黃鈺馨 馬玲 李苗 鄭國(guó)保 馬小榮

中圖分類號(hào) R927.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2020）14-1700-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.14.07

摘 要 目的：建立枸杞子中甜菜堿的含量測(cè)定方法，并優(yōu)化其提取方法。方法：采用高效液相色譜法測(cè)定枸杞子中甜菜堿的含量，色譜柱為Waters Spherisorb NH2，流動(dòng)相為乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀水溶液（75 ∶ 25，V/V），流速為0.7 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為195 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。以甜菜堿含量為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)枸杞子中甜菜堿超聲提取的甲醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、料液比進(jìn)行篩選并進(jìn)行驗(yàn)證。測(cè)定10批枸杞子中甜菜堿的含量，并與2015年版《中國(guó)藥典》收錄的薄層色譜法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果：甜菜堿檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為2.035～2 035.04 μg/mL（R 2=0.999 3）;檢測(cè)限、定量限分別為0.410、2.051 μg/mL，平均加樣回收率為97.41%～98.86%（RSD為0.8%～1.4%，n=3），精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性（24 h）試驗(yàn)的RSD均不大于1.2%。最優(yōu)提取方法為料液比1 ∶ 30（g/mL）投料、甲醇超聲提取45 min。3次驗(yàn)證試驗(yàn)所得提取液中甜菜堿的平均含量為2.30%（RSD=0.43%， n=3）。10批枸杞子中甜菜堿的含量為1.91%～2.55%，與薄層色譜法的測(cè)定結(jié)果（1.88%～2.60%）無(wú)明顯差異（相對(duì)誤差為-1.92%～2.7%）。結(jié)論：成功建立了枸杞子中甜菜堿的含量測(cè)定方法，并優(yōu)化了其提取工藝。

關(guān)鍵詞 枸杞子;甜菜堿;高效液相色譜法;含量測(cè)定;提取方法

Establishment of the Content Determination Method of Betaine in Lycium barbarum and Optimization of the Extraction Method

HUANG Yuxin1，MA Ling1，LI Miao2，ZHENG Guobao2，MA Xiaorong1（1. Ningxia Hui Autonomous Region Institute of Drug Control， Yinchuan 750002， China; 2. Agricultural Biotechnology Research Center of Ningxia Academy of Agricultural and Forestry Sciences， Yinchuan 750002， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the content determination method of betaine in Lycium barbarum， and to optimize the extraction method. METHODS：HPLC method was used to determine the content of betaine in L. barbarum. The determination was performed on Waters Spherisorb NH2 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.01 mol/L monopotassiun phosphate aqueous solution （75 ∶ 25， V/V） at the flow rate was 0.7 mL/min. The detection wavelength was 195 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. Using the content of betaine as index， on the basis of single factor tests， L9（34） orthogonal test design were used to select the methanol volume fraction， extraction time and solid-liquid ratio of betaine in L. barbarum by ultrasonic extraction. The contents of betaine in 10 batches L. barbarum were determined， and compared with the results of TLC included in 2015 edition of Chinese Pharmacopeia. RESULTS： The linear range of betaine was 2.035-2 035.04 μg/mL（R2=0.999 3）. The limits of detection and quantification were 0.410 μg/mL and 2.051 μg/mL， respectively. The average recovery were 97.41%-98.86% （RSDs were 0.8%-1.4%， n=3）. RSDs of precision， reproducibility and stability （24 h） tests were not higher than 1.2%. The optimal extraction method included solid-liquid ration of 1 ∶ 30 （g/mL）， ultrasonic extraction with methanol for 45 min. The average content of betaine in the extract from the three validation tests was 2.30% （RSD=0.43%， n=3）. The contents of betaine in 10 batches L. barbarum were 1.91%-2.55%， which was no significantly different from the results of TLC （1.88%-2.60%）（RE were -1.92%-2.79%）. CONCLUSIONS： The content determination method of betaine in L. barbarum was established successfully， and the extraction process was optinized.

KEYWORDS? ?Lycium barbarum; Betaine; HPLC; Content determination; Extraction method

