馬臣臣 姜帥銘 彭倩楠 霍冬雪 張家超

（海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 海口570228）

傳統(tǒng)發(fā)酵食品在我國有著數(shù)千年的歷史，因其獨(dú)特的制作工藝、風(fēng)味及營養(yǎng)價(jià)值而得以延存，至今深受大家的喜愛[1]。 海南，獨(dú)特的地理位置與氣候特點(diǎn)，以及海南黎族清淡的飲食習(xí)慣，使得黎族人民將發(fā)酵海產(chǎn)品的制作發(fā)揮到極致，以魚醬、蝦醬、蟹醬最為常見。 魚醬，又名魚茶、魚酸，是將干飯或稀飯伴入淡海魚， 加少許鹽入缸腌制的發(fā)酵食品[2]。 蝦醬和蟹醬是將蝦或蟹搗碎，加鹽發(fā)酵后制成的營養(yǎng)豐富的調(diào)味品[3-5]。 傳統(tǒng)發(fā)酵海產(chǎn)品已成為海南人民日常餐桌必不可少的美食， 成為招待客人的佳肴。

微生物多樣性的分析和乳酸菌的分離與鑒定是研究傳統(tǒng)發(fā)酵制品的常用方法。劉芳等[6]對內(nèi)蒙古酸馬奶的研究顯示：優(yōu)勢菌是屎腸球菌（Enterococcus faecium）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）等。 越南的短期及長期發(fā)酵制品的微生物多樣性十分豐富，不同及同種制品、不同地區(qū)的優(yōu)勢菌種存在顯著差異[7]。對韓國8 種傳統(tǒng)發(fā)酵制品的研究揭示了其微生物群落特點(diǎn)[8]。對菲律賓傳統(tǒng)發(fā)酵制品的微生物多樣性的分析， 鑒定出面包乳桿菌（Lactobacillus panis）、 食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria），完善了對當(dāng)?shù)匕l(fā)酵制品微生物多樣性的認(rèn)識[9]。 對我國豆瓣醬發(fā)酵過程中菌群的動(dòng)態(tài)監(jiān)控，揭示了優(yōu)勢菌群與其風(fēng)味質(zhì)量的關(guān)系[10]。 這些研究為挖掘傳統(tǒng)發(fā)酵食品中有益微生物資源打下基礎(chǔ)。

海南島，長夏無冬，屬于熱帶季風(fēng)型氣候，有著國內(nèi)少有的傳統(tǒng)發(fā)酵海產(chǎn)品研究模型（蝦醬、蟹醬、魚醬），目前對于海南發(fā)酵海產(chǎn)品微生物多樣性的研究相對較少。 本研究結(jié)合傳統(tǒng)微生物純培養(yǎng)技術(shù)、16S rRNA 測序技術(shù)和高通量測序技術(shù)探究海南傳統(tǒng)發(fā)酵海產(chǎn)品微生物多樣性， 旨在挖掘熱帶有益微生物資源， 力求指導(dǎo)工廠化生產(chǎn)以改善傳統(tǒng)加工工藝，提高產(chǎn)品質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦醬、蟹醬、魚醬采自海南省陵水、保亭、樂東、白沙黎族自治縣和萬寧市，共計(jì)24 份樣品，其中蝦醬10 份，蟹醬5 份，魚醬9 份。 東南部地區(qū)15 份樣品（6 份魚醬、4 份蝦醬、5 份蟹醬），西南部地區(qū)9 份樣品（3 份魚醬、6 份蝦醬）。 樣品采集后全程4 ℃保藏箱保存， 以防止樣品微生物結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

MRS 肉湯， 廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；6×DNA 凝膠加樣緩沖液，上海桑尼生物科技有限公司；2×Es Taq Master Mix PCR 擴(kuò)增預(yù)混液、DM2000 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品、蛋白酶K，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；SYBR Green 熒光染料2×Buffer，寶生物工程（大連）有限公司；Gold ViewTM核酸染料，美國Amerco 公司； Agarose LE，天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR 擴(kuò)增儀，杭州朗基科學(xué)有限公司；凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Cell Biosciences；高速冷凍離心機(jī)，Thermo Scientific；電泳儀（DYY-12），北京市六一儀器廠；高速離心機(jī)（TGL-16G），上海安亭科學(xué)儀器廠；雙目生物顯微鏡（DP72），日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集與預(yù)處理 24 份發(fā)酵海產(chǎn)品（5 份蟹醬、10 份蝦醬、9 份魚醬）放入無菌容器中，4 ℃條件置于保溫箱中，運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室立即處理。準(zhǔn)確稱取5 g 各發(fā)酵樣品至45 mL 0.85%無菌生理鹽水中混合均勻， 按10 倍梯度稀釋法制成10－1～10－4的樣品稀釋液。

