jié)締組織即肌束膜（或稱肌間膜）分隔成肌束，肌束直徑可達1～5 mm，在橫切肌肉時肉眼可見（圖1）。 每個肌束由許多單獨的肌纖維組成， 肌束間被第3 層結(jié)締組織——肌內(nèi)膜隔開。單個肌纖維是多核細胞，通常直徑為20～80 μm，結(jié)構(gòu)復雜，是肌肉的最基本單位（圖2）。

圖1 肉的外觀形態(tài)與結(jié)構(gòu)組成Fig.1 The meat appearance and structure

圖2 肌肉的組織結(jié)構(gòu)示意圖[1]Fig.2 Schematic diagram of muscle tissue structure[1]

1.2 肉的生成機制

肌肉發(fā)育和生長可以分為3 個階段：1）肌肉及相關(guān)組織的胚胎細胞的形成；2）肌肉胚胎細胞的發(fā)育；3）分化后肌細胞的生長。 一般來說，分化階段1）和2）決定每塊肌肉的肌細胞數(shù)量，而分化后階段3）則主要負責肌肉的生長，即通過實現(xiàn)分化后肌纖維的體積增大，也就是肥大（Hypertropy）實現(xiàn)的。某些情況下，肌肉纖維數(shù)量也可以在肌細胞分化后增加或減少（肌細胞被破壞）。 脊椎動物的肌肉組織、 結(jié)締組織和脂肪組織的形成與發(fā)育均起源于中胚層， 分別由中胚層祖細胞和充質(zhì)干細胞分化成肌細胞、成纖維細胞和脂肪細胞。肌生成是指胚胎發(fā)育過程中肌纖維的形成， 而脂肪生成和纖維生成分別是指脂肪細胞和成纖維細胞的形成。

肌纖維、 結(jié)締組織和脂肪細胞的數(shù)量不僅受物種、性別、品種、基因和表觀遺傳等因素影響[2]，也受到營養(yǎng)水平、肌肉活動（鍛煉）、應激激素（皮質(zhì)類固醇，如皮質(zhì)醇和腎上腺素）和生長促進因子等因素的影響， 這共同決定了肌肉的形態(tài)多樣性和結(jié)構(gòu)復雜性。 盡管人們對肌肉的基本結(jié)構(gòu)和相關(guān)組成已有了解， 還在不斷地探索肌肉組織的復雜性和可塑性， 以及相關(guān)的信號因子和調(diào)節(jié)機制[3]。

2 “人造肉”的開發(fā)與仿生技術(shù)

2.1 生物構(gòu)建與仿生技術(shù)

肉類過度消費造成的環(huán)境污染、 動物福利缺失以及潛在的營養(yǎng)健康問題， 引起人們越來越多的關(guān)注與擔心。 而肉作為一種集口感、美味、營養(yǎng)于一體的重要食物， 深深地根植于人們的飲食體系之中，對于人類的飲食具有重要意義。人們開始利用其它蛋白資源與技術(shù)模仿肉的結(jié)構(gòu)、形態(tài)、質(zhì)地、風味，開發(fā)人造肉，以滿足消費者的需要。 其中，如何實現(xiàn)對肉的形態(tài)結(jié)構(gòu)與質(zhì)地組織的模仿，一直以來都是一個重要的問題。

人類作為自然界食物鏈的最頂端， 其食物全部來源于其它生物，包括動物、植物和微生物及其代謝產(chǎn)物。 任何一種天然食物包括肉食都是由分子的一級、二級及高級結(jié)構(gòu)，通過層層組裝，從納米、微米尺寸，最終到宏觀可見的具有各向異性的結(jié)構(gòu)體。這些結(jié)構(gòu)復雜、層次分明的生物材料不僅決定了它們獨特的屬性和功能， 而且直接決定其食用品質(zhì)。這歸因于大自然的饋贈，其在溫和條件（涉及溫度、pH 以及離子強度等）和常壓條件下的水相環(huán)境中創(chuàng)造了一套通用的多組分、 多層次材料設計規(guī)則，包括分子組裝、納米控制、各向異性和高度有序的2D 和3D 結(jié)構(gòu)，形成了組分-結(jié)構(gòu)-功能的有序統(tǒng)一[4]。

細胞結(jié)構(gòu)及組織構(gòu)建不僅是生物體的基本構(gòu)建模塊，也是整個復雜系統(tǒng)的集合，這激發(fā)了許多領(lǐng)域包括食品科學領(lǐng)域在內(nèi)的仿生學的發(fā)展[5]。仿生大體可分為3 個層次：1）Bionics，指通過模仿生物系統(tǒng)的功能和行為，達到建造技術(shù)系統(tǒng)，它打破了生物和機器的界限， 將各種不同的系統(tǒng)溝通起來；2）Biomimetics，為模仿并嚴格復制的存在于自然的東西；3）Bioinspiration， 指仿生產(chǎn)品或過程只能部分模仿或啟發(fā)， 使得仿生領(lǐng)域范圍更大、更廣。在食品加工領(lǐng)域中，大部分仿生僅限于第3 層次。

