面茶中關(guān)鍵香氣成分的鑒定

段 琦 李天嬌 王英杰 劉玉平,3

(北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心；北京工商大學(xué)1，北京 100048) (北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，北京 100048) (北京工商大學(xué)食品學(xué)院；食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室3，北京 100048)

中國(guó)不僅有著悠久的歷史，也有很多特色小吃，面茶就是其中之一，它入口溫?zé)岷痛枷?，具有祛寒暖胃、調(diào)和腸胃、通便潤(rùn)腸等功效，可飲可食，老幼皆宜。面茶的主要原料是面粉，中國(guó)有句俗話(huà)說(shuō)“一樣的面食，十樣的造作”。不同地區(qū)的面茶在制作方法與所有原料也有所不同，如天津的面茶是以糜子面、水、鹽等為原料，按照一定配比經(jīng)過(guò)熬制得到的糊狀物[1]；福建一帶的面茶是以面粉為主要材料，添加香菇、蔥頭、糖粉等輔料炒制而成，食用前需要加入熱水[2]；而北京的面茶是小米面熬成的面茶糊，再添加芝麻醬汁、椒鹽和芝麻[3]。如今對(duì)面茶的研究主要集中在對(duì)其原料的選用上，如采用膨化玉米粉、膨化高粱粉[4,5]、豆渣來(lái)制作面茶[2]；而關(guān)于面茶香氣的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

由于多數(shù)食品中香氣成分含量較低，一般不適合采用水蒸氣蒸餾的方法來(lái)提取其中的揮發(fā)性香氣成分，可以采用固相微萃取[6,7]、同時(shí)蒸餾萃取[8,9]、溶劑萃取結(jié)合溶劑輔助蒸發(fā)[10,11]等方法來(lái)提?。挥捎诿娌铻橹酄顦悠?，關(guān)于這類(lèi)基質(zhì)的香氣研究較少，有文獻(xiàn)報(bào)道采用頂空固相微萃技術(shù)(HS-SPME)對(duì)小米粥中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行提取，并利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry- olfactometry)技術(shù)對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分離與鑒定，但并未對(duì)主體香成分進(jìn)行研究[12]。為了擴(kuò)展研究手段，對(duì)粥類(lèi)樣品更全面的分析，本研究采用液液連續(xù)萃取結(jié)合溶劑輔助蒸發(fā)的方法提取了面茶中的揮發(fā)性成分，通過(guò)采用氣相色譜-質(zhì)譜-嗅聞儀(gas chromatography-mass spectrometry- olfactometry，GC-MS-O)聯(lián)用的方法對(duì)提取物進(jìn)行分析，鑒定出其中的香氣活性物質(zhì)，對(duì)香氣活性物質(zhì)進(jìn)行定量，利用定量結(jié)果和它們的閾值，計(jì)算出它們的香氣活性值(Odor Activity Value, OAV)，進(jìn)而確定出面茶中的關(guān)鍵香氣成分，期待能夠?yàn)楦纳泼娌璧娘L(fēng)味，提高面茶的品質(zhì)，為實(shí)現(xiàn)面茶的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)和其他中國(guó)傳統(tǒng)食品實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鑒于市面上面茶多以手工生產(chǎn)，并未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，品質(zhì)難以保證一致，所以實(shí)驗(yàn)所用面茶均購(gòu)于同一地點(diǎn)，來(lái)保證樣品配料、選材、制作一致。面茶所用原料為糜子面、芝麻醬和椒鹽。所用試劑及規(guī)格：香蘭素(98%)、(E,E)-2,4-壬二烯醛(99%)、(E,E)-2,4-癸二烯醛(98%)、庚醛(99%)、反-2-辛烯醛(99%)、糠醛(99%)、3-甲基-1,2-環(huán)戊二酮(98%)、2,6-二甲基吡嗪(98%)、2,5-二甲基吡嗪(99%)、2,3,5-三甲基吡嗪(98%)、2,3-二甲基吡嗪(99%)、2-甲基吡嗪(98%)、2-乙基呋喃(98%)、3-甲硫基丙醛(95%)、2-乙基吡嗪(99%)、2-乙?；量?98%)、2-辛醇(99%)、6-十一酮(99%)、麥芽酚(99%)、5-甲基糠醛(99%)、糠硫醇(99%)、苯甲醛(>98%)、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪(99%)、2-乙基-5(6)-甲基吡嗪(>98%)、糠醇(99%)、2-乙基呋喃(99%)、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚(99%)、2(5H)-呋喃酮(99%)、2,3-丁二酮(98%)、C7～C28正構(gòu)烷烴(色譜純)、無(wú)水硫酸鈉(分析純)、二氯甲烷(分析純)，二氯甲烷在使用前需要進(jìn)行重新蒸餾。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B型氣相色譜儀(GC)-5977A型質(zhì)譜聯(lián)用儀(MS)，sniffer3000型嗅覺(jué)檢測(cè)器(O)，高真空泵組，液液連續(xù)萃取玻璃儀器和蝶形玻璃儀器，BF-2000氮?dú)獯蹈蓛x，DF-101S型加熱磁力攪拌器。