1.3.2 微生物的分離與純化 吸取各濃度的樣品稀釋液100 μL， 涂布于MRS 瓊脂培養(yǎng)基表面，每個(gè)稀釋度涂布1 個(gè)平板，37 ℃條件下置厭氧罐中厭氧培養(yǎng)48 h。觀察菌落形態(tài)，從最佳稀釋梯度培養(yǎng)基中挑選疑似乳酸菌菌落，接種到培養(yǎng)MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)24 h。 培養(yǎng)完成后，采用革蘭氏染色法在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，選取純菌種繼續(xù)傳代培養(yǎng)24 h，而后離心收集菌體，采用脫脂乳法于-40 ℃保存菌種。

1.3.3 16S rRNA 測序 采用CTAB 凍融法[11-13]提取菌株的DNA。 利用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，在100 V 電壓下0.5×TBE 電泳液中電泳15 min，檢測提取DNA 的質(zhì)量， 并將提取的DNA 置于－20℃條件下保存。

16S rRNA擴(kuò)增引物為 27F：5’ -AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3’，1492R：5’ -TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3’[14-15]。PCR 擴(kuò)增體系（50 μL）：2×Es Taq Master Mix 擴(kuò)增預(yù)混液25 μL、引物（10 pmol/μL）各1.5 μL、基因組DNA模板（100 ng/μL）1.5 μL、dd H2O 20.5 μL。 反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min， 循環(huán)30 次；72 ℃末端延伸10 min，4 ℃條件下保溫。

PCR 擴(kuò)增結(jié)束后，取2 μL PCR 產(chǎn)物與2 μL 6×DNA 凝膠加樣緩沖液混合于1.0%瓊脂糖凝膠中點(diǎn)樣電泳（100 V 15 min），如在約1 500 bp 處觀察到清晰的條帶，且無明顯的非特異性擴(kuò)增，表明PCR 成功。 測序工作由上海派諾森生物科技股份有限公司完成。序列信息通過SeqMan 進(jìn)行手動(dòng)校準(zhǔn)， 并將校準(zhǔn)后的序列信息輸入NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 比對分析，選擇覆蓋率與準(zhǔn)確率均在98%及以上的分析結(jié)果。 同時(shí)選取樣品中的代表菌株及其相似菌種， 利用MEGA7.0 中Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

獲得分離菌株的鑒定結(jié)果后， 比較各樣品中的微生物多樣性， 選取微生物多樣性最好的發(fā)酵海產(chǎn)樣品， 采用CTAB 凍融法提取樣品宏基因組DNA，通過454 焦磷酸測序技術(shù)對16S rRNAV3-V4 進(jìn)行高通量測序，通過比對16S rRNA V3-V4序列獲得V3-V4 獨(dú)特序列組。 在選擇代表序列后， 按照97%的相似性閾值將序列劃分為不同的OTU，通過OTU 分析，研究樣品中微生物多樣性和不同微生物的豐度。 利用Kruskal-Wallis 進(jìn)行多重檢驗(yàn)， 細(xì)化差異性菌屬， 通過Weighted Unifrac Distance 比較不同發(fā)酵海產(chǎn)品Beta 多樣性。 數(shù)據(jù)分析主要采用R 程序。

2 結(jié)果分析

2.1 微生物分離與純化

經(jīng)過微生物的分離與純化，從24 份樣品中共分離出180 株菌，其中蟹醬37 株、蝦醬72 株、魚醬71 株，分別占20.1%，40%，39.9%。 海南東南部各黎族自治縣118 株，占64.1%；西南部各黎族自治縣62 株，占35.9%。