隨著納米技術(shù)的發(fā)展和對生物材料的層次組裝的不斷闡析， 人們開始加強對仿生材料制備過程中不同尺寸和維度的調(diào)整與控制， 形成以納米為中心的從分子-納米-微米-宏觀的自下而上（bottom-up）途徑的仿生材料設計策略，如圖3 所示[6]。而這種策略可以通過食品大分子組裝或直接利用生物反應器完成， 同時也適用于人造肉的開發(fā)。

圖3 多尺度仿生材料的構(gòu)建策略[6]Fig.3 Construction strategy of multi-scale bionic materials[6]

2.2 肉制品的多樣性與可模仿性

從原料肉到肉制品要經(jīng)過宰后成熟、 物理加工和熱處理3 個階段。 首先，畜禽在宰殺后，肌肉組織在蛋白酶的作用下發(fā)生部分水解， 使得肉質(zhì)變軟，成熟。 同時，熱處理會對肉的組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[7]：熱處理開始時肌纖維蛋白變性，導致肉收縮、失水和增韌，接著膠原蛋白變性，發(fā)生凝膠化和溶解，肉原有結(jié)構(gòu)不斷被破壞，肉質(zhì)變得越來越嫩，更容易咀嚼。此外，在加工過程中，原料肉經(jīng)腌漬、滾揉、切碎、斬拌等工藝，肌纖維蛋白不斷溶出，組織形態(tài)發(fā)生更大變化，甚至有些肌纖維完全消失，從而形成組織結(jié)構(gòu)迥異的肉類產(chǎn)品。根據(jù)組織形態(tài)與內(nèi)部結(jié)構(gòu)的不同， 目前市場上的肉制品可基本可分為重組類和原肉類2 大類， 其組織結(jié)構(gòu)及可模仿性見表1。

表1 不同肉制品的結(jié)構(gòu)屬性與可模仿性比較Table 1 Comparison of structural properties and imitability of different meat products

3 人造肉的纖維成型技術(shù)

由于肌肉成分的多樣性、 結(jié)構(gòu)的多層次尤其是復雜的各向異性， 以及表現(xiàn)出特有的黏彈性等材料屬性， 因此實現(xiàn)真正意義上與肌肉結(jié)構(gòu)一致的人造肉依靠目前的科技發(fā)展水平， 短期內(nèi)甚至很長一段時間內(nèi)難以實現(xiàn)。 由于肉的結(jié)構(gòu)組成在加工過程中的變化以及人們對不同肉制品的特有質(zhì)構(gòu)和口感的需求差異， 相對降低了人造肉開發(fā)的技術(shù)難度。 蛋白質(zhì)的各向異性纖維成型技術(shù)是人造肉的關(guān)鍵， 這對于仿原肉類和粗凝膠類產(chǎn)品（表1）尤為重要。 最近，Dekkers 等[8]綜述了人造肉的結(jié)構(gòu)化過程，并按自上而下（top-down）和自下而上（bottom-up）2 條途徑，詳細列出已應用或有潛在應用的纖維成型技術(shù)， 并闡述其尺寸的控制問題。 江南大學陳堅院士團隊對人造肉的商業(yè)化技術(shù)和細胞培養(yǎng)肉也進行了相應的歸納總結(jié)[9-10]。

根據(jù)表1 所述不同肉制品的組織形態(tài)和感官特性， 結(jié)合實際蛋白組織化的技術(shù)原理與具體機制，將人造肉仿生技術(shù)分為以下3 類：蛋白質(zhì)的自組裝技術(shù)、 外力輔助成型技術(shù)和細胞培養(yǎng)（自組織）技術(shù)。

3.1 自組裝技術(shù)

生物體內(nèi)肌肉的組裝涵蓋了從分子-納米-微米-宏觀的所有尺寸，最終形成高黏彈性的固態(tài)結(jié)構(gòu)體。而在實際食品加工體系中，由于蛋白質(zhì)的低溶解度，所使用的濃度通常比較低，即使能夠成形成高濃度的分散體系， 也無法形成具有組織狀的各向異性結(jié)構(gòu)體， 所以最為簡便的方法是通過相分離將蛋白從溶液中凝聚出來并組裝成不同形態(tài)尺寸，甚至是納米尺寸的蛋白纖絲，或者通過添加外源的不同尺寸的纖維狀物質(zhì)使其蛋白體系具有豐富的纖維紋理和質(zhì)地，以實現(xiàn)仿肉制品的生產(chǎn)。食品蛋白質(zhì)無論是單一體系還是復合體系， 大多數(shù)為熱力學不穩(wěn)定體系，易受到各種因素影響，如溫度、pH、壓力、離子強度和濃度，極易出現(xiàn)相分離現(xiàn)象，而導致蛋白質(zhì)以多種形態(tài)出現(xiàn)（圖4）。 其中， 球狀蛋白如大豆蛋白等是用于仿肉制品開發(fā)的主要蛋白質(zhì)，其在天然狀態(tài)下水溶性較好，通常先通過熱處理使球狀蛋白變性， 內(nèi)部疏水基團暴露而使蛋白分子間易于聚合，降低其溶解度，再結(jié)合其它外界條件，促進其相分離，形成最終的結(jié)構(gòu)和紋理。

