飼鴿者肺SD大鼠模型的建立及病理表現(xiàn)研究

牛宗新 鄔超 李亞防 廉志闖 楊曉紅

【摘要】 目的：建立飼鴿者肺SD大鼠模型，比較不同時期飼鴿者肺模型的病理表現(xiàn)。方法：選用清潔級健康SD大鼠36只，隨機(jī)分為兩組，對照組12只，實(shí)驗組24只。對照組給予0.9%氯化鈉溶液霧化吸入，實(shí)驗組給予鴿子糞便、羽毛、皮屑等脫落物制備凍干粉溶液霧化吸入，2 h/d，共16周。造模第1、2、4、12、14周，實(shí)驗組隨機(jī)選取3只大鼠取組織標(biāo)本。第16周處死全部大鼠。結(jié)果：造模第1周出現(xiàn)急性期表現(xiàn)，第2～14周均為亞急性期表現(xiàn)，第16周開始出現(xiàn)慢性期表現(xiàn)，實(shí)驗組和對照組病理表現(xiàn)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。結(jié)論：鴿子糞便、羽毛、皮屑等脫落物的蛋白提取物可以構(gòu)建不同病理分期的飼鴿者肺SD大鼠動物模型，可根據(jù)需求選擇不同的時間造模。

【關(guān)鍵詞】 飼鴿者肺 SD大鼠 動物模型

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.19.070 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 B 文章編號 1674-6805（2020）19-0-03

Study on the Establishment and Pathological Performance of Lung SD Rat Models in Pigeon Breeder's Lung/NIU Zongxin， WU Chao， LI Yafang， LIAN Zhichuang， YANG Xiaohong. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（19）： -174

[Abstract] Objective： To establish a Sprague-Dawley rat （SD rat） model of the pigeon breeder's lung and to compare the pathological performance of the lung model of pigeon breeder in different periods. Method： A total of 36 clean-level health SD rats were randomly divided into 2 groups， 12 cases in the control group and 24 cases in the experimental group. Rats in the control group were atomized inhaled of 0.9% Sodium Chloride Solution， rats in the experimental group were atomized inhaled with Freeze-dried Powder Solution which were made up by pigeon dung， feathers and dander， 2 hours per day， for a period of 16 weeks. At the 1， 2， 4， 12， 14 week of intervention， 3 rats were randomly selected from the experimental group to execute for their lung tissue samples. All rats were executed in week 16. Result： The pathological characteristics of acute period were observed in the first week， the pathological characteristics of subacute period were observed in week 2 to 14， chronic period performance in week 16. There were statistically significant differences in pathological manifestations between the experimental group and the control group （P=0.000）. Conclusion： The freeze-dried powder solution which were made up of pigeon dung， feathers， and dander can establish SD rat models of pigeon breeders lung， and choose different time according to the need.

[Key words] Pigeon breeders lung Sprague-Dawley rat Animal models

First-authors address： Shihezi University Medical School， Shihezi 832002， China

飼鴿者肺（pigeon breeders lung，PBL）屬于外源性過敏性肺泡炎或過敏性肺炎（hypersensitivity pneumonitis， HP），是敏感個體反復(fù)吸入鴿子糞便、羽毛、皮屑等脫落物蛋白后誘發(fā)的肺部炎癥反應(yīng)性疾病[1-2]。飼鴿者肺急性期癥狀有發(fā)熱、咳嗽、乏力等非特異性癥狀[3]，亞急性期主要表現(xiàn)為胸悶、氣短等癥狀[4]。臨床工作中該疾病診斷困難，早期病變很少行肺活檢，病理資料相對較少，本實(shí)驗旨在建立飼鴿者肺動物模型為后續(xù)該疾病研究提供一定幫助，并觀察研究各期病理改變，對該疾病進(jìn)一步研究及臨床診斷提供一定幫助，具體如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物

