浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 杭州 310053

絲瓜［Luffa cylindrica （L.） Roem.］中含有甾醇三萜及皂甙類、黃酮體和酚類、蛋白質(zhì)和氨基酸類等藥用成分，具有特殊的藥用價值。1988年，Kamenosono等[1]從絲瓜種子中分離出分子量很接近的兩種絲瓜蛋白Luffin-α和Luffin-β。研究發(fā)現(xiàn)，包括Luffin-α、Luffin-β以及Luffin-P1在內(nèi)的多種蛋白均屬于Ⅰ型核糖體失活蛋白（ribosome inactivating proteins，RIPs）[2]。RIPs是通過與核糖體rRNA分子相互作用，從而阻斷蛋白質(zhì)合成的高效毒素[3]，通常來源于植物、細菌和真菌，被認為是抗真菌和抗病毒劑，并且具有抗腫瘤、免疫抑制和抗生育活性[4-6]，因此是一種具有發(fā)展?jié)摿Φ目鼓[瘤藥物，特別是在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究廣泛的Ⅰ型RIPs，可應(yīng)用于腫瘤的免疫治療[7]。但使用天然毒素治療癌癥存在許多固有的問題，如植物資源有限、分離純化過程復(fù)雜等[5]，因此通過基因工程技術(shù)獲取該重組蛋白具有明顯的優(yōu)勢。

在本研究中，通過提取絲瓜籽總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以cDNA為模板，運用反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription polymerase chain reaction，RTPCR）技術(shù)克隆Luffin-α基因，并將該基因在大腸桿菌系統(tǒng)中進行可溶性表達，同時檢測其對HepG2和MDA-MB-231細胞的抑瘤活性，以期為后續(xù)抗腫瘤藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 綠皮絲瓜選購自濱江農(nóng)貿(mào)市場。質(zhì)粒pGEX6P-1、大腸桿菌BL21（DE3）、TG1均由本實驗室保存；人肝癌細胞HepG2、人乳腺癌細胞MDA-MB-231均購于中科院上海細胞庫。

1.1.2 試劑 Trizol試劑購自源葉生物公司（批號：L25M8G32443）；T4 DNA連接酶、Taq酶和cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒均為TAKARA公司產(chǎn)品（批號：AG50076A、AJ51060A、AHE4572A）；質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒購自Axygen公司（批號：06114KA1、01316KE1）；谷胱甘肽瓊脂糖、氨芐青霉素（ampicillin，Amp）、噻唑藍（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、 十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）和蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒購于生工生物工程（上海）有限公司（批號：F402DA0003、E702BA0004、F410BA0019、DB16BA 0006、E115BA0019、F129DA0001）；胰蛋白酶、雙抗購自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司（批號：1911150405、1911110107）;二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自SIGMA公司（批號：BCBW5664）；DMEM培養(yǎng)液購自HyClone公司（批號：AE29422278）；谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）單克隆抗體（小鼠單抗）、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠lgG（H+L）、蛋白Marker購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號：09251911219、080819191204、112618190604）。