圖4 球蛋白的不同狀態(tài)圖[11]Fig.4 Illustration of a state diagram for a globular protein[11]

3.1.1 無序凝聚 在單一蛋白體系中， 可以通過調(diào)節(jié)pH 和增加離子強度使蛋白質(zhì)生成肉眼可見的沉淀，從而使產(chǎn)物組織化，如加熱后的豆?jié){加入鈣或鎂離子生成沉淀，通過擠壓形成豆腐。 另外，食品復合體也經(jīng)常出現(xiàn)相離現(xiàn)象， 如通過蛋白質(zhì)與多糖的相互作用等形成食品生物聚合物。 尤其是蛋白質(zhì)和多糖，易發(fā)生自組裝，形成復雜的多組分多相結(jié)構(gòu)，被用于結(jié)構(gòu)組織化。 例如，將蛋白質(zhì)與海藻酸鈉混合液中加入多價陽離子， 可生成纖維狀聚合體， 通過清洗可生成生干物質(zhì)含量為40%～60%的產(chǎn)品[12]。 這些反應往往由于反應速度過快導致蛋白質(zhì)分子來不及折疊成有序結(jié)構(gòu)，這些組織化往往在微觀結(jié)構(gòu)上呈無序的無定形態(tài)，難以實現(xiàn)仿肌肉纖維的效果。

另外， 冷凍過程中冰晶的生長會產(chǎn)生富溶質(zhì)相和寡溶質(zhì)相（冰晶），使得蛋白質(zhì)產(chǎn)生各向異性的結(jié)構(gòu)， 再通過冷凍干燥或通過蛋白質(zhì)預先生成不可溶凝膠，也可利用常溫或加熱溶解冰晶，使水分流出， 以獲得具有片狀平行方向的多孔微觀結(jié)構(gòu)。通過控制冰點的溫度和速度調(diào)整冰晶的大小，很明顯的是，其結(jié)構(gòu)組織化是在較大尺寸（以肉眼可見的結(jié)構(gòu)為主）上進行的[13]。

3.1.2 分子自組裝 實際上， 以納米為基礎的小尺寸蛋白質(zhì)分子的自組裝已開始引起食品研究人員的興趣。 更多的研究表明通過對蛋白質(zhì)的相分離實現(xiàn)精確控制，可制備納米尺寸的微球、球狀物和纖維， 而其中淀粉樣蛋白纖絲 （Amyloid like protein fibril）最為引人關(guān)注。據(jù)報道，迄今已有23種食物蛋白可在一定條件下組裝成淀粉樣蛋白纖絲， 其通常的制備方法是將蛋白在遠低于其變性的條件下加熱數(shù)小時（通常為80～90°C，pH 2，不加鹽，300 r/min，5～24 h）[14]。 在這個過程中，球蛋白分子可在溫度或pH 等外界條件改變的情況下，通過將其內(nèi)部結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)樯煺範顟B(tài)， 從而暴露出易于聚集的區(qū)域（疏水基團），觸發(fā)蛋白質(zhì)聚集，形成蛋白纖絲， 導致蛋白質(zhì)進入熱力學穩(wěn)定的最有利狀態(tài)（淀粉樣蛋白纖絲的能量最低）。 所組裝的蛋白纖絲的結(jié)構(gòu)受pH、離子強度、溫度和蛋白濃度等熱力學不穩(wěn)定因素的顯著影響， 同時也會受到動力學因素如時間等的制約。值得注意的是，受包括反應時間等因素在內(nèi)的大多數(shù)不精確控制條件的影響，蛋白質(zhì)往往形成其它的形態(tài)，如前面提到的無序凝聚形態(tài)。另外，一些蛋白質(zhì)水解也會產(chǎn)生蛋白纖絲[15]。 一些研究表明，食品蛋白纖絲確實改善了蛋白質(zhì)原有的加工性能[16]，比如，乳清來源的蛋白纖絲膜，與乳清蛋白膜相比，其機械強度有了明顯提高[17]。 然而，需要更多的研究來確定蛋白纖絲在復雜的食品系統(tǒng)中的確切作用， 以及它們自身是否能夠抵抗食品加工過程中的外力沖擊[16]。目前沒有研究表明這些由蛋白質(zhì)分子自組裝而成的蛋白纖絲可以進一步生長成更高尺度的纖維，如毫米以上達到肉眼可見的規(guī)格， 這也可能會制約其在食品中，尤其是人造肉中的應用。

