何可人 王珊 于敬會(huì) 單莉莉 陳惠娜

【摘要】 目的：觀察妊娠期糖尿病患者外周血中Th1/Th2細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平的變化。方法：選擇在筆者所在醫(yī)院就診的50例妊娠期糖尿病患者為觀察組，50例健康妊娠的孕婦為對(duì)照組，收集觀察組和對(duì)照組產(chǎn)婦的外周血，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析Th1/Th2細(xì)胞比例，采用ELISA檢測(cè)白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、干擾素-γ（IFN-γ）的表達(dá)水平。結(jié)果：觀察組患者外周血中Th1/Th2細(xì)胞的比例高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;觀察組患者外周血中IL-2、IFN-γ的表達(dá)水平高于對(duì)照組，IL-4、IL-10的表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：妊娠期糖尿病患者外周血中Th1/Th2細(xì)胞比例失衡，Th1細(xì)胞因子表達(dá)升高，Th2細(xì)胞因子表達(dá)降低，Th1/Th2免疫平衡的改變可能是妊娠期糖尿病免疫診斷和干預(yù)的新靶點(diǎn)，為妊娠期糖尿病的治療提供試驗(yàn)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 妊娠期糖尿病患者 Th1/Th2細(xì)胞 外周血 細(xì)胞因子 表達(dá)水平

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.19.026 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1674-6805（2020）19-00-03

Changes of Th1 / Th2 Cells and Related Cytokines Expression in Peripheral Blood of Gestational Diabetes Mellitus/HE Keren， WANG Shan， YU Jinghui， SHAN Lili， CHEN Huina. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（19）： -68

[Abstract] Objective： To observe the expression of Th1/Th2 cells and related cytokines in the peripheral blood of patients with gestational diabetes mellitus. Method： Totally 50 cases of gestational diabetes in our hospital were selected as the observation group and 50 cases of healthy pregnant women as the control group. The peripheral blood of the observation group and the control group were collected. The proportion of Th1/Th2 cells was analyzed by flow cytometry. The levels of IL-2， IL-4， IL-10， IFN-γ were detected by ELISA The level of expression. Result： The proportion of Th1/Th2 cells in the peripheral blood of the observation group was higher than that of the control group， the difference was statistically significant （P<0.05）. The expression level of IL-2 and IFN-γ in the peripheral blood of the observation group were higher than those of the control group， and the expression level of IL-4 and IL-10 were lower than those of the control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion： The imbalance of Th1/Th2 cell proportion， the increase of Th1 cytokine expression and the decrease of Th2 cytokine expression in the peripheral blood of patients with gestational diabetes mellitus may be the new target of immunodiagnosis and intervention of gestational diabetes mellitus， and provide experimental basis for the treatment of gestational diabetes mellitus.

[Key words] Gestational diabetes mellitus Th1/Th2 cells Peripheral blood Cytokines Expression level

First-authors address： Shenzhen Polytechnic， Shenzhen 518000， China

妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）是妊娠階段常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，多發(fā)生于妊娠中晚期，表現(xiàn)為妊娠后首次發(fā)現(xiàn)葡萄糖耐量異常，容易引發(fā)患者出現(xiàn)產(chǎn)科并發(fā)癥，危及母體和胎兒的生命健康[1]。研究顯示，GDM的發(fā)生可能和遺傳因素、代謝紊亂、胰島素抵抗、妊娠激素和免疫反應(yīng)等相關(guān)，探索其具體發(fā)病機(jī)制和治療策略仍是當(dāng)前亟待解決的科學(xué)難題[2]。輔助性T細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成成分，可分為T(mén)h1、Th2等多種亞群，對(duì)體液免疫和細(xì)胞免疫均有重要的調(diào)節(jié)作用[3]。呂芳等[4]研究發(fā)現(xiàn)GDM患者外周血中IL-6和TNF-α表達(dá)增多，其變化與胰島素抵抗呈正相關(guān)，提示免疫功能改變可能參與GDM病理過(guò)程。本研究對(duì)GDM患者外周血中的Th1/Th2細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子水平的變化進(jìn)行研究，探討Th1/Th2細(xì)胞平衡在GDM中的作用及可能的機(jī)制，為GDM的防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以2018年1月-2020年1月在筆者所在醫(yī)院就診的GDM孕婦和正常妊娠產(chǎn)婦各50例為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）單胎且足月妊娠;（2）GDM患者符合2015年10月國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟發(fā)表的關(guān)于GDM的實(shí)用指南，即餐后2 h血糖值≥8.5 mmol/L或餐后1 h血糖值≥10.0 mmol/L或靜脈血空腹血糖值≥5.1 mmol/L;

（3）無(wú)妊娠合并癥和并發(fā)癥;（4）能夠配合完成研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）妊娠期高血壓或慢性高血壓患者;（2）存在反復(fù)流產(chǎn)病史患者;（3）存在免疫病史患者;（4）近3個(gè)月有急慢性感染情況;（5）存在內(nèi)分泌疾病或使用類(lèi)固醇皮質(zhì)激素或免疫抑制劑治療的患者;（6）存在精神疾病或心腦血管疾病。GDM孕婦為觀察組，年齡22～45歲，平均（30.48±8.17）歲;分娩孕周37～42周，平均（38.97±1.94）周。正常妊娠產(chǎn)婦為對(duì)照組，年齡23～41歲，平均（29.75±8.13）歲;孕周38～41周，平均（39.83±1.97）周。兩組患者的年齡和孕周等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且所有研究對(duì)象知情同意并簽署協(xié)議書(shū)。

