宮興華 鄭磊 李娟

中圖分類號 R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）14-1715-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.14.10

摘 要 目的：建立同時測定舒肝和胃丸中7-羥基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素、歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯等5種成分含量的方法。方法：采用索氏提取法對舒肝和胃丸進(jìn)行提取，經(jīng)D101型大孔吸附樹脂分離后，采用高效液相色譜法測定上述5種成分的含量。色譜柱為Venusil MP C18，流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為270 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：7-羥基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素、歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為1.875～187.5 μg/mL（r=0.999 9）、1.075～107.5 μg/mL（r=0.999 9）、1.261～126.1 μg/mL（r=0.999 9）、0.875～87.5 μg/mL（r=0.999 9）、2.033～203.3 μg/mL（r=0.999 8），精密度、穩(wěn)定性（24 h）、重復(fù)性、耐用性試驗(yàn)的RSD均小于2.0%，平均加樣回收率分別為95.18%～98.44%（RSD=1.27%，n=6）、95.35%～98.14%（RSD=1.16%，n=6）、95.21%～97.32%（RSD=0.83%，n=6）、95.43%～97.14%（RSD=0.76%，n=6）、95.12%～98.75%（RSD=1.35%，n=6）。3批舒肝和胃丸中上述5種成分的平均含量分別為0.424、0.239、0.305、0.180、0.459 mg/g（n=2）。結(jié)論：成功建立了可同時測定舒肝和胃丸中5種成分含量的方法。

關(guān)鍵詞 舒肝和胃丸;高效液相色譜法;含量測定;7-羥基香豆素;6，7-二甲氧基香豆素;5，7-二甲氧基香豆素;歐前胡素;佛手柑內(nèi)酯

Simultaneous Determination of 5 Components in Shugan Hewei Pills by HPLC

GONG Xinghua1，ZHENG Lei1，LI Juan2（1. Dept. of Pharmacy， Shandong Provincial Third Hospital， Jinan 250031， China; 2. Dept. of Pharmacy， the Second Hospital of Shandong University， Jinan 250033， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of 7-hydroxycoumarin， 6，7-dimethoxy- coumarin， 5，7-dimethoxycoumarin， imperatorin and bergaptene in Shugan hewei pills. METHODS： Samples were extracted by Soxhlet extraction and separated by using D101 macroporous adsorption resin; HPLC method was used to determine the contents of above 5 components. The determination was performed on Venusil MP C18 column with mobile phase consisted of methanol-0.1% phosphoric acid water solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 270 nm and the column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. RESULTS： The linear ranges were 1.875-187.5 μg/mL for 7-hydroxycoumarin （r=0.999 9）， 1.075-107.5 μg/mL for 6，7-dimethoxycoumarin （r=0.999 9）， 1.261-126.1 μg/mL for 5，7-dimethoxycoumarin （r=0.999 9）， 0.875-87.5 μg/mL for imperatorin （r=0.999 9）， 2.033-203.3 μg/mL for bergaptene （r=0.999 8）， respectively. RSDs of precision，stability （24 h）， reproducibility and durability tests were lower than 2.0%. Average recoveries were 95.18%-98.44% （RSD=1.27%，n=6）， 95.35%-98.14% （RSD=1.16%，n=6）， 95.21%-97.32% （RSD=0.83%，n=6）， 95.43%-97.14% （RSD=0.76%，n=6）， 95.12%-98.75% （RSD=1.35%， n=6）， respectively.? The average contents of the above five components in 3 batches of shugan hewei pills were 0.424， 0.239， 0.305， 0.180， 0.459 mg/g （n=2）.CONCLUSIONS： A method for simultaneous determination of five components in Shugan hewei pills was established.

KEYWORDS? ?Shugan hewei pills; HPLC; Content determination; 7-hydroxycoumarin; 6，7-dimethoxycoumarin; 5，7-dimethoxycoumarin; Imperatorin; Bergaptene