3.1.3 纖維塑形 不同尺寸的纖維添加于高濃度的聚合物體系對所形成的復合材料性能起到顯著的提升作用， 包括提高聚合物的非平衡玻璃態(tài)或凝膠特性，以及最終產(chǎn)品的黏彈性和機械強度[18]。肉制品是一種高黏彈性的結(jié)構(gòu)體， 利用天然生物來源纖維與非肉蛋白混合制備形成仿肉制品是一種簡單、有效的人造肉生產(chǎn)技術(shù)。 大量的植物、藻類、食用菌以及動物（如外骨骼中的甲殼素）中富含多糖類纖維， 通常在農(nóng)副食品加工過程中被廢棄，而這些廢棄物可通過機械粉碎、高壓均質(zhì)等工藝制備成不同尺寸（納米、微米、肉眼可見）的高長徑比的食品級纖維。 這些纖維通常具有較強的機械強度，可以滿足仿肉制品的黏彈性要求。 另外，由于其長徑比高， 所以能夠形成仿肉制品的纖維狀紋路與質(zhì)地。目前適宜的纖維主要有蘑菇纖維、甲殼素纖維以及纖維素纖維。其中，食用菌與肉相似的口感和悠久的食用歷史，以及簡單、低能耗的制備工藝， 使蘑菇纖維用于人造肉的工業(yè)化生產(chǎn)可行性更強[19]。 另外，研究表明納米纖維素能夠增強蛋白凝膠的強度；并且，由于其具有脂肪類似物的特性[20-21]，可用于提高最終產(chǎn)品的保水性，預計隨著其食用安全性的確定以及作為食品配料的市場準入，在人造肉市場會有很好的應用。而這些纖維由于其具有較高的彈性模量， 通常會增強產(chǎn)品的硬度，可能無法提供蛋白纖維特有的口感，需要與其它非肉蛋白凝膠配合使用。

納米級外源纖維的加入可能會從微觀上影響蛋白質(zhì)體系的整體結(jié)構(gòu)。同時，在納米蛋白纖絲的制備過程中， 可在蛋白溶液中加入預形成的蛋白纖絲，起到種子化作用，這不僅可以加速纖絲的形成，而且有望調(diào)節(jié)纖絲的聚集度和性能[16]。 與此相類似的是，已證明高強度、高長徑比的納米纖維素對生物凝膠具有定向調(diào)控作用， 能夠形成具有各向異性及不同力學性能的結(jié)構(gòu)[22]。

3.2 外力輔助成型技術(shù)

實際上很多情況下蛋白濃度往往高于前面所述的自組裝所需的濃度， 在受到外界作用影響的情況下， 蛋白質(zhì)聚集可能不會導致明顯的相分離現(xiàn)象（如形成沉淀），而是形成凝膠或高黏稠體，這在以熱處理和機械加工為主的食品加工中最為常見[13]。 這些高粘稠體系或凝膠，在受到攪拌、振蕩、擠壓和切割等機械處理時， 剪切產(chǎn)生的應力可以使其變形， 通過除去溶劑或直接固化將這種變形固定，從而實現(xiàn)物料的組織化。 事實上，人們很早就開始利用外界物理力場如螺桿擠出對食品材料進行變形以形成預期產(chǎn)品形狀， 其變形尺寸一般都是肉眼可見。最近，這種外力輔助成型也開始延伸到如剪切流動成型技術(shù)等能夠?qū)ξ⒂^結(jié)構(gòu)變形控制的新型成型技術(shù)中。另外，對流動性強的蛋白溶液也可通過外力將其引流成細長蛋白液流，然后再將其溶劑快速揮發(fā)或固定化， 從而達到纖維化的目的，如濕法紡絲和靜電紡絲。

3.2.1 螺桿擠出成型 擠出技術(shù)是將植物基材料轉(zhuǎn)化為纖維狀產(chǎn)品最常用的商業(yè)技術(shù)， 其中以螺桿擠出方式最為常見。 螺桿擠出技術(shù)是指將物料預混合后添加少量分散劑（或稱塑形劑，大部分為水），再通過外力（螺桿擠出時形成的高壓高剪切力）使物料形變并最后通過模頭固定形變以形成產(chǎn)品的過程，其通過加熱、水合和剪切應力的組合處理，使高濃度蛋白質(zhì)在筒腔內(nèi)塑化/熔化，再通過末端模量擠出成型[8]，如圖5 所示。 早在上個世紀七八十年代人們就廣泛利用擠出技術(shù)開發(fā)組織化植物蛋白， 后來發(fā)展了較為高端的拉絲蛋白產(chǎn)品。這些產(chǎn)品基本上為低水分產(chǎn)品，如組織化植物蛋白（TVP），吸水膨脹性好，韌性強，有一定的咀嚼度，大多用于仿肉制品或肉制品配料中。后來又開發(fā)了高水分產(chǎn)品（質(zhì)量分數(shù)50%以上）的濕法擠壓技術(shù)，現(xiàn)已基本成熟，成為植物基人造肉生產(chǎn)的主流工藝。雖然擠壓加工被研究了許多年，但是這種方法對過程的控制和擠壓產(chǎn)品的設計仍主要基于經(jīng)驗[23]。 此方法簡單、方便且易于批量生產(chǎn)，然而達不到對材料微觀結(jié)構(gòu)的設計控制， 影響了仿生材料的逼真性和功能。