2.2 16S rRNA 序列同源分析鑒定結(jié)果

將16S rRNA 基因序列分析結(jié)果通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 分析。 鑒定出乳桿菌屬（Lactobacillus）161 株、 片球菌屬 （Pediococcus）7 株、葡萄球菌（Staphylococcus）6 株、腸球菌屬（Enterococcus）3 株、魏斯氏菌屬 （Weissella）3 株，共180株菌。 其中乳桿菌屬（Lactobacillus）含量最高，結(jié)合圖1 可知乳桿菌屬為優(yōu)勢菌屬，占89.4%。 在種的水平上，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）72 株，占44.7%，發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）54 株，占33.5%是優(yōu)勢菌種，其次還包括羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）8 株、那慕爾乳桿菌（Lactobacillus namurensis）6 株、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）5 株、橋乳桿菌（Lactobacillus pontis）4 株、香腸乳桿菌（Lactobacillus farciminis）3 株、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）3 株、福菜乳桿菌（Lactobacillus futsaii）2 株、酸魚乳桿菌（Lactobacillus acidipiscis）1 株、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）1 株、布赫內(nèi)氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）1 株、面包乳桿菌（Lactobacillus panis）1 株。片球菌屬共鑒定出7 株，包括乳酸片球菌 （Pediococcus acidilactici）1 株和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）6 株。 葡萄球菌屬分離出香料葡萄球菌 （Staphylococcus condimenti）2 株和表皮葡萄球菌 （Staphylococcus epidermidis）4 株。 占菌屬總數(shù)1.7%的腸球菌屬被鑒定為糞腸球菌（Enterococcus faecalis）3 株，魏斯氏菌屬被鑒定為食竇魏斯氏菌1 株和融合魏斯氏菌（Weissella confusa）2 株。

表1 16S rRNA 序列同源分析鑒定Table 1 Identification of isolates based on 16S rRNA sequencing

圖1 分離鑒定結(jié)果Fig.1 The result of isolation and identification

2.3 不同發(fā)酵海產(chǎn)品的微生物多樣性分析

結(jié)合表1 和圖2 可以看出，魚醬的微生物多樣性高于蝦醬和蟹醬。 植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌均為3 種發(fā)酵海產(chǎn)品的優(yōu)勢菌種，不同的是在蝦醬中發(fā)酵乳桿菌的數(shù)量是植物乳桿菌的2 倍左右，而蟹醬和魚醬中前者僅是后者的1/2～1/3。 除此之外，橋乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、香料葡萄球菌、表皮葡萄球菌均只存在于蝦醬中， 共計(jì)18 株，占蝦醬中分離菌株的25%。 蟹醬中獨(dú)有的菌種為短乳桿菌、香腸乳桿菌，共計(jì)4 株，占蟹醬中分離菌株的10.8%。 魚醬中特有的菌種最多，包括糞腸球菌、酸魚乳桿菌、布赫內(nèi)氏乳桿菌、那慕爾乳桿菌、面包乳桿菌、副干酪乳桿菌、乳酸片球菌、食竇魏斯氏菌、融合魏斯氏菌，共計(jì)19 株，占魚醬總分離菌株的26.8%。

圖2 不同種類發(fā)酵海產(chǎn)品微生物多樣性對比Fig.2 Comparison of microbial diversity from different fermented seafood

2.4 不同地區(qū)發(fā)酵海產(chǎn)品微生物多樣性分析

從海南東南部地區(qū)采集的發(fā)酵海產(chǎn)品中共鑒定出腸球菌屬3 株、乳桿菌屬104 株、片球菌屬6株、葡萄球菌屬2 株、魏斯氏屬3 株，共計(jì)118 株，占菌種總數(shù)的65.6%。 從西南部地區(qū)的發(fā)酵海產(chǎn)品中鑒定出乳桿菌屬57 株、片球菌屬1 株、葡萄球菌屬4 株，共計(jì)62 株，占34.4%。 無論是東南部地區(qū)還是西南部地區(qū)其優(yōu)勢菌株均為植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌。 植物乳桿菌分別占東南地區(qū)、西南地區(qū)分離菌株的39.8%，40.3%， 發(fā)酵乳桿菌占28.0%，33.9%。除兩種優(yōu)勢菌種外，那慕爾乳桿菌、戊糖乳桿菌、 戊糖片球菌均從兩地樣品中被分離出，共計(jì)17 株，占菌種總數(shù)9.4%，相似性較低。 酸魚乳桿菌、副干酪乳桿菌、表皮葡萄球菌僅在西南地區(qū)被分離出，共計(jì)8 株，占西南地區(qū)樣品菌株的12.9%。 羅伊氏乳桿菌、橋乳桿菌、香腸乳桿菌、糞腸球菌、融合魏斯氏菌、香料葡萄球菌、福菜乳桿菌、食竇魏斯氏菌、乳酸片球菌、面包乳桿菌、布赫內(nèi)氏乳桿菌僅存在于東南部地區(qū)樣品中，共計(jì)31株，占東南地區(qū)樣品菌株的26.3%。 結(jié)合表1 及圖3 可知海南東南地區(qū)發(fā)酵海產(chǎn)品的微生物多樣性高于西南地區(qū)。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

