平俐 盛小紅 辛向陽(yáng)

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是兒童最常見(jiàn)的眼內(nèi)惡性腫瘤，約占所有兒童惡性腫瘤的3%[1]。目前大部分視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患兒的預(yù)后較差，主要與就診不及時(shí)，且該病缺乏有效的治療手段有關(guān)[2，3]。此外，目前對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的預(yù)后預(yù)測(cè)尚不夠準(zhǔn)確，特別是對(duì)于微轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估[4]。因此，對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的分子標(biāo)記物進(jìn)行研究，鑒定出能預(yù)測(cè)其預(yù)后的分子標(biāo)記物，并作為潛在的靶標(biāo)進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)，有深遠(yuǎn)的意義。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的、具有高度異質(zhì)性的一類(lèi)非編碼RNA[5]。越來(lái)越多證據(jù)支持lncRNA參與了廣泛的腫瘤生物學(xué)行為，包括細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲[6]。目前多種lncRNA被鑒定出在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著抑癌基因或癌基因的角色[7，8]。本研究擬首先對(duì)就診本科室的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患兒中的lncRNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出新型lncRNA HOXA-AS2，進(jìn)一步擴(kuò)大樣本以驗(yàn)證其預(yù)后價(jià)值。

資料與方法

一、一般資料

隨機(jī)選取2018年5月就診我科的3例(3只眼)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患兒的癌組織及同期就診的的3例(3只眼)正常視網(wǎng)膜樣本，對(duì)兩組間的組織樣本進(jìn)行l(wèi)ncRNA表達(dá)譜分析，篩選差異表達(dá)lncRNA。然后挑選出HOXA-AS2，回顧性選取標(biāo)本庫(kù)中2012年1月至2017年12月就診我科的60例視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行PCR驗(yàn)證，根據(jù)HOXA-AS2表達(dá)水平進(jìn)行分組，評(píng)估HOXA-AS2對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的診斷效能及其表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系。最后預(yù)測(cè)HOXA-AS2的靶基因，并對(duì)靶基因進(jìn)行生物功能基因本體(gene ontology,GO)富集。

二、患者納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)后病理確診視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；(2)術(shù)后生存隨訪數(shù)據(jù)和組織標(biāo)本庫(kù)質(zhì)量合格。

2.排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并多原發(fā)癌或其他惡性腫瘤史；(2)拒絕參與研究者。

本研究已取得我院倫理學(xué)委員會(huì)審核并通過(guò)，所有納入者自愿參與，已簽訂知情同意書(shū)。

三、試劑和設(shè)備

NanoDrop2000分光光度計(jì)(美國(guó)Applied Biosystems公司)，StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Thermofisher)，Trizol試劑(碧云天公司)，PrimeScript RT reagent Kit(Takara)，SYBR Premix ExTaq II Kit(Takara)。

四、RT-PCR

對(duì)患者術(shù)后進(jìn)行標(biāo)本取材，于30 min內(nèi)-80 ℃保存。按照RNA提取Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，并定量測(cè)定RNA濃度和純度。當(dāng)吸光度A260 nm/A280 nm為1.9～2.1時(shí)，說(shuō)明純度達(dá)標(biāo)，選擇用于進(jìn)行進(jìn)一步分析。對(duì)HOXA-AS2進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，根據(jù)PrimeScript RT reagent Kit和SYBR Premix ExTaq II Kit說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄提取RNA后進(jìn)行qPCR，以GAPDH作為內(nèi)參。

五、生物信息學(xué)分析

運(yùn)用Multi Experiment Matrix(MEM)在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行HOXA-AS2的靶基因預(yù)測(cè)，該網(wǎng)站基于多數(shù)據(jù)集的共表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，選擇前200名靶基因，運(yùn)用STRING網(wǎng)站進(jìn)行GO分析[9]。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行比較。總生存率分析采用Kaplan Meier法，并運(yùn)用用Log Rank法比較，預(yù)后相關(guān)多因素分析采用Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的差異lncRNA及HOXA-AS2表達(dá)

對(duì)3例視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤和3例健康對(duì)照組的視網(wǎng)膜組織的lncRNA表達(dá)譜進(jìn)行比較分析，共篩選出141個(gè)差異lncRNA，其中上調(diào)lncRNA共110個(gè)，下調(diào)lncRNA共31個(gè)(表1，為前5名差異基因)。選擇差異倍數(shù)最大的HOXA-AS2(logFC 4.54，P=3.94E-07)作為后續(xù)研究的進(jìn)一步驗(yàn)證。

表1 3例視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤和3例對(duì)照組的視網(wǎng)膜組織的差異lncRNA(前5名)

二、HOXA-AS2對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的預(yù)測(cè)價(jià)值

進(jìn)一步搜集于2012年1月至2017年12月就診我科的60例視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，年齡(2.5±1.8)歲(0.6～6歲)，以HOXA-AS2表達(dá)中位值為截點(diǎn)進(jìn)行分組，結(jié)果提示： 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤HOXA-AS2高表達(dá)組的3年OS明顯低于HOXA-AS2低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(51.2%比96.0%，P=0.006，圖1)。

三、HOXA-AS2低表達(dá)組和HOXA-AS2高表達(dá)組臨床病理資料比較

對(duì)HOXA-AS2高表達(dá)組和HOXA-AS2低表達(dá)組的臨床病理資料進(jìn)行比較，結(jié)果提示，兩組間不同性別、組織分型、腫瘤分期和視神經(jīng)侵犯相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。HOXA-AS2高表達(dá)組的脈絡(luò)膜浸潤(rùn)率高于HOXA-AS2低表達(dá)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(35.5%比10.3%，P=0.021)。