圖5 用于人造肉生產(chǎn)的螺桿擠出機結(jié)構(gòu)示意圖[8]Fig.5 Schematic diagram of screw extruder for artificial meat production[8]

3.2.2 剪切流動成型 為了達到對成型過程中微觀結(jié)構(gòu)的控制，一種剪切流動（Shear flow）成型技術(shù)被開發(fā)用來生產(chǎn)纖維化產(chǎn)品。 其根據(jù)流變儀的設計原理[25]，利用錐體轉(zhuǎn)動時對腔內(nèi)物料產(chǎn)生強大的剪切力而使物料組織化（圖6）。 通常需要額外的加熱輔助裝置用于蛋白變性來提高體系的黏彈性。研究表明，此方法可實現(xiàn)對植物蛋白納米尺度上的各向異性組織化的控制， 也可對動物蛋白如酪蛋白實現(xiàn)納米尺度上的控制[25]。 目前，這項技術(shù)已成功地擴大化，設備的加工能力可達7 L[24]。

圖6 剪切流動成型技術(shù)及相關(guān)的仿肉產(chǎn)品[24]Fig.6 Shear flow molding technology and related meat-like products[24]

3.2.3 濕法紡絲 為了實現(xiàn)蛋白質(zhì)的纖維狀成型， 可預先將蛋白質(zhì)溶液沿細長的管道流出以形成蛋白質(zhì)流， 然后再快速脫去溶劑或?qū)⒌鞍踪|(zhì)溶液固定化而實現(xiàn)纖維組織化， 這種技術(shù)稱為濕法紡絲。 Boyer 早在1954年就申請了蛋白質(zhì)濕法紡絲的專利，用于肉類似物的應用[26]。 其基本工藝流程是首先將含有蛋白質(zhì)的溶液通過噴絲頭擠出，然后浸入該蛋白質(zhì)不可溶的溶劑中， 蛋白質(zhì)在可溶和不可溶之間的交換導致擠壓蛋白相的沉淀和凝固，形成直徑為微米級的纖維絲，如圖7a 所示。常見的大豆、 豌豆等植物蛋白均可通過濕法紡絲形成蛋白纖維。除了一維的單根纖維絲，也可形成具有三維結(jié)構(gòu)的纖維團（圖7b）。 濕法紡絲用于仿肉制品開發(fā)的優(yōu)點是纖維形態(tài)規(guī)則、整齊，穩(wěn)定性好，然而產(chǎn)量不適于放大，同時在生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量的廢液。

圖7 濕法紡絲工藝流程圖[27]Fig.7 Schematics of wet-spinning process[27]

3.2.4 靜電紡絲 利用強電場將聚合物溶液或熔體形成噴射流并固化成纖維的過程稱為靜電紡絲。在電場作用下，針頭處的液滴由球形變?yōu)閳A錐形（即“泰勒錐”），并從圓錐尖端延展得到纖維細絲，其直徑可達到納米級（圖8）。 能夠形成靜電紡絲的蛋白質(zhì)必須是高度可溶的纖維狀或無規(guī)則卷曲狀而不是球狀，并且需具有一定的黏性。植物蛋白通常不能滿足這些要求， 因為它們可溶時呈天然的球狀，而變性后多會形成不溶性聚集體。已報道一些動物蛋白如乳清蛋白、膠原蛋白、卵蛋白和明膠等可形成靜電紡絲， 而植物蛋白中僅有少數(shù)如玉米醇溶蛋白被報道[28]。 其它植物蛋白可通過明膠等蛋白載體進行靜電紡絲。 Nieuwland 等[29]展示了將玉米醇溶蛋白用作其它蛋白質(zhì)如大豆蛋白載體的可能性， 這種利用混合蛋白進行靜電紡絲的方法， 為此技術(shù)在食品領(lǐng)域的潛在應用提供了技術(shù)支持。 靜電紡絲雖然對材料結(jié)構(gòu)實現(xiàn)納米尺寸控制， 但是將其作為潛在的人造肉生產(chǎn)技術(shù)仍存在很多障礙，主要表現(xiàn)在：一是擴大化生產(chǎn)所需的高昂設備投入，二是適宜原料的選擇，如果仍需要明膠來進行靜電紡絲， 那么最終產(chǎn)品仍難以達到真正的“無肉”要求。

圖8 靜電紡絲成型工藝流程示意圖[29]Fig.8 Scheme of an electrospinning equipment[29]

3.3 細胞培養(yǎng)技術(shù)（自組織技術(shù)）

模擬生物體材料（如肌纖維）的體內(nèi)形成途徑，以自下而上（bottom-up）的策略從分子水平組裝合成納米尺度的蛋白纖絲，再經(jīng)過進一步聚集、結(jié)合，形成宏觀可見的蛋白纖維，是使產(chǎn)品接近或達到肌肉纖維結(jié)構(gòu)及相應的感官品質(zhì)的最直接途徑，如真菌蛋白、細胞培養(yǎng)肉等。 以自下而上的策略制備的食品材料屬性雖更忠于天然食品， 但仍需繼續(xù)探究其組裝機理， 包括闡析生物體內(nèi)自身的組裝機制，以提高這一技術(shù)的應用進程。