本實(shí)驗采用清潔級健康成年SD大鼠（sprague-dawley rat， SD Rat），雌雄不拘，6～8周齡，體重180～200 g，購于常州卡文斯動物實(shí)驗有限公司，實(shí)驗動物許可證號：SCXK（蘇）2016-0010。SD大鼠飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)良好，保持清潔，飼養(yǎng)溫度保持在21 ℃～24 ℃，相對濕度45%～50%，用標(biāo)準(zhǔn)大鼠箱飼養(yǎng)，2～3只/箱，水料充足。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將36只SD大鼠編號1～36，根據(jù)體重是否大于190 g將大鼠分為A組、B組，再使用抽簽的方法將兩組各隨機(jī)分為三組（A1～A3，B1～B3），其中A1和B1組合成對照組（12只），A2、A3、B2、B3組合為實(shí)驗組（24只）。實(shí)驗試劑：無水乙醇、二甲苯、中性樹脂購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，蘇木素、伊紅染液購于珠海貝索，鹽酸購于南京化學(xué)試劑有限公司，氨水購于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗儀器：超聲波霧化器（粵華，WH-2000），組織脫水機(jī)（常州普銳斯新，PQT-A），組織包埋機(jī)（常州普銳斯新，PBM-A），石蠟切片機(jī)（德國徠卡，RM2235），光學(xué)顯微鏡（日本尼康，NIKON H550S）。

1.2 方法

收集新鮮的鴿子糞便、羽毛、皮屑等脫落物，并按照1∶20體積的磷酸鹽緩沖鹽溶液室溫攪拌24 h。用50%硫酸銨混合后萃取，得到部分飽和溶液。將部分飽和溶液用蒸餾水充分透析并凍干保存。在進(jìn)行吸入試驗之前，將10 mg凍干粉與1 ml蒸餾水一起攪拌，并以12 000轉(zhuǎn)/min的速度離心3次，持續(xù)30 min，收集上清液并通過過濾用以霧化吸入[5]。實(shí)驗將大鼠置于封閉的霧化箱內(nèi)霧化，2 h/d。對照組霧化吸入0.9%氯化鈉溶液，實(shí)驗組在封閉的霧化箱內(nèi)對SD大鼠每天霧化2 h，分別于第1、2、4、12、14周從實(shí)驗組隨機(jī)選取3只大鼠，行腹腔注射戊巴比妥鈉（10 mg/kg）處死大鼠，立即解剖取出肺組織，將肺組織固定于4%多聚甲醛。第16周處死所有實(shí)驗組剩余大鼠及對照組大鼠。肺組織固定24 h后，取材、組織脫水、石蠟包埋、切片、分別蘇木精-伊紅（HE）染色及Masson染色，染色后切片由三位病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片。

1.3 觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

病理診斷標(biāo)準(zhǔn)采用實(shí)用內(nèi)科學(xué)HP診斷標(biāo)準(zhǔn)：急性期表現(xiàn)為肺泡及肺間質(zhì)內(nèi)有明顯的淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)有滲出物，肺泡毛細(xì)血管呈血管炎表現(xiàn);亞急性期主要表現(xiàn)為細(xì)支氣管周圍淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞為主的間質(zhì)浸潤，可有非干酪樣肉芽腫形成;慢性期表現(xiàn)為肺泡間隔有不同程度的淋巴細(xì)胞浸潤和膠原纖維增生[6-7]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用Fishers確切概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

對照組大鼠活動好，食欲正常;實(shí)驗組大鼠活動略減少，較對照組精神萎靡有咳嗽現(xiàn)象，食欲減低，對外界刺激反應(yīng)較遲緩。

2.2 病理表現(xiàn)

造模期間兩組均無大鼠非計劃死亡。實(shí)驗組第1、2、4、12、14周處死的大鼠病理分期見表1，第1周均為急性期，第2周出現(xiàn)亞急性期表現(xiàn);第16周處死的實(shí)驗組及對照組大鼠病理分期見表2，16周出現(xiàn)慢性期表現(xiàn)。實(shí)驗組病理改變均為陽性，對照組均為正常肺組織，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000），見表3。大鼠各病理分期結(jié)果見圖1、圖2。

