陳偉盛，高亞奇，梁 寧，陳海宇，陳興致，詹純列，張修彥(中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，廣州 510010)

腺病毒(adenovirus，Ad)作為基因表達(dá)載體的研究始于1960年代[1]，主要研究Ad 載體引入外源基因的可行性和安全性[2-5]。Ad 載體轉(zhuǎn)導(dǎo)基因有很多優(yōu)點(diǎn)[6]：①宿主范圍廣，既可以感染分裂期細(xì)胞，也可以感染非分裂期細(xì)胞[7-8]；②安全性好，Ad 無需整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組，整合突變致癌率低，基因毒性?。虎巯鄬?duì)穩(wěn)定，病毒基因組重排頻率低；④容量大，理論上最大容量可達(dá)35 kb；⑤相對(duì)容易制備，滴度高。Ad載體是目前基因治療最為常用的病毒載體之一。本文旨在研究滴鼻、灌胃、尾靜脈注射及腹腔注射5 型腺病毒(Ad5)后，病毒在C57BL/6J 小鼠體內(nèi)的分布情況，從而為Ad 載體作為基因治療的小鼠研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)C57BL/6J 小鼠112 只，雌雄各半，6～8 周齡，體質(zhì)量16～20 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(粵)2018-0002]，飼養(yǎng)于南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[SYXK(粵)2019-0100]，實(shí)驗(yàn)程序符合南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)要求(20180051812)，并遵守國際慣例。

1.2 主要試劑和儀器

TRIzol(9109)購自日本Ta KaR a 公司；BestarTMqPCR RT kit(2220)、BestarTMqPCR MasterMix(2043)均購自德國DBI 公司；DEPC(6079)購自上海Macklin 公司；Ad 購自深圳市百恩維生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自德國DBI 公司；Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase、2×Phanta Master Mix 均購自諾唯贊生物科技有限公司；DNAzol Reagent 購自美國Invitrogen 公司；Stratagene Real time PCR(Mx3000P)儀購自美國Agilent 公司；PCR 擴(kuò)增儀器(K960)購自杭州晶格科學(xué)儀器有限公司；超微量紫外分析儀(Q6000UV)購自美國Quawell Technology 公司；高速離心機(jī)(TGL-16G)和低速離心機(jī)(TDL-80-2B)均購自上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

使用DNAzol Reagent 提取病毒DNA，取1×109pfu/mL 的Ad5 溶液125 μL，加入含有250 μL DNAzol 的離心管中，上下顛倒混勻，室溫放置5 min，加入100 μL 異丙醇，置于旋渦混合器上充分混勻，室溫放置5 min。6000r/min 離心5 min，棄上清，加入500 μL 75%乙醇溶液后，再6000 r/min 離心5 min，棄上清，加入8 mmol/L NaOH 溶液20 μL 溶解。提取的病毒DNA 的吸光度(A)比值A(chǔ)260/A280為1.86，質(zhì)量濃度為1.33 μg/μL。將DNA 原液5 μL 加45 μL 雙蒸水稀釋10 倍，以此類推稀釋102、103、104、105、106和107倍，最后用稀釋液作為模板進(jìn)行qPCR 檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 動(dòng)物處理及定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)檢測(cè)

112 只小鼠分為滴鼻組、灌胃組、尾靜脈注射組和腹腔注射組，每組28 只，雌雄各半。每只小鼠Ad 用量100 μL(1×109pfu/mL)。于4 種途徑感染后1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d 和7 d分別取4 組中雌雄各2 只小鼠，脫頸椎處死，解剖取淋巴結(jié)、睪丸、附睪、子宮、卵巢、脾臟、腎臟、肝臟、肺、心臟、腦、血液和骨髓組織，提取RNA。以2 μg RNA 為模板，按照Bestar qPCR RT Kit 說明書配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，總體系為10 μL，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA 為模板，配制qPCR 體系。Ad5 上游引物為5'- AGGTGCTTGCCACCTATCAC-3'，下游引物為5'-TTTTGGCACTTCGTTGAGCG-3'。內(nèi)參β-actin 上游引物為5'- CATTGCTGACAGGATGCAGA-3’，下游引物為5'-CTGCTGGAAGGTGGACAGTGA-3'。

在PCR 反應(yīng)管中充分混勻，置入Agilent Stratagene 熒光定量PCR 儀Mx3000P 進(jìn)行熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件為：95 ℃ 2 min，94 ℃20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40 循環(huán)。每個(gè)樣本檢測(cè)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1A和圖1B。從圖1A中可以看出10 倍梯度稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒有良好的特異性擴(kuò)增。圖1B所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.3877x+ 27.204，相關(guān)系數(shù)R2為0.9999，標(biāo)準(zhǔn)品起始反應(yīng)模板濃度與Ct 值呈良好的線性關(guān)系。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線(A)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(B)Figure 1 Amplication curve (A) and standard curve (B) of standard samples