選取發(fā)酵海產(chǎn)品中代表菌株及相似菌株，用MEGA7.0 中鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹， 并用Bootstrap 檢驗(yàn)1 000 次隨機(jī)驗(yàn)證重復(fù)， 結(jié)果顯示可信度較高， 表示所選菌株所處分類學(xué)地位以及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。如圖4 所示，所選代表菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹中分為13 個(gè)分支：A6 與戊糖乳桿菌a2 在一個(gè)分支； A36 與福菜乳桿菌 CS5 在一個(gè)分支；A43與羅伊氏乳桿菌VB4 在一個(gè)分支；A89 與橋乳桿菌 NM100-2 在一個(gè)分支；A51 與融合魏斯氏BSR5 在一個(gè)分支；A26 與戊糖片球菌JCM 20459在一個(gè)分支；A42 與發(fā)酵乳桿菌 MGC16-1 在一個(gè)分支；A94 與糞腸球菌TS4E2 在一個(gè)分支；B5與面包乳桿菌JCM 11053 在一個(gè)分支；C36 與發(fā)酵乳桿菌 KFC 在一個(gè)分支；C28 與植物乳桿菌IMAU80058 在一個(gè)分支；B8 與布赫內(nèi)氏乳桿菌DG3 在一個(gè)分支；B90 與那慕爾乳桿菌 NBRC 107158 在一個(gè)分支。

圖3 不同地區(qū)發(fā)酵海產(chǎn)品微生物多樣性對比Fig.3 Comparison of microbial diversity in fermented seafood from different regions

2.6 發(fā)酵海產(chǎn)品微生物群落分析

圖4 發(fā)酵海產(chǎn)品微生物16S rRNA 基因序系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rRNA of fermennted seafood microorganisms

經(jīng)16S rRNA V3～V4 可變區(qū)高通量測序，結(jié)果顯示，9 份樣品都主要由厚壁菌門（Firmicute）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）組成。 在上述門水平上， 蟹醬中的組成依次為93.97%，4.58%，0.14%，0.085%，0.019%。 魚醬中的組成依次是64.05%，21.80%、2.1%，1.73%，0.39%，且酸桿菌門（Acidobacteria）含量也較高，占1.5%。蝦醬中的組成依次是34.13%，26.45%，8.44%，2.14%，11.03%，且酸桿菌門含量也較高，占3.76%，芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）占2.6%。 可見蝦醬中厚壁菌門的含量明顯低于蟹醬和魚醬， 酸桿菌門明顯高于蟹醬和魚醬。 蟹醬中變形菌門的含量明顯低于魚醬和蝦醬。如圖5 所示，在屬的水平上，乳桿菌屬、片球菌屬、魏斯氏屬、半乳糖產(chǎn)己酸菌屬、芽孢桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、葡糖桿菌屬在9 個(gè)發(fā)酵海產(chǎn)品中占18.5%，9.91%，9.53%，8.37%，4.17%，2.58%，2.52%，2.02%。 可見海南發(fā)酵海產(chǎn)品微生物多樣性豐富， 不同發(fā)酵海產(chǎn)品微生物群落特點(diǎn)鮮明。

圖5 發(fā)酵海產(chǎn)品微生物群落分析Fig.5 Analysis of microbial community in fermented seafood