枸杞子為茄科植物寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）的干燥成熟果實(shí)[1]，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，具有治療糖尿病[2]、保護(hù)視網(wǎng)膜[3]、抗氧化[4]等作用。甜菜堿是枸杞果實(shí)、葉、柄中主要的生物堿類成分，在人體內(nèi)起甲基供體的作用[5]，具有促進(jìn)脂肪代謝、調(diào)節(jié)滲透壓、抗應(yīng)激等功效[6-8]，被認(rèn)為是枸杞子的主要活性物質(zhì)之一[9]。目前，2015年版《中國(guó)藥典》（一部）記載的枸杞子中甜菜堿含量測(cè)定方法為薄層色譜法[1]，該方法操作繁瑣、人為因素影響較大、靈敏度低、分離效果和重現(xiàn)性較差。高效液相色譜法（HPLC）作為一種現(xiàn)代分離分析技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于中藥化學(xué)成分的分離分析和含量測(cè)定中[10-12]。已有研究報(bào)道，采用HPLC法測(cè)定甜菜堿提取物的含量，但多使用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，且柱前衍生等樣品處理和提取方法較為復(fù)雜[13-16]，使得上述方法的精密度或準(zhǔn)確性均受影響。在此基礎(chǔ)上，本研究建立了測(cè)定枸杞子中甜菜堿含量的HPLC法;并以甜菜堿含量為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)其提取方法進(jìn)行了篩選;同時(shí)，將所建HPLC法與《中國(guó)藥典》方法進(jìn)行了比較，旨在為枸杞子的質(zhì)量控制和甜菜堿的提取提供方法支持。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀（美國(guó)Agilent 公司）;XS205DU型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司];CQ- 200B-DST型超聲波清洗器（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠）;800Y型粉碎機(jī)（永康市鉑歐五金制品有限公司）。

1.2 藥品與試劑

甜菜堿對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110894-201604，純度：99.2%）;10批枸杞子藥材（批號(hào)：NKY01～NKY10）采自寧夏銀川市賀蘭縣項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)基地，由寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心鄭國(guó)保副研究員鑒定為寧夏枸杞（L. barbarum L.）的成熟果實(shí);甲醇、乙腈為色譜純，磷酸二氫鉀等其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 甜菜堿含量測(cè)定方法的建立

2.1.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱取甜菜堿對(duì)照品適量，置于15 mL量瓶中，加入甲醇溶解、稀釋并定容，制成質(zhì)量濃度為5.087 6 mg/mL的對(duì)照品貯備液。精密量取上述對(duì)照品貯備液1 mL，置于5 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為1 017.5 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備

取枸杞子樣品，于50 ℃烘干后，冷凍，粉碎，過(guò)二號(hào)篩，精密稱取粉末1.0 g，按一定方法提取后，用0.45 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.3 色譜條件

色譜柱：Waters Spherisorb NH2（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀水溶液（75 ∶ 25，V/V）;流速：0.7 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：195 nm;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。取對(duì)照品溶液、供試品溶液（批號(hào)：NKY01）和空白溶劑（甲醇）各適量，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見(jiàn)圖1。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密量取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液0.002、0.01、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分別置于5 mL量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，得系列工作溶液。按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以甜菜堿的質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=2 848x+13.10（R 2=0.999 3），甜菜堿檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為2.035～2 035.04 μg/mL。

2.1.5 檢測(cè)限和定量限考察

精密量取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液適量，用甲醇逐級(jí)稀釋，分別以信噪比為3 ∶ 1、10 ∶ 1計(jì)算檢測(cè)限、定量限。結(jié)果，甜菜堿的檢測(cè)限為0.410 μg/mL，定量限為2.051 μg/mL。

2.1.6 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.1.1”項(xiàng)下質(zhì)量濃度為1 017.5 μg/mL的對(duì)照品溶液適量，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，甜菜堿峰面積的RSD為0.5%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取枸杞子樣品（批號(hào)：NKY01），共6份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算甜菜堿的含量。結(jié)果，甜菜堿含量的RSD為1.0%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：NKY01）適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、16、20、24 h時(shí)按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，甜菜堿峰面積的RSD為1.2%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的枸杞子樣品（批號(hào)：NKY01），粉碎，取粉末9份，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液0.5、1.0、1.5 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 甜菜堿提取方法篩選

2.2.1 單因素試驗(yàn)

（1）提取方法：精密稱取干燥后的枸杞子樣品（批號(hào)：NKY01）6份，每份1.0 g，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，稱定質(zhì)量。取3份超聲（功率：250 W，頻率：33 kHz，下同）提取60 min，另外3份加熱回流提取60 min，均冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算甜菜堿含量。結(jié)果，超聲提取和加熱回流提取的提取液中甜菜堿的平均含量分別為2.20%和2.19%（n=3），兩種方法所得甜菜堿的含量相似。故綜合考慮實(shí)際操作和人為影響，最終選擇超聲提取作為枸杞子中甜菜堿的提取方法。

（2）提取溶劑：精密稱取干燥后的枸杞子樣品（批號(hào)：NKY01）7份，每份1.0 g，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇、80%甲醇、70%甲醇、60%甲醇、50%甲醇、水和0.1 mol/L鹽酸溶液各30 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理40 min，冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，用相應(yīng)提取溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算甜菜堿含量。結(jié)果，上述溶劑提取液中甜菜堿的含量分別為2.21%、2.10%、1.95%、1.82%、1.80%、1.51%、1.43%，其中含量較高的溶劑依次為甲醇、80%甲醇、70%甲醇。