1.3 方法

1.3.1 液液連續(xù)萃取結(jié)合溶劑輔助蒸發(fā)的方法提取面茶中的揮發(fā)性成分

將面茶搖勻，取500 g面茶和200 mL二氯甲烷加入到液液連續(xù)萃取器中，把連續(xù)萃取腔置于恒溫水浴鍋中，于47 ℃下連續(xù)萃取5 h，萃取結(jié)束后，將混合物放入分液漏斗中進(jìn)行分液，得到萃取液和面茶殘?jiān)铩?/p>

使用溶劑輔助風(fēng)味成分蒸發(fā)設(shè)備將萃取液中的揮發(fā)性成分分離出來(lái)；采用40 ℃的水浴對(duì)萃取物進(jìn)行加熱，為了收集揮發(fā)性成分采用液氮進(jìn)行冷卻，使用的壓力應(yīng)低于2.5×10-3Pa。將收集到的餾分從液氮中取出來(lái)，恢復(fù)到室溫，用10 g無(wú)水硫酸鈉進(jìn)行干燥過(guò)夜。對(duì)干燥后的餾分進(jìn)行過(guò)濾，得到濾液，用韋氏柱將餾分濃縮至3 mL左右，最后再用氮吹濃縮至1 mL，得到面茶中的揮發(fā)性成分提取物，用于感官評(píng)價(jià)和GC-MS-O分析。

1.3.2 GC-MS-O分析條件

GC條件：采用DB-WAX(30.0 m×250 μm×0.25 μm)和HP-5(30.0 m×250 μm×0.25 μm)兩種極性不同的毛細(xì)管色譜柱，色譜柱起始溫度為36 ℃，在該溫度下保持2 min；之后以10 ℃/min的速率升至230 ℃，保持30 min；載氣是氦氣，流量為1.66 mL/min；進(jìn)樣口溫度和傳輸線(xiàn)的溫度都是250 ℃。

MS條件：電子轟擊離子源，能量為70 eV，離子源的溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，掃描模式為Scan，掃描范圍的質(zhì)核比為33～400。

O的條件：揮發(fā)性成分經(jīng)GC分離后，流出物在色譜柱的末端用經(jīng)過(guò)脫活處理的沒(méi)有填充物的毛細(xì)管以1∶2的比例分別進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)器和嗅覺(jué)檢測(cè)器，嗅聞口溫度設(shè)定為220 ℃，采用不分流模式進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL。嗅聞實(shí)驗(yàn)由5位評(píng)價(jià)人員進(jìn)行，評(píng)價(jià)人員在嗅聞口嗅聞流出的揮發(fā)性成分的香氣，同時(shí)記錄其香氣特征和保留時(shí)間。

1.3.3 定性定量方法

定性分析：通過(guò)香氣特征、質(zhì)譜和保留指數(shù)[13]，對(duì)嗅聞到的香氣成分進(jìn)行初步定性，然后再在相同的GC-MS-O的條件下分析初步定性出的成分的標(biāo)準(zhǔn)品，如果香氣特征、質(zhì)譜和保留指數(shù)與嗅聞到的成分的一致，則鑒定出的成分屬于肯定鑒別(positive identification)。如果標(biāo)準(zhǔn)品不易市購(gòu)，則根據(jù)香氣特征、保留指數(shù)、質(zhì)譜對(duì)嗅聞到的香氣成分進(jìn)行嘗試性定性(tentative identification)。

定量分析：以2-辛醇和6-十一酮為內(nèi)標(biāo)，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。被定量成分在樣品中的濃度(C)可按照下式計(jì)算：

C=fS1m2/m1S2

(1)

式中：f表示被定量成分對(duì)內(nèi)標(biāo)2-辛醇和6-十一酮的相對(duì)校正因子(f=1)[14]，S1表示被定量成分的峰面積，m2表示的是樣品中添加的內(nèi)標(biāo)2-辛醇或6-十一酮的質(zhì)量，m1表示面茶的質(zhì)量，S2表示內(nèi)標(biāo)2-辛醇或6-十一酮的峰面積。