3 討論

飼鴿者肺的發(fā)病原理為宿主反復(fù)吸入鴿子糞、鴿子羽毛中含有的蛋白質(zhì)抗原引起的細(xì)胞免疫和體液免疫過敏反應(yīng)，當(dāng)宿主反復(fù)吸入抗原時，抗原附著于支氣管壁及其周圍，肺泡壁和細(xì)支氣管壁由淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)及后續(xù)修復(fù)[8]。由于早期臨床癥狀不典型常被患者忽略，或被誤診為其他疾病，亞急性期及晚期由于無特異性檢查，難于和其他肺間質(zhì)病變鑒別診斷[9]。既往動物實(shí)驗中存在不同抗原提取物的提取方法，本實(shí)驗采用抗原制作方法參考Ohtani等[5]的制作方法，Edwards等[10-11]也提出過抗原方法，與本實(shí)驗所使用方法基本類似，使用脫水和稀釋液體略有不同。

動物實(shí)驗中氣道造模方法中有氣道滴灌、腹腔注射、靜脈注射、皮下注射、氣道霧化等實(shí)驗方式，本實(shí)驗使用鴿子糞、羽毛、皮屑等脫落提取物制作凍干粉蛋白溶于蒸餾水中，通過霧化氣道吸入，模擬現(xiàn)實(shí)世界飼鴿者肺發(fā)病過程。飼鴿者肺以肺部病變?yōu)橹?，既往動物?shí)驗中存在腹腔注射、皮下注射、靜脈注射、滴鼻法等實(shí)驗方式，靜脈注射方式一次大量抗原抗體結(jié)合，容易引起全身急性免疫反應(yīng)，容易產(chǎn)生急性肝損傷、多器官功能衰竭等疾病造模，肺部改變效果欠佳，通常用于膿毒癥等相關(guān)研究[12]。腹腔注射是動物實(shí)驗中較常用的造模方法，主要原理與靜脈注射基本相同，從腹腔血管吸收入血，容易產(chǎn)生注射部位感染或者注射過程中注射至腹腔大血管、腹腔臟器等位置[13]，導(dǎo)致動物非計劃性死亡。皮下注射與飼鴿者肺發(fā)病機(jī)制存在差異，未考慮該方法。經(jīng)鼻滴入方法通常用于哮喘、鼻炎模型的制作，可能與經(jīng)鼻滴入后抗原存在于上呼吸道，部分實(shí)驗動物吞入消化道導(dǎo)致抗原接觸不穩(wěn)定，造模成功率低有一定相關(guān)性[14]。

本實(shí)驗使用過敏原霧化吸入方式模擬現(xiàn)實(shí)世界中抗原暴露場景，呼吸道直接暴露于過敏原，霧化抗原微粒通過密閉容器較容易且均勻的吸入SD大鼠肺中，其大小對顆粒沉積位置有直接影響。一般來說，霧化顆粒直徑大小和沉積位置關(guān)系如下：有效霧化顆粒直徑應(yīng)在0.5～10 μm，顆粒3～5 μm的霧粒主要沉積于肺部，顆粒小于3 μm的霧粒50%～60%沉積于肺泡，霧化器可以使顆粒大小控制在1～5 μm[15]。第一周急性期表現(xiàn)大鼠肺泡腔可見淋巴細(xì)胞為主的改變，少量嗜酸細(xì)胞浸潤，符合飼鴿者肺急性期抗原附著于肺泡壁引起的炎性改變。2～14周肺間質(zhì)炎癥持續(xù)反應(yīng)，支氣管周圍可見淋巴細(xì)胞浸潤，可能與巨噬細(xì)胞在抗原聚集區(qū)域周圍釋放促炎癥因子加重局部炎癥反應(yīng)相關(guān)，這可能是飼鴿者肺胸部CT表現(xiàn)為馬賽克癥及小結(jié)節(jié)的原因之一[16]。16周可見肺泡及肺泡間隔彌漫性炎細(xì)胞浸潤和散在膠原纖維增生，膠原纖維增生在炎癥后出現(xiàn)通常表示疾病進(jìn)入慢性階段。