3.3.1 微生物培養(yǎng) 為滿足全球不斷擴大的食物和蛋白質(zhì)需求， 人們從上個世紀就開始利用微生物如細菌和酵母生產(chǎn)單細胞蛋白。經(jīng)過10年的安全性評估，利用鐮孢霉（Fusariumvenenatum）生產(chǎn)的菌蛋白（Mycoprotein）被英國食品與藥物管理局正式批準作為食品，上市銷售。菌蛋白是一種高蛋白、高纖維、低脂肪的食品成分，適合納入健康飲食。菌蛋白是在好氧條件下，利用葡萄糖為主要碳源的培養(yǎng)基連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)生的（圖9）。 發(fā)酵完成后，通過短時間的熱處理，降低其核糖核酸（RNA）含量（從干重的10%降到2%以下），然后通過離心收獲菌絲體， 再與蛋清等粘合形成與肉纖維相似的紋理和味道[30]。 此外，也可以通過冷凍-脫水過程進一步形成更明顯的紋理結(jié)構(gòu)。 雖然此過程形成的纖維在宏觀尺度上呈平行排列， 但是在微觀結(jié)構(gòu)上（毫米以下）為隨機排列。 可以結(jié)合擠壓技術(shù)或擠壓流動技術(shù)使菌蛋白的微觀結(jié)構(gòu)更為規(guī)則[31]。

圖9 菌蛋白深層培養(yǎng)示意（菌絲體摘自[31]）Fig.9 Schematic diagram of bacterium protein by submerged fermentation（mycelium from literature[31]）

目前，菌蛋白的生產(chǎn)工藝已經(jīng)成熟，生產(chǎn)菌蛋白的培養(yǎng)基原料豐富，除了可利用含有胺、葡萄糖和生物素的合成培養(yǎng)基， 也可利用來源更為豐富的農(nóng)副產(chǎn)品作為營養(yǎng)源。 據(jù)估計，使用1 t 的豌豆加工副產(chǎn)品可產(chǎn)生680 kg 的菌絲體，這比使用合成培養(yǎng)基多生產(chǎn)38%的蛋白質(zhì)[32]。

菌蛋白作為一種商業(yè)化的生物合成仿肉制品， 為提供蛋白資源和減少肉類消費起到重要作用[33]。 然而，其在技術(shù)方面涉及菌種退化問題，如菌絲體纖維變短，甚至為球狀，并且產(chǎn)量降低等問題也需要考慮。另外，菌蛋白可能引起潛在的過敏反應， 有必要對其相關(guān)產(chǎn)品進行安全評價以及開展毒理學試驗和過敏性的評估研究。

3.3.2 動物細胞培養(yǎng) 動物細胞培養(yǎng)技術(shù)作為一種新興的科技手段可用于開發(fā)更具有實際意義的人造肉產(chǎn)品。 原則上，只要有一個穩(wěn)定的細胞系，無論來源于牛、豬、雞，甚至是魚或者其它可食用的動物， 就可以培養(yǎng)出動物肌肉組織用于肉類生產(chǎn)。簡單地說，首先從數(shù)量有限的動物身上提取一些干細胞，繁殖并分化成肌肉細胞（成肌細胞），然后融合（形成肌管）并形成肌肉纖維（圖10）。 在肌肉纖維培養(yǎng)過程中， 可加入細胞支架來促進肌細胞增殖與生長， 也可加入脂肪細胞進行共培養(yǎng)以提高脂肪含量。一旦肌肉纖維成熟并收獲，可被加工成肉餅、肉丸等人造肉產(chǎn)品。

本世紀初， 美國國家航空航天局NASA 資助開發(fā)用于以食用為目的的動物培養(yǎng)組織[35]。 而真正意義上的人造肉是由馬斯特里赫特大學（Maastricht University）教授馬克·波斯特（Mark Post）于2013年8月培養(yǎng)的世界上第1 塊牛肉漢堡[36]。 隨后， 一大批公司和風投資金以及科研院所開始關(guān)注細胞培養(yǎng)肉。 2019年11月21日，我國南京農(nóng)業(yè)大學周光宏教授團隊使用豬肌肉干細胞培養(yǎng)出重達5 g 的中國第1 塊細胞培養(yǎng)肉并通過了技術(shù)鑒定，掀開了國內(nèi)細胞培養(yǎng)肉技術(shù)的攻關(guān)熱潮。