1.3.4 香氣活性值(OAV)的計(jì)算方法

OAV等于香氣活性成分在面茶中的濃度與其自身閾值的比值；OAV≥1的香氣活性成分對(duì)面茶的香氣輪廓貢獻(xiàn)大，被確定為面茶的關(guān)鍵香氣成分。

1.3.5 香氣重組實(shí)驗(yàn)

將糜子面和水按照質(zhì)量比為5∶2進(jìn)行混合，然后小火熬制成糊狀，經(jīng)過(guò)嗅聞其氣息，嗅聞不到香氣；將OAV≥1的香氣活性成分用丙二醇稀釋成10 mg/mL的溶液，按照定量結(jié)果確定出的含量添加到熬制的面糊中，得到重組樣品。

1.3.6 香氣輪廓描述分析

通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)確定出面茶由6種香韻組成，烤香(代表物為2-乙基-3,5-二甲基吡嗪)、奶甜香(代表物為香蘭素)、壤香(代表物為2,3,5-三甲基吡嗪)、油脂香(代表物為E,E-2,4-癸二烯醛)、芝麻香(使用芝麻油)、堅(jiān)果香(熟杏仁)，在感官評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)以前評(píng)價(jià)人員嗅聞這些參照物。為了對(duì)比面茶和重組樣品的香氣差別，6位經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的評(píng)價(jià)人員參與嗅聞面茶和重組樣品的香氣，對(duì)6個(gè)香韻進(jìn)行打分；分值范圍為0～6分，0～2分代表微弱，3～4分代表適中，5～6分代表強(qiáng)烈，最后取6位評(píng)價(jià)人員的得分的平均值，畫(huà)出雷達(dá)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 面茶中鑒定出的香氣活性物質(zhì)

采用液液連續(xù)萃取結(jié)合溶劑輔助蒸發(fā)的方法將面茶中的揮發(fā)性成分提取出來(lái)，嗅聞提取物，其香氣與面茶的香氣接近，說(shuō)明面茶中的重要香氣成分已經(jīng)被提取出來(lái)。使用GC-MS-O對(duì)面茶提取物進(jìn)行分析，從面茶的提取物中共定性出31種香氣活性成分，所得結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 面茶中鑒定出的香氣活性物質(zhì)

續(xù)表1

從所得結(jié)果可知鑒定出的31種香氣活性成分中包括醛類(lèi)化合物10種、吡嗪類(lèi)化合物9種、酮類(lèi)化合物5種、含硫化合物2種、醇類(lèi)化合物2種、酚類(lèi)化合物1種、其他化合物2種；檢測(cè)頻次為5的有12種，檢測(cè)頻次為4的有8種，檢測(cè)頻次為3的有9種，檢測(cè)頻次為2的有2種。

鑒定出的10種醛類(lèi)化合物分別是庚醛、反-2-辛烯醛、3-甲硫基丙醛、糠醛、苯甲醛、5-甲基糠醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、2-苯基-2-丁烯醛、香蘭素。這些醛類(lèi)化合物主要來(lái)源于面茶所用原料糜子面和芝麻醬，并且這些成分多數(shù)都曾經(jīng)在芝麻醬中被鑒定出來(lái)[15,16]，它們主要通過(guò)4種途徑形成，一是由不飽和脂肪酸的氧化產(chǎn)生，糜子面和芝麻中都含有不飽和脂肪酸(尤其是芝麻中含有更多的不飽和脂肪酸，如油酸、亞油酸、亞麻酸等[17])，反-2-辛烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛等可由亞油酸自動(dòng)氧化產(chǎn)生[18]；二是通過(guò)Strecker降解反應(yīng)產(chǎn)生，糜子面和芝麻醬中都含有氨基酸[19,20]，氨基酸發(fā)生Strecker降解產(chǎn)生相應(yīng)的醛，如蛋氨酸降解后得到3-甲硫基丙醛；三是通過(guò)酚酸類(lèi)物質(zhì)降解產(chǎn)生，糜子中含有阿魏酸、香草酸、綠原酸、丁香酸等酚酸類(lèi)物質(zhì)[21]，其中阿魏酸可降解產(chǎn)生香蘭素[22]；四是通過(guò)糖降解產(chǎn)生，糜子面中含有淀粉，與水混合加熱過(guò)程中會(huì)發(fā)生水解產(chǎn)生糖類(lèi)成分，其中六碳糖可以降解產(chǎn)生糠醛[23]。