四、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患兒的總生存期預(yù)后多因素分析

進(jìn)一步對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患兒的總生存期(overal survival,OS)相關(guān)因素進(jìn)行Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸多因素分析，結(jié)果提示：只有HOXA-AS2表達(dá)水平入選回歸方程(OR=2.632，95%CI：1.228-5.641，P=0.013)，是視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患者預(yù)后總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表2 HOXA-AS2低表達(dá)組和HOXA-AS2高表達(dá)組臨床病理資料比較

表3 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后進(jìn)行Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸多因素分析

五、HOXA-AS2的靶基因

運(yùn)用Multi Experiment Matrix(MEM)在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行HOXA-AS2的靶基因預(yù)測(cè)，采用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)HOXA-AS2的靶基因數(shù)據(jù)集進(jìn)行GO分析，結(jié)果提示，HOXA-AS2的靶基因主要富集于“早期胚胎發(fā)生后腦發(fā)育中前Hox基因的激活”的生物學(xué)過(guò)程中(FDR=5.60E-06)(圖2)。

討 論

隨著二代基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展與成熟，研究者發(fā)現(xiàn)很多疾病的發(fā)生與發(fā)展和lncRNA的異常表達(dá)有關(guān)，臨床中l(wèi)ncRNA常被應(yīng)用于診斷和預(yù)測(cè)，但其參與的相關(guān)機(jī)制尚不明了。目前關(guān)于視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的lncRNA表達(dá)譜研究較少[10]，本研究首先通過(guò)對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患兒和健康對(duì)照組的lncRNA表達(dá)譜進(jìn)行比較，篩選出141個(gè)差異lncRNA，其中上調(diào)lncRNA共110個(gè)，下調(diào)lncRNA共31個(gè)，有助于為今后視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的lncRNA研究提供參考。

我們進(jìn)一步選擇差異倍數(shù)最大的HOXA-AS2(logFC 4.54，P=3.94E-07)進(jìn)一步驗(yàn)證。lncRNA HOXA-AS2是一個(gè)長(zhǎng)度為1048bp的長(zhǎng)鏈反義lncRNA。由于其轉(zhuǎn)錄本位于HOXA3和HOXA4之間的HOXA集落中，HOXA-AS2被認(rèn)為廣泛參與了多種癌腫的病理生理過(guò)程，并在多種癌腫中表達(dá)上調(diào)，如肝癌[11]、胃癌[12]和結(jié)直腸癌[13]等。此外，HOXA-AS2在這些癌腫中均具有預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值，但其在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的預(yù)后價(jià)值目前尚無(wú)研究探討。我們進(jìn)一步搜集既往就診我科的60例視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)HOXA-AS2高表達(dá)組的3年OS低于HOXA-AS2低表達(dá)組,(51.2%比96.0%，P=0.006),進(jìn)一步對(duì)臨床資料進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)性別、組織分型、腫瘤分期和視神經(jīng)侵犯與HOXA-AS2表達(dá)無(wú)關(guān)。HOXA-AS2高表達(dá)組的脈絡(luò)膜浸潤(rùn)率高于HOXA-AS2低表達(dá)組(35.5%比10.3%，P=0.021)，提示HOXA-AS2高表達(dá)的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤生物學(xué)行為較差，侵襲性較強(qiáng)，HOXA-AS2在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的進(jìn)展過(guò)程中扮演癌基因的角色。Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)體外敲除HOXA-AS2，可通過(guò)導(dǎo)致G1期阻滯，促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的凋亡，從而降低其增殖水平。在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤方面，HOXA-AS2的促癌機(jī)制尚無(wú)研究，本研究對(duì)HOXA-AS2的靶基因數(shù)據(jù)集進(jìn)行GO分析，結(jié)果提示，HOXA-AS2的靶基因主要富集于“早期胚胎發(fā)生后腦發(fā)育中前Hox基因的激活”的生物學(xué)過(guò)程中(FDR=5.60E-06) 提示其可能通過(guò)調(diào)節(jié)HOX家族表達(dá)參與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展。HOXA-AS家族另一個(gè)成員HOXA11-AS通過(guò)吸附miR-506-3p，使其靶基因NEK6上調(diào)，從而促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤增殖[15]。HOXA-AS2在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤方面的促癌機(jī)制及其靶標(biāo)設(shè)計(jì)值得進(jìn)一步研究。

目前HOXA-AS2在乳腺癌[16]和胰腺癌[17]方面的預(yù)后價(jià)值已經(jīng)得到證實(shí)。為了進(jìn)一步探討HOXA-AS2是否具有視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值，我們對(duì)可能影響視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患兒的OS的相關(guān)因素進(jìn)行Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸多因素分析，發(fā)現(xiàn)只有HOXA-AS2表達(dá)水平入選回歸方程，較高的HOXA-AS2表達(dá)水平(OR=2.632，95%CI：1.228-5.641，P=0.013)是視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患者預(yù)后(OS)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。提示HOXA-AS2有望成為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的預(yù)后標(biāo)記物。

本研究篩出了HOXA-AS2是視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤潛在的生物標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤HOXA-AS2高表達(dá)組的3年OS明顯低于HOXA-AS2低表達(dá)組，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織HOXA-AS2高表達(dá)可作為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤不良預(yù)后的獨(dú)立因素，并且HOXA-AS2的靶基因主要富集于“早期胚胎發(fā)生后腦發(fā)育中前Hox基因的激活”的生物學(xué)過(guò)程中，因此HOXA-AS2有望成為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的預(yù)后標(biāo)記物。