2.2 Ad5 在各組織中的分布

滴鼻組在肺和脊髓中檢測(cè)出Ad5，肺組織中Ad5 含量隨著時(shí)間降低，處理后7 d肺組織中Ad5含量比處理后1 d 下降91.9%，4 d 比3 d 下降29.6%；脊髓組織在處理后1～3 d，Ad5 含量隨時(shí)間增加，之后開始下降，7 d 比1 d 下降26.1%。

尾靜脈注射組在肝臟和脾中檢測(cè)出Ad5，肝臟和脾臟中Ad5 含量隨時(shí)間逐漸下降。7 d 肝臟Ad5 含量比1 d 下降23.4%；脾臟含量7 d 比1 d下降93.9%，其中5 d 比4 d 下降43.8%，下降最快。

腹腔注射組在脊髓、脾臟、附睪和睪丸中檢測(cè)出Ad5，脊髓Ad5 含量在感染后2 d 最高，7 d 比1 d 含量下降39.3%；脾臟和附睪中Ad5 的含量隨時(shí)間逐漸下降，脾臟Ad5 含量7 d 比1 d下降94.2%，附睪含量7 d 比1 d 下降54.3%；睪丸中Ad5 含量有波動(dòng)，可能是因?yàn)锳d5 含量太少，實(shí)驗(yàn)誤差造成，其總體呈下降趨勢(shì)，7 d 比1 d 含量下降64.7%。

灌胃組小鼠各器官和組織中均未檢出Ad5。

圖2 檢測(cè)到Ad5 的小鼠組織Figure 2 Tissues of different groups with detectable adenovirus type 5

3 討論

Ad 廣泛應(yīng)用于腫瘤、心血管等領(lǐng)域的基因傳遞、再生醫(yī)學(xué)以及疫苗載體[9-13]。在許多臨床試驗(yàn)中，Ad 都被證明是安全的載體[14]。研究不同途徑感染后Ad5 在體內(nèi)主要臟器的生物分布，可為基因治療、疫苗載體的小鼠實(shí)驗(yàn)研究中給藥途徑選擇提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，滴鼻組小鼠在肺組織和脊髓中，可以檢測(cè)到Ad。本課題組曾將Cre Ad 滴入B6.129S4-Krastm4Tyj/J 轉(zhuǎn)基因小鼠鼻內(nèi)，誘導(dǎo)其表達(dá)突變Kras基因，從而獲得肺癌模型[15]。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，滴鼻感染后4 d Ad 下降比較多，可將每7 d 滴鼻一次優(yōu)化為每3 d 滴鼻一次。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，灌胃組在所有組織中均沒有檢測(cè)到Ad5，這可能與消化系統(tǒng)對(duì)Ad5 的滅活有關(guān)。

本研究中，尾靜脈注射組在肝臟和脾臟中檢測(cè)到Ad5。王鳴等[16]通過尾靜脈注射Ad 后7d 在肝臟基本檢測(cè)不到Ad，而Ohashi 等[17]給β-葡萄糖醛酸酶缺陷小鼠靜脈注射表達(dá)人β-葡萄糖醛酸酶的重組Ad，肝臟、脾臟中酶的表達(dá)至少持續(xù)到35 d。本研究結(jié)果表明，肝臟中Ad 下降速度較慢，可每7 d 重復(fù)注射一次。苗玉發(fā)等[18]給C57BL/6小鼠肌肉注射治療性HIV 的Ad 載體疫苗，發(fā)現(xiàn)病毒載體在脾臟、骨髓有較少分布，性腺中沒有檢測(cè)到病毒載體。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腹腔注射Ad5 后，附睪和睪丸中有病毒載體，子宮和卵巢中未發(fā)現(xiàn)Ad5，附睪和睪丸中Ad5 含量只有其他陽性組織中檢測(cè)出含量的1%～10%，脊髓中Ad5的含量比滴鼻組約高10 倍。

綜上，肺部感染實(shí)驗(yàn)，可每3d 滴鼻一次；肝臟感染實(shí)驗(yàn)，可以用尾靜脈注射Ad5 的方法；脾臟感染實(shí)驗(yàn)，可以采用尾靜脈注射或腹腔注射Ad5 的方法；脊髓感染實(shí)驗(yàn)，可以采用腹腔注射Ad5 的方法。