鑒定出的9種吡嗪類(lèi)化合物分別是2-甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2-乙基-5(6)-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪。它們應(yīng)該主要來(lái)自所使用的芝麻醬，作為揮發(fā)性成分這些化合物都在芝麻醬中被鑒定出來(lái)[15,16]，主要是通過(guò)美拉德反應(yīng)產(chǎn)生。這些化合物的形成與α-氨基酸、糖和α-二羰基化合物有關(guān)，溫度升高有利于這類(lèi)化合物的形成[24]；生的芝麻沒(méi)有香氣，在制作芝麻醬的過(guò)程中，首先需要將生芝麻烤熟，在烤制過(guò)程中形成了很多重要的香氣化合物。

除了鑒定出的醛類(lèi)和吡嗪類(lèi)化合物外，還有5種酮類(lèi)化合物，分別是2,3-丁二酮、香芹酮、2(5H)-呋喃酮、麥芽酚和3-甲基-1,2-環(huán)戊二酮，其中2,3-丁二酮可以由蔗糖降解產(chǎn)生[25]；香芹酮可能主要來(lái)自使用的原料椒鹽，因?yàn)樗腔ń返南銡獬煞种籟26]；2(5H)-呋喃酮和麥芽酚都是美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物[27,28]。鑒定出的乙硫醇和糠硫醇2種含硫化合物與含硫氨基酸參與的美拉德反應(yīng)有關(guān)，也是來(lái)源于面茶中使用的芝麻醬，其中糠硫醇可由戊糖與半胱氨酸反應(yīng)生成，并且隨著反應(yīng)溫度的升高糠硫醇的含量會(huì)升高[29]，它也是咖啡的重要香氣成分。鑒定出的2種醇類(lèi)化合物是庚醇和糠醇，其中糠醇也是咖啡的重要香氣成分，應(yīng)該也是來(lái)自芝麻醬，它是在烤芝麻過(guò)程中形成的，與其在咖啡中的形成機(jī)理相同[30]。鑒定出來(lái)的酚類(lèi)化合物只有4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，它應(yīng)該由芝麻和糜子面中的p-香豆酸和阿魏酸降解產(chǎn)生[21,31]。

2.2 面茶中鑒定出的香氣活性成分的定量結(jié)果及它們的香氣活性值

采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)面茶中鑒定出來(lái)的香氣活性成分進(jìn)行了定量分析，使用2-辛醇和6-十一酮為標(biāo)定物質(zhì)，根據(jù)定量結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道的閾值，計(jì)算了它們的OAV，所得結(jié)果見(jiàn)表2。

從表中所得定量結(jié)果可知，只對(duì)22種香氣活性成分進(jìn)行了定量，總含量為40.08 μg/g；有9種香氣活性成分沒(méi)有定量，分別是3-甲硫基丙醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、2-苯基-2-丁烯醛、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、2,3-丁二酮、香芹酮、糠硫醇、庚醇、2-乙基呋喃，因?yàn)檫@些成分在面茶中的含量較低，對(duì)面茶提取物進(jìn)行GC-MS分析時(shí)沒(méi)有得到這些成分明顯的色譜峰。醛類(lèi)香氣活性成分的總含量為14.66 μg/g，其中糠醛的含量(7.49 μg/g)最高，超過(guò)了50%。吡嗪類(lèi)香氣活性成分的總含量為5.87 μg/g，其中2-甲基吡嗪的含量(1.94 μg/g)最高，達(dá)到吡嗪類(lèi)成分總含量的33%。三種酮類(lèi)香氣活性成分的總含量為2.30 μg/g，其中3-甲基-1,2-環(huán)戊二酮、麥芽酚和2(5H)-呋喃酮三者的含量接近。醇類(lèi)香氣活性成分中只定量了糠醇，其含量達(dá)到了11.44 μg/g，在定量的22種成分中含量最高，占了22種香氣活性成分總含量的28%以上；有文獻(xiàn)報(bào)道糠醇在食品中的含量與食品的烘烤溫度有關(guān)系，在一定的溫度范圍內(nèi)，隨著烘烤溫度的升高，其含量也增加[29]。另外兩種含量較高的成分是4-乙烯基愈創(chuàng)木酚和2-乙?；量鼈兊暮糠謩e是2.88 μg/g和2.76 μg/g。