2.7 差異性分析

比較分析9 份海南發(fā)酵海產(chǎn)品中的差異性菌屬， 選擇平均含量大于0.1%，P＜0.05 的菌屬列于表2。 厚壁菌門的堿芽孢桿菌屬（Alkalibacillus）僅存于蝦醬中，具有顯著優(yōu)勢。唯獨(dú)魚醬中沒有F 厚壁菌門的慢生芽孢桿菌屬（Lentibacillus）。 魚醬中的放線菌門的棒狀桿菌屬明顯高于蟹醬與蝦醬。

不同發(fā)酵海產(chǎn)品的群落差異性見圖6。 蟹醬與魚醬樣品的加權(quán)距離主要集中在0.4～0.6，蟹醬與蝦醬樣品的加權(quán)距離主要集中在1.1～1.3，魚醬與蝦醬樣品的加權(quán)距離主要集中在1.0～1.2，表明蟹醬與魚醬的微生物群落差異最大， 魚醬與蝦醬的差異性略大于蟹醬與蝦醬的差異性。

表2 發(fā)酵海產(chǎn)品的差異性菌屬Table 2 The different microbiota in fermented seafood samples

圖6 基于加權(quán)距離的發(fā)酵海產(chǎn)品差異性分析Fig.6 Different analysis in fermented seafood samples based on weighted unifrac distance

3 討論

本研究采用傳統(tǒng)微生物純培養(yǎng)技術(shù)與16S rRNA 基因序列同源性分析，對海南不同種類及不同地區(qū)的發(fā)酵海產(chǎn)品進(jìn)行微生物多樣性分析，結(jié)果表明，乳桿菌屬為海南發(fā)酵海產(chǎn)品優(yōu)勢菌屬，植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌為優(yōu)勢菌種。這一結(jié)果與陳川平等[16]和王曉茹等[17]的研究相比，發(fā)酵乳桿菌是魚醬的優(yōu)勢菌，而戊糖乳桿菌含量并不顯著，這可能是由于發(fā)酵時(shí)間不同以及發(fā)酵原料和黎族家庭制作工藝不同所致。 本研究首次從魚醬中分離出酸魚乳桿菌、面包乳桿菌、副干酪乳桿菌、戊糖乳桿菌， 且分離出屬于片球菌屬的乳酸片球菌和屬于魏斯氏菌屬的食竇魏斯氏、融合魏斯氏。有研究表明，片球菌屬、魏斯氏屬同樣存在于緬甸發(fā)酵魚制品中[18]，這些菌株對發(fā)酵制品品質(zhì)的影響值得深入研究。 干燥的沙特阿拉伯地區(qū)的發(fā)酵魚制品優(yōu)勢菌屬是芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬[19]。 可見，氣候是影響優(yōu)勢菌群的因素之一。 研究發(fā)現(xiàn)我國江浙地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵制品蟹糊中的優(yōu)勢菌是葡萄球菌[20-21]，而韓國發(fā)酵蟹醬中優(yōu)勢菌屬為魏斯氏菌屬[22]，蝦醬中優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬[23]，這與海南蟹醬、蝦醬中的優(yōu)勢菌群存在顯著差異，可能是由于不同國家、地區(qū)制作工藝不同，原料本身所攜帶的優(yōu)勢菌種以及初始發(fā)酵時(shí)腌制環(huán)境不同所致。同樣，呂彥等[24]認(rèn)為蟹醬中嗜鹽微生物的優(yōu)勢菌種可能是葡萄球菌， 柬埔寨蝦醬中葡萄球菌豐度也較高[25]，且影響蟹醬與蝦醬品質(zhì)。 本研究未從蟹醬中分離出葡萄球菌， 而從蝦醬中分離出6 株葡萄球菌， 葡萄球菌對海南蝦醬品質(zhì)風(fēng)味的影響值得探究。 僅在海南發(fā)酵海產(chǎn)品——蝦醬中發(fā)現(xiàn)的橋乳桿菌，在菲律賓發(fā)酵蝦醬種也有所發(fā)現(xiàn)[8]。 通過對9 個(gè)發(fā)酵海產(chǎn)品的微生物群落及差異性菌屬的分析，發(fā)現(xiàn)蟹醬、蝦醬、魚醬的微生物群落存在明顯差異， 其中蟹醬與魚醬的微生物群落差異性最大，體現(xiàn)海南發(fā)酵海產(chǎn)品微生物群落特征。