作為細胞培養(yǎng)肉的開拓者馬克·波斯特[37]詳細評述了細胞培養(yǎng)肉的技術(shù)挑戰(zhàn)[38]，主要歸納為以下4 個方面：

1）細胞的篩選是細胞培養(yǎng)肉開發(fā)的關(guān)鍵。原則上講，細胞培養(yǎng)肉屬于細胞工程范疇，其細胞來源可為從原始組織中分離出來的原代細胞或細胞系。Kadim 等[39]介紹了可用于細胞培養(yǎng)肉的不同類型細胞，尤其是干細胞，包括胚胎干細胞、全能干細胞、多能干細胞、誘導多能干細胞和成體干細胞等。 目前從肌肉組織中提取的肌衛(wèi)星干原代細胞（Myosatellite）應用最多。 另外，建立細胞系，包括將體細胞轉(zhuǎn)化為誘導多能干細胞（iPSC）是細胞來源的另一種選擇，其涉及的內(nèi)容多，且細胞增殖與分化、遺傳性狀的穩(wěn)定性等問題需要一一解決[40]。除了成肌細胞外， 脂肪組織來源的干細胞也是如此。

對成肌細胞的分化與增殖的控制則更為艱難。 如前所述，生物體內(nèi)的細胞增殖（細胞數(shù)量增加）基本上在胚胎期已經(jīng)完成，而出生后肌細胞僅進行肥大過程（分化成熟肌纖維），這是在一系列基因及信號因子的操控下完成的。 在體外培養(yǎng)尤其是大規(guī)模培養(yǎng)中， 如何精確把控細胞的增殖與分化仍僅限于經(jīng)驗，缺乏系統(tǒng)方法的理論基礎。

圖10 動物細胞培養(yǎng)肉的生產(chǎn)工藝流程圖[34]Fig.10 Production process flow chart of animal cell cultured meat[34]

動物體內(nèi)肌纖維的肥大是在蛋白質(zhì)的不斷合成與分解中形成的， 而其中物理力學即神經(jīng)控制下的肌肉收縮起到重要的作用， 這也是賦予肌肉的機械強度和質(zhì)地的重要原因。 機械刺激在觸發(fā)蛋白質(zhì)合成和蛋白質(zhì)組織收縮單位方面是極其重要的，其賦予肌肉典型的橫紋肌微觀形態(tài)。而目前構(gòu)建人工支架使肌細胞粘附其上以形成張力，會促進所謂的生物人造肌肉產(chǎn)生蛋白質(zhì)的理論仍需進一步驗證[41]。 另外，在擴大化生產(chǎn)中如何操作也是潛在問題。除了被動拉伸和張力外，電刺激也能夠促進肌細胞蛋白質(zhì)合成， 促進肌纖維的提前成熟，而對于大規(guī)模生產(chǎn)，這種低效率的能量利用方式是否能夠有效保證蛋白質(zhì)的穩(wěn)定合成， 還有待證明[37]。

2）培養(yǎng)基是細胞培養(yǎng)肉商業(yè)化的前提。培養(yǎng)基占據(jù)了細胞培養(yǎng)肉的大部分成本。 篩選來源廣泛、質(zhì)理穩(wěn)定、安全衛(wèi)生、成本低廉的細胞培養(yǎng)基無疑是一個相當艱巨的任務。 尤為重要的是培養(yǎng)基不應含有血清以及其它動物成分[42]，然而目前含血清的培養(yǎng)基仍顯著優(yōu)于無血清培養(yǎng)基[43]。 同時，雖然培養(yǎng)基不會直接被人們消費，但是其來源的穩(wěn)定性以及可追溯性是細胞培養(yǎng)肉作為食品的必要保障。此外，生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的富含代謝廢物的大量培養(yǎng)廢液的處理也將是一個棘手的問題。

3）真正形成肉的多維結(jié)構(gòu)體的技術(shù)仍不成熟。 目前細胞培養(yǎng)肉基本上是在2D 結(jié)構(gòu)中形成的，或者說是在很?。◣装傥⒚祝┑?D 結(jié)構(gòu)中形成的，也就是說先進行肌纖維的培養(yǎng)，再收集組裝形成肉餅、肉丸、香腸為代表的重組肉制品，而不能形成整塊肌肉產(chǎn)品。要形成真正的肉塊，需要優(yōu)化形成更厚的3D 結(jié)構(gòu)，這就涉及如何給內(nèi)部細胞提供營養(yǎng)和氧氣供應并去除產(chǎn)生的廢物。 目前報道的產(chǎn)生了厚度為1 cm 的具有血管組織的3D 細胞結(jié)構(gòu)體，其培養(yǎng)周期達6 周[44]。 此外，為解決之前提及的細胞培養(yǎng)肉缺少特有的材料特性以及相應的質(zhì)地口感， 麻省理工學院的研究人員開發(fā)了1種方法， 即通過在明膠支架上培育牛和兔子的肌肉細胞，更好地模仿真肉的形狀和味道[45]，而無動物蛋白的細胞培養(yǎng)支架仍需進一步開發(fā)。