表2 面茶中鑒定出的香氣活性成分的濃度和香氣活性值

由于2(5H)-呋喃酮的閾值鮮見(jiàn)報(bào)道，只計(jì)算了21種香氣活性成分的OAV。從OAV的計(jì)算結(jié)果可知，有18種香氣活性成分的OAV大于1，它們是面茶的關(guān)鍵香氣成分；其中OAV>1 000有1種，是2-乙基-3,5-二甲基吡嗪，它們賦予了面茶烤香；1 000>OAV>100的有3種，分別是(E,E)-2,4-癸二烯醛、糠醇和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，它們賦予了面茶油脂香、甜香、煙熏香；100>OAV>10的有7種，分別是庚醛、糠醛、反-2-辛烯醛、香蘭素、2-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪和乙硫醇，它們賦予了面茶果香、奶甜香、烤香、壤香；10>OAV≥1的有7種，分別是苯甲醛、5-甲基糠醛、2,5-二甲基吡嗪、2-乙基-5(6)-甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、3-甲基-1,2-環(huán)戊二酮和麥芽酚，它們賦予了面茶堅(jiān)果香、烤香、焦甜香。

2.3 香氣重組實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證確定出的關(guān)鍵香氣成分確實(shí)對(duì)面茶的香氣貢獻(xiàn)大，將OAV大于1的香氣活性成分按照定量結(jié)果的數(shù)據(jù)添加到用糜子面熬成的面糊中，得到重組樣品。感官評(píng)價(jià)人員對(duì)面茶與面茶重組樣品的各個(gè)香韻進(jìn)行打分，所得結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 面茶和重組樣品的香氣描述輪廓圖對(duì)比圖

重組樣與面茶的奶甜香和壤香香氣強(qiáng)度相同；而在烤香、芝麻香、堅(jiān)果香三個(gè)香韻上，面茶的香氣強(qiáng)度均大于重組樣的香氣強(qiáng)度，重組樣的油脂香氣強(qiáng)度大于面茶的油脂香氣強(qiáng)度。糠硫醇具有典型的芝麻香氣，它的香氣閾值較低(0.008 4 ng/L[33])，在面茶中能夠嗅聞到它的香氣，但是因?yàn)樗暮康陀谫|(zhì)譜檢測(cè)限，沒(méi)有對(duì)其進(jìn)行定量，在重組樣品中沒(méi)有添加，所以重組樣的芝麻香氣強(qiáng)度低于面茶的芝麻香氣強(qiáng)度。

在GC—O分析過(guò)程中經(jīng)常會(huì)遇到有的成分閾值低，能嗅聞到它的香氣，但是由于它們的濃度低，質(zhì)譜檢測(cè)器和氫火焰離子化檢測(cè)器對(duì)它們沒(méi)有響應(yīng)，也就不能給出明顯的色譜峰，無(wú)法對(duì)它們進(jìn)行定量，它們對(duì)樣品的香氣貢獻(xiàn)也常被忽視；通過(guò)本研究說(shuō)明這些閾值低、含量低的成分不應(yīng)該被忽視，應(yīng)該進(jìn)一步研究它們的定量方法。

3 結(jié)論

采用液液連續(xù)萃取結(jié)合溶劑輔助風(fēng)味成分蒸發(fā)的方法提取了面茶中的揮發(fā)性成分，提取物經(jīng)過(guò)GC-MS-O分析，從中共鑒定出31種香氣活性物質(zhì)，并且測(cè)定了它們的檢測(cè)頻次，其中醛類(lèi)化合物10種、吡嗪類(lèi)化合物9種、酮類(lèi)化合物5種、含硫化合物2種、醇類(lèi)化合物2種、酚類(lèi)化合物1種、其他化合物2種。

通過(guò)對(duì)鑒定出的22種香氣活性物質(zhì)進(jìn)行定量分析和計(jì)算它們的香氣活性值，19種香氣活性成分的OAV≥1，分別是2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、(E,E)-2,4-癸二烯醛、反-2-辛烯醛、香蘭素、糠醇、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、庚醛、糠醛、2,3,5-三甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、乙硫醇、5-甲基糠醛、苯甲醛、2-乙基-5(6)-甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、3-甲基-1,2-環(huán)戊二酮和麥芽酚，它們是面茶的關(guān)鍵香氣物質(zhì)。

通過(guò)香氣重組實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了面茶中的關(guān)鍵香氣物質(zhì)，同時(shí)也表明那些閾值低、含量低的成分應(yīng)該引起關(guān)注。