1.2 方法

于分娩前抽取各研究對(duì)象空腹時(shí)的靜脈血6 ml。

取3 ml外周血置于EDTA處理過(guò)的抗凝管中，加入淋巴細(xì)胞分離液，2 000轉(zhuǎn)20 min離心，吸取中間淋巴細(xì)胞層，獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107/ml，加入至細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入250×PMA/lonomycin和250×Monensin/BFA，混合均勻后于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)5～6 h，加入anti-CD3 FITC（eBiosciences公司）和anti-CD4 PERCP（eBiosciences公司）對(duì)細(xì)胞表面抗原進(jìn)行染色，使用FIX&PERM Reagent A進(jìn)行細(xì)胞破膜，使用anti-IFN-γ APC（Miltenyi公司）和anti-IL-4 PE（eBiosciences公司）進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，以同型IgG抗體（eBiosciences公司）作為對(duì)照，應(yīng)用BD FACS流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th1和Th2細(xì)胞，Th1為INF-γ+的CD4+細(xì)胞，Th2細(xì)胞為IL-4+的CD4+細(xì)胞。取3 ml外周血置于促凝管中，3 000轉(zhuǎn)10 min離心，將上清分離至無(wú)菌EP管中，使用IL-2、IL-4、IL-40和IFN-γ的ELISA試劑盒（均購(gòu)于聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）檢測(cè)各細(xì)胞因子的外周血表達(dá)水平，具體步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用Students t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者外周血中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ表達(dá)水平的變化

觀察組患者外周血中IL-2和IFN-γ的水平高于對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;觀察組患者外周血中IL-4和IL-10的水平低于對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2 兩組患者外周血中Th1/Th2細(xì)胞比例變化

觀察組患者外周血中Th1細(xì)胞數(shù)量多于對(duì)照組，Th2細(xì)胞數(shù)量少于對(duì)照組，Th1/Th2細(xì)胞比例高于對(duì)照組，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖1、表2。

3 討論

GDM患者更容易引發(fā)產(chǎn)婦或胎兒出現(xiàn)先兆子癇、早產(chǎn)、低體重兒等嚴(yán)重情況，逐漸成為當(dāng)前關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題之一。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，亞洲女性GDM的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)明顯高于其他種族女性，且發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)[5-6]。研究表明，GDM的發(fā)病機(jī)制與胰島素抵抗、機(jī)體免疫反應(yīng)等因素密切相關(guān)[7]。T淋巴細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞表面特異性抗原的不同分為不同的亞群，CD4+T淋巴細(xì)胞也被稱(chēng)為輔助性T淋巴細(xì)胞，根據(jù)其功能和細(xì)胞表面標(biāo)志物的差異分為T(mén)h1、Th2、Treg等細(xì)胞亞群，對(duì)于機(jī)體的特異和非特異、體液免疫和細(xì)胞免疫有重要的調(diào)節(jié)功能[8]。

Th1和Th2細(xì)胞在正常免疫系統(tǒng)和疾病過(guò)程中有重要的作用，Th1細(xì)胞可介導(dǎo)細(xì)胞免疫，分泌IL-1、IL-2、IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子，產(chǎn)生免疫功能;Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-6、IL-10和GM-CSF等細(xì)胞因子，介導(dǎo)體液免疫[9]。曹向可等[10]發(fā)現(xiàn)GDM患者體內(nèi)的C-RP、TNF-α和IL-6的水平高于健康孕婦組，提示GDM病理過(guò)程中存在炎癥反應(yīng)和免疫功能異常。本試驗(yàn)通過(guò)ELISA檢測(cè)GDM患者和正常孕婦的外周血中細(xì)胞因子水平發(fā)現(xiàn)，GDM患者外周血中Th1細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ的水平升高，Th2細(xì)胞因子IL-4和IL-10水平降低，和上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，提示GDM病理過(guò)程中的炎癥反應(yīng)。李曉雅等[11]提出對(duì)促炎因子和抗炎因子的檢測(cè)可能會(huì)為GDM的早起診斷和干預(yù)提供重要依據(jù)。

對(duì)外周血中的Th1和Th2細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，結(jié)果顯示GDM患者外周血中Th1細(xì)胞增多，Th2細(xì)胞減少，Th1/Th2細(xì)胞比例升高，提示GDM患者外周血中存在Th1/Th2免疫失衡。王芬等[12]發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者外周血中Treg細(xì)胞的抑制功能減弱，使得體內(nèi)Th1、Th2、Th17等效應(yīng)細(xì)胞功能增強(qiáng)，參與糖尿病的病理過(guò)程。在對(duì)GDM孕婦外周血中的淋巴細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)CD3+CD4+ICOS+細(xì)胞比例升高，說(shuō)明GDM患者存在免疫功能紊亂，和本文研究結(jié)果一致，提示Th1/Th2細(xì)胞的改變可能會(huì)成為GDM患者的治療靶點(diǎn)之一。胰島素抵抗是糖尿病重要的發(fā)病原因，Th1/Th2細(xì)胞及細(xì)胞因子的改變與胰島素抵抗的關(guān)系值得進(jìn)一步探索。

綜上所述，Th1/Th2細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子水平與GDM患者的炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)，GDM患者外周血中IL-2和IFN-γ的水平升高，IL-4和IL-10的水平下降，Th1/Th2細(xì)胞平衡紊亂，為GDM的診斷和治療提供理論依據(jù)。

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（收稿日期：2020-03-06） （本文編輯：郎序瑩）