舒肝和胃丸由佛手、白芍、醋香附、陳皮、木香等13味中藥組成，具有舒肝解郁、和胃止痛的功效[1]，臨床用于治療肝胃不和、兩脅脹滿、胃脘疼痛、食欲不振、呃逆嘔吐及大便失調(diào)等癥[2]。該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于2015年版《中國藥典》（一部），以芍藥苷作為含量測定指標(biāo)[1]。然而，在舒肝和胃丸中，佛手的用量最大，達(dá)150 g，且為該方君藥，具有疏肝理氣、和胃止痛、燥濕化痰的作用[3-5]。可見，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅以芍藥苷作為舒肝和胃丸含量測定指標(biāo)并不能有效控制組方中君藥佛手的質(zhì)量，更不能有效控制該制劑的整體質(zhì)量。經(jīng)查閱相關(guān)的文獻(xiàn)資料發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有研究多以單一成分的含量作為舒肝和胃丸的質(zhì)量控制指標(biāo)[6-8];此外，單婷婷等[9]對舒肝和胃丸中揮發(fā)性成分進(jìn)行了研究，也僅限于該類成分的指紋圖譜研究。鑒于此，本文以舒肝和胃丸中君藥佛手作為研究對象，擬建立同時測定該方中佛手活性成分7-羥基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素、歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯含量的高效液相色譜法（HPLC），旨在為有效控制舒肝和胃丸的質(zhì)量提供方法支持。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A型HPLC儀，配有二極管陣列檢測器、自動進(jìn)樣器、柱溫箱（日本Shimadzu公司）;1200型HPLC儀（美國Agilent公司）;Meteler XP205型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度：0.01 mg）;KQ-600DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;A10型超純水機(jī)[密理博（中國）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

7-羥基香豆素對照品（批號：111739-200501，供含量測定用）、6，7-二甲氧基香豆素對照品（批號：111740- 200702，供含量測定用）、歐前胡素對照品（批號：110826-201918，純度：99.0%）、佛手柑內(nèi)酯對照品（批號：520036-201401，純度：99.2%）均購自中國食品藥品檢定研究院;5，7-二甲氧基香豆素對照品（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號：A63874，純度：98.0%）;佛手（批號：190901）、白芍（批號：191212）、醋香附（批號：2001015）、陳皮（批號：200304）、木香（批號：190711）、郁金（批號：191203）、炒白術(shù)（批號：190808）、柴胡（批號：20100201）、廣藿香（批號：20191204）、炙甘草（批號：190811）、萊菔子（批號：20191113）、焦檳榔（批號：20190902）、烏藥（批號：200202）等中藥飲片均購自藥店，經(jīng)山東省立第三醫(yī)院李俊峰副主任中藥師鑒定均為真品;舒肝和胃丸（北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，批號：18032500、19033869、19013386，規(guī)格：水蜜丸每100丸重20 g）;D101型大孔吸附樹脂（粒徑：0.25～0.84 mm，天津南大樹脂科技有限公司）;甲醇為色譜純，磷酸為優(yōu)級純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Venusil MP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～9 min，20%A;9～17 min，20%A→50%A;17～30 min，50%A→55%A;30～60 min，55%A→100%A）;流速：1.0 mL/min;檢測波長：270 nm;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液 取舒肝和胃丸適量，研碎，精密稱取粉末約2.0 g，置于250 mL圓底燒瓶中，加入甲醇100 mL，采用索氏提取法提取1 h，提取液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，通過D101型大孔吸附樹脂色譜柱（內(nèi)徑1.5 cm，柱高10 cm），依次用水50 mL、30%甲醇50 mL、甲醇50 mL洗脫，收集甲醇洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用混合溶劑[甲醇-0.1%磷酸水溶液（20 ∶ 80，V/V），下同]轉(zhuǎn)移并定容至10 mL量瓶中，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液 精密稱取7-羥基香豆素對照品37.50 mg、6，7-二甲氧基香豆素對照品21.50 mg、5，7-二甲氧基香豆素對照品25.22 mg、歐前胡素對照品17.50 mg、佛手柑內(nèi)酯對照品40.66 mg，分別置于20 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為各單一對照品貯備液。分別精密量取上述單一對照品貯備液各1 mL，置于同一20 mL量瓶中，用混合溶劑稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得上述成分質(zhì)量濃度分別為93.75、53.75、63.05、43.75、101.65 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照舒肝和胃丸處方配比，稱取除佛手外的12味中藥飲片，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備不含佛手的陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別取空白對照溶液（混合溶劑）、混合對照品溶液、供試品溶液（批號：18032500）和陰性樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，7-羥基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素、歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯的色譜峰峰形對稱，其色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均不小于1.6，空白對照與陰性樣品溶液對5種成分的測定均無干擾，詳見圖1。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取“2.2.2”項(xiàng)下單一對照品貯備液0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mL，分別置于100 mL量瓶中，用混合溶劑稀釋至刻度，搖勻，制成相應(yīng)質(zhì)量濃度的系列對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見表1。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，7-羥基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素、歐前胡素和佛手柑內(nèi)酯等5種成分峰面積的RSD分別為0.93%、1.17%、1.04%、0.88%、0.75%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液（批號：18032500）適量，分別在室溫下放置0、4、8、12、24 h時按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，7-羥基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素、歐前胡素和佛手柑內(nèi)酯等5種成分峰面積的RSD分別為0.77%、1.24%、0.62%、1.43%、1.05%（n=5），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7? 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批舒肝和胃丸（批號：18032500）適量，共6份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。結(jié)果，7-羥基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素、歐前胡素和佛手柑內(nèi)酯等5種成分含量的RSD分別為1.42%、1.31%、1.27%、1.12%、1.05%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的舒肝和胃丸（批號：18032500）1.0 g，共6份，置于圓底燒瓶中，分別精密加入5種待測成分單一對照品貯備液240 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.9 耐用性試驗(yàn)