（3）提取時(shí)間：精密稱取干燥后的枸杞子樣品（批號(hào)：NKY01）8份，每份1.0 g，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，稱定質(zhì)量，分別超聲提取20、25、30、35、40、45、50、55 min，冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算甜菜堿含量。結(jié)果，上述提取時(shí)間提取液中甜菜堿的含量分別為1.68%、1.85%、2.02%、2.10%、2.13%、2.20%、2.21%、2.19%。可見(jiàn)，當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)45 min后，甜菜堿含量的變化不大。

（4）料液比：精密稱取干燥后的枸杞子樣品（批號(hào)：NKY01）5份，每份1.0 g，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10、20、30、40、50 mL，即料液比分別為1 ∶ 10、1 ∶ 20、1 ∶ 30、1 ∶ 40、1 ∶ 50（g/mL），稱定質(zhì)量，超聲提取45 min，放至室溫，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算甜菜堿含量。結(jié)果，上述料液比提取液中甜菜堿含量分別為1.85%、1.92%、2.20%、2.21%、2.19%?？梢?jiàn)，當(dāng)料液比為1 ∶ 30、1 ∶ 40、1 ∶ 50時(shí)甜菜堿含量較高，且差異不大。

2.2.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以甲醇體積分?jǐn)?shù)（A，%）、提取時(shí)間（B，min）、料液比（C，g/mL）為考察因素，甜菜堿含量為指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)枸杞子中甜菜堿的提取方法進(jìn)行優(yōu)化。因素與水平見(jiàn)表2，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

由表3結(jié)果可知，各因素對(duì)甜菜堿含量影響程度的排序?yàn)锳>C>B，即甲醇體積分?jǐn)?shù)>料液比>提取時(shí)間。由表4方差分析結(jié)果可知，甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)甜菜堿含量有顯著影響（P<0.05），提取時(shí)間和料液比對(duì)甜菜堿含量無(wú)顯著影響（P>0.05）。綜合考慮極差分析和方差分析結(jié)果，確定最優(yōu)提取條件為A1B2C2，即以料液比1 ∶ 30投料，甲醇超聲提取45 min。

精密稱取枸杞子（批號(hào)：NKY01）1.0 g，共3份，按上述最優(yōu)提取條件超聲提取甜菜堿，按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算提取液中甜菜堿含量。結(jié)果，甜菜堿平均含量為2.30%（RSD=0.43%，n=3），表明此提取方法可行。

2.3 含量測(cè)定方法比較

分別取10批枸杞子樣品各1 g，按“2.2.2”項(xiàng)下最優(yōu)提取方法提取，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算甜菜堿含量;同時(shí)，按照2015年版《中國(guó)藥典》（一部）中收錄的薄層色譜法[1]測(cè)定供試品溶液中甜菜堿含量，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可見(jiàn)，兩種方法測(cè)定結(jié)果的相對(duì)誤差為-1.92%～2.79%，表明兩種方法測(cè)定結(jié)果幾乎無(wú)明顯差異。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

由于枸杞子中成分具有多樣性，將目標(biāo)成分與其他成分有效分離是進(jìn)行定量分析的關(guān)鍵。本課題組前期考察了不同色譜柱[Agilent Zorbax NH2色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Zorbax 300-SCXA色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Spherisorb NH2色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）]、不同流動(dòng)相比例（60 ∶ 40、70 ∶ 30、75 ∶ 25、80 ∶ 20，V/V）對(duì)甜菜堿分離的影響。結(jié)果，Waters Spherisorb NH2柱中甜菜堿色譜峰與其他成分色譜峰的分離效果優(yōu)于其他色譜柱，且當(dāng)乙腈-0.01mol/L磷酸二氫鉀水溶液的比例為75 ∶ 25（V/V）時(shí)，色譜峰之間分離效果較好。

3.2 浸潤(rùn)提取法的考察

本研究在前期篩選提取方法時(shí)，還考察了浸潤(rùn)提取法的提取效果，分別測(cè)定了浸潤(rùn)20、25、30、35、40、45、50、55 min時(shí)同一批枸杞子（批號(hào)：NKY01）提取液中甜菜堿的含量。結(jié)果，上述提取時(shí)間的提取液中甜菜堿含量均低于2.00%，均較超聲提取法和加熱回流提取法的含量低，故未將該法列入單因素試驗(yàn)。

綜上所述，本研究建立了甜菜堿含量測(cè)定的HPLC法，并通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)篩選了枸杞子中甜菜堿的最佳提取方法，通過(guò)比較本研究所建HPLC法測(cè)定結(jié)果與《中國(guó)藥典》薄層色譜法測(cè)定結(jié)果的差異，發(fā)現(xiàn)幾乎無(wú)明顯差異。由此表明，本研究成功建立了枸杞子中甜菜堿的定量分析方法和提取方法，可為枸杞子中甜菜堿的含量測(cè)定提供方法支持。

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（收稿日期：2020-03-20 修回日期：2020-06-04）

（編輯：鄒麗娟）