4）放大生產(chǎn)是細胞培養(yǎng)肉真正商業(yè)化的最大挑戰(zhàn)。若要從培養(yǎng)的肌細胞中獲取1 kg 蛋白質(zhì)，則需要8×1012個細胞；如果懸浮培養(yǎng)，就需要1 個5 000 L 的攪拌型生物反應器[38]。 這個體積在已建立的生物處理中很常見， 而在組織工程和間充質(zhì)干細胞擴展中尚未得到證實[46]。 為了實現(xiàn)更高的細胞密度， 一些其它類型的反應器如流化床生物反應器和中空纖維膜生物反應器雖可供選擇，但仍需進一步實踐驗證。同時，如何在大型反應器中調(diào)控細胞分化，尤其是在不同類型細胞共培養(yǎng)時，遠遠要比控制其增殖復雜， 而現(xiàn)階段的制備基本上是以單一的細胞進行的[38]。 此外，目前實驗室肌肉細胞的培養(yǎng)主要是靠貼壁方式分化肌管以及成熟的肌纖維，雖然懸浮培養(yǎng)會提高生產(chǎn)效率，但是所形成的肌纖維形態(tài)是否發(fā)生改變， 仍需深入研究。如仍以貼壁方式生產(chǎn)，更大規(guī)模的適宜的相關(guān)生產(chǎn)設備需加大投入開發(fā)。

總之， 細胞培養(yǎng)肉作為真正意義上的肉類代替品，前景廣闊，尤其是目前初步實驗成功奠定了其潛在的商業(yè)化基礎。然而，鑒于其較高的生產(chǎn)效率與逼真性是產(chǎn)品成功的關(guān)鍵， 根據(jù)目前的開發(fā)現(xiàn)狀，在技術(shù)層面上仍需做很多改進和提升，還有很長的路要走， 并且在路途中還可能出現(xiàn)其它問題，包括真正商業(yè)化后。

4 結(jié)論

肉類作為人類飲食中蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的重要來源， 其過度生產(chǎn)與消費產(chǎn)生了許多潛在的全球化問題，如造成溫室氣體排放量增加，土地和水資源的大量消耗，損害動物福利，以及對人類健康產(chǎn)生的潛在影響等。 尋找新的蛋白質(zhì)資源模仿肉的結(jié)構(gòu)、形態(tài)、質(zhì)地、風味，開發(fā)具有可持續(xù)性的、健康的肉類替代品，越來越受到關(guān)注。肉作為一種各向異性的材料組織，其不同組分、不同層次的組裝復雜性從技術(shù)層面給開發(fā)其替代品帶來了巨大挑戰(zhàn)。以分子組裝、細胞結(jié)構(gòu)和組織構(gòu)建為核心的結(jié)構(gòu)生物學及仿生學等學科的迅速發(fā)展， 為食品仿生技術(shù)包括人造肉的開發(fā)提供了新的策略與手段。

蛋白質(zhì)的自組裝、 外力輔助成型和細胞培養(yǎng)（自組織）是目前主要的人造肉的纖維化技術(shù)，其在商業(yè)化生產(chǎn)上各有利弊。其中，蛋白質(zhì)的自組裝與外力輔助成型結(jié)合使用可能會實現(xiàn)優(yōu)勢互補，開發(fā)出不同組織形態(tài)和感官特性的仿肉制品。 同時，微生物發(fā)酵是目前成熟的細胞培養(yǎng)技術(shù)，利用其開發(fā)肉的代替品， 既能充分利用我國豐富的農(nóng)副產(chǎn)品資源，也能滿足人們對高纖維、低脂肪的食品的訴求。 動物細胞培養(yǎng)肉作為真正意義上的肉類代替品，發(fā)展前景廣闊，已完成初步的實驗室開發(fā)階段， 然而由于其技術(shù)層面的許多障礙需要克服，因此未來還有很長的路要走，其真正的商業(yè)化還有很多不確定性。

從材料屬性出發(fā)，以綜合、多學科的角度研究肉和肉制品多樣化的宏觀物理屬性以及其所表現(xiàn)出的特有的黏彈性和質(zhì)構(gòu)（口感），并闡析其微觀結(jié)構(gòu)的形成機制和策略， 在不同尺度上實現(xiàn)對人造肉產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的精細控制是目前重要的研究內(nèi)容。 在具體應用方面，根據(jù)肉制品種類多樣，組織結(jié)構(gòu)迥異的特點，針對不同消費者的需要，采用行之有效的制備技術(shù)，開發(fā)出營養(yǎng)、健康、安全的肉類代替品，最大程度地實現(xiàn)資源的充分利用，能耗的最優(yōu)化以及產(chǎn)品的高質(zhì)化。

人造肉是一個新興的食品產(chǎn)業(yè)， 產(chǎn)品的健康性是其發(fā)展的基礎。崇尚與敬畏自然，積極開發(fā)食品仿生技術(shù)，大力發(fā)展健康仿肉制品，對優(yōu)化我國農(nóng)產(chǎn)品資源的綜合利用效率， 促進肉類食品的多元化， 提升國人身體素質(zhì)和生活質(zhì)量具有重要意義。