取同一批舒肝和胃丸（批號：18032500）適量，共3份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別以不同儀器（Agilent 1200型和Shimadzu LC20A型HPLC儀）、色譜柱[Capcell pak C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Venusil MP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]、檢測波長（268、270、272 nm）、柱溫（25、30、40℃）和流速（0.95、1.00、1.05 mL/min）進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。結(jié)果，改變上述色譜條件后，5種成分的色譜峰分離度良好，含量的RSD均不大于1.5%（n=6或n=9），表明本方法的耐用性良好。

2.10 含量測定

取舒肝和胃丸3批，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，每批樣品平行測定2次，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。結(jié)果，3批舒肝和胃丸中，7-羥基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素、歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯的平均含量分別為0.424、0.239、0.305、0.180、0.459 mg/g（n=2），詳見表3。

3 討論

3.1 待測成分的選擇

2015年版《中國藥典》（一部）在佛手藥材的“含量測定”項(xiàng)下，采用橙皮苷作為指標(biāo)成分[1]。但是在舒肝和胃丸中除佛手外，陳皮中也含有大量的橙皮苷，因此橙皮苷不能準(zhǔn)確地反映佛手的質(zhì)量。本文旨在考察舒肝和胃丸中君藥佛手的質(zhì)量，7-羥基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素、歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯等5種成分均是佛手中的香豆素類活性成分，具有抗菌、抗腫瘤、抗凝血、松弛平滑肌等作用[4]。因此，本研究選擇上述5種特征性成分進(jìn)行檢測，以期能更加準(zhǔn)確地評價(jià)舒肝和胃丸中君藥佛手的質(zhì)量。結(jié)果，3批舒肝和胃丸中這5種成分的平均含量分別為0.424、0.239、0.305、0.180、0.459 mg/g（n=2）。

3.2 色譜條件的選擇

首先，本課題組前期以甲醇-水作為流動相進(jìn)行洗脫，結(jié)果待測成分色譜峰嚴(yán)重拖尾、峰形較差，佛手柑內(nèi)酯峰與相鄰色譜峰的分離度很差?？紤]到待測成分具有一定的弱酸性，所以在水相中加入0.1%磷酸以改善色譜峰峰形，效果較好。其次，由于待測成分化學(xué)性質(zhì)差別較大，在色譜柱上具有不同的保留行為，故本研究采用梯度洗脫的方式，并對梯度洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化，以確保全部待測成分均實(shí)現(xiàn)基線分離。最后，考慮到5種待測成分具有不同的紫外吸收特征，本課題組前期采用二極管陣列檢測器，對5種待測成分的紫外吸收波長進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)在270 nm波長處5種成分均具有較強(qiáng)的紫外吸收，故本研究選擇270 nm作為檢測波長。

3.3 提取方式的選擇

本課題組前期分別考察了索氏提取法、超聲提取法、加熱回流提取法提取舒肝和胃丸的效果。結(jié)果，超聲提取法和加熱回流提取法提取效率均略低于索氏提取法，且提取過程需要消耗大量的提取溶劑;索氏提取法采用少量的提取溶劑即可以將待測成分全部轉(zhuǎn)移到提取溶劑中，提取效率較高。因此，本研究采用索氏提取法進(jìn)行樣品提取。舒肝和胃丸由13味中藥組成，所含有的成分非常復(fù)雜，尤其是水溶性糖類成分對分離效果的影響很大，并且還會嚴(yán)重縮短色譜柱的使用壽命。因此，為了減少其他成分對待測成分的干擾，本研究采用D101型大孔吸附樹脂對待測成分進(jìn)行富集[10-14]，盡可能地去除其他成分，尤其是強(qiáng)極性的糖類成分。通過D101型大孔吸附樹脂分離以后，水溶性干擾成分明顯減少。

綜上所述，本研究以君藥佛手為研究對象，成功建立了同時測定舒肝和胃丸中7-羥基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素、歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯等5種成分含量的HPLC法，可為舒肝和胃丸的質(zhì)量控制提供方法支撐。

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（收稿日期：2020-04-09 修回日期：2020-06-03）

（編輯：鄒麗娟）