1.1.3 儀器 scientz-950E超聲波裂體儀購于上海虔鈞科學(xué)儀器有限公司；蛋白質(zhì)電泳與轉(zhuǎn)膜儀為美國Bio-rad公司產(chǎn)品；Tanon 2500凝膠成像儀購于上海天能科技有限公司；Tpersonal型PCR儀購于Biometra公司；3K-18臺式高速冷凍離心機為Sigma公司產(chǎn)品；DSHZ-300A恒溫搖床購于江蘇太倉實驗設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 絲瓜籽RNA的提取 在預(yù)冷的研缽中，加入新鮮絲瓜籽0.2g，添加液氮后將其研磨成粉末，再加入Trizol試劑1mL，采用Trizol一步法提取絲瓜籽總RNA，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，核酸微量分光光度計測A260/A280比值，-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RT-PCR擴增絲瓜籽Luffin-α基因 反轉(zhuǎn)錄的操作步驟根據(jù)TAKARA公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行。根據(jù)GeneBank中的Luffin-α的cDNA序列，設(shè)計合成引物L(fēng)uffin-F1和Luffin-R1，擴增絲瓜Luffin-α基因，引物設(shè)計和測序均由上海鉑尚生物有限公司完成，引物序列見表1。 反應(yīng)體系如下：cDNA 2μL，10×PCR Buffer 5μL，dNTP （2.5mol·L-1）2μL，Taq酶 （1U·μL-1）0.5μL，正反向引物各1μL，ddH2O 38.5μL，總計50μL。反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性3min，98℃ 20s，61℃ 45s，68℃ 45s，2個循環(huán)；98℃ 20s，59℃ 45s，68℃ 45s，3個循環(huán)；98℃ 20s，57℃ 45s，68℃ 45s，共28個循環(huán)。 結(jié)束后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，然后按照Axygen公司的膠回收試劑盒內(nèi)附說明書進行切膠回收。PCR產(chǎn)物與pTA2載體進行T-A克隆，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TG1感受態(tài)細胞中，均勻涂布在含Amp的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12h。隨機挑取6到8個菌落，菌落經(jīng)PCR初步鑒定后，再寄送至上海鉑尚生物有限公司測序。測序結(jié)果通過NCBI上的Blast軟件進行比對。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.3 pGEX6P-1/Luffin-α重組載體構(gòu)建 以經(jīng)測序驗證的pTA2-Luffin-α質(zhì)粒為模板，采用Luffin-F2/R2引物重新擴增Luffin-α基因，切膠回收擴增產(chǎn)物。然后用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI雙酶切Luffin-α基因，再利用T4 DNA連接酶連接至pGEX6P-1載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中，涂布在含Amp的LB固體培養(yǎng)基上，挑取單克隆菌落至5mL LB液中搖菌12h左右，抽提質(zhì)粒，通過BamHI和EcoRI雙酶切鑒定陽性克隆。

1.2.4 絲瓜籽Luffin-α基因在E.coli中的可溶性表達鑒定 挑取重組大腸桿菌單菌落至5mL含Amp的LB培養(yǎng)基中，37℃，180r/min振蕩培養(yǎng)過夜后，將菌液按1∶100的比例接種至200mL含Amp的LB培養(yǎng)基中，37℃，220r/min振蕩培養(yǎng)約2h后，加入IPTG至終濃度為1mmol·L-1，在誘導(dǎo)溫度為16℃，180r/min的條件下培養(yǎng)20h左右。5 000r/min離心收菌后進行超聲裂體，超聲2s，間隙2s，功率50%，總時20min，12 000r/min離心收集上清液與沉淀，以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 （sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）進行可溶性表達鑒定。

1.2.5 絲瓜籽Luffin-α基因可溶性表達的優(yōu)化體系構(gòu)建

1.2.5.1 IPTG濃度的優(yōu)化 按1.2.4中操作常溫培養(yǎng)菌液后，取出冷卻數(shù)分鐘，分別加入IPTG至終濃度為0.3、0.5、0.8、1mmol·L-1， 分別置于16℃的低溫搖床中培養(yǎng)20h，超聲裂解后收集上清液，進行SDS-PAGE電泳檢測，篩選最佳IPTG濃度。

1.2.5.2 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化 按1.2.4中操作常溫培養(yǎng)菌液后，加入IPTG終濃度至0.8mmol·L-1，分別在10、16、25、37℃的條件下誘導(dǎo)20h左右。誘導(dǎo)結(jié)束后超聲裂體收集上清液，進行SDS-PAGE電泳檢測，篩選最佳誘導(dǎo)溫度。

1.2.6 Luffin-α重組蛋白的SDS-PAGE和Western blot檢測 按照1.2.5探索出的最佳優(yōu)化體系進行目標(biāo)蛋白的可溶性表達，下一步進行GST融合標(biāo)簽純化，步驟如下：取上清液過0.45μm濾膜，將上清液與400μL谷胱甘肽瓊脂糖純化樹脂混合后在冰上搖45min，然后用10倍柱體積的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗，Bradford檢測是否洗凈，最后用10mmol GST Elution Buffer 400μL洗脫4次，SDSPAGE電泳檢測目標(biāo)蛋白純度。

提取的Luffin-α蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，在轉(zhuǎn)膜儀上將凝膠轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束采用脫脂奶封閉2h，加入GST單克隆抗體，4℃孵育過夜，Tris-吐溫緩沖液（Tris buffered saline Tween，TBST）洗滌，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗，搖床常溫孵育2h，TBST洗滌，用電化學(xué)（electro-chemiluminescence，ECL）發(fā)光液顯影。

1.2.7 重組蛋白的抗腫瘤活性實驗 將對數(shù)生長期的HepG2細胞和MDA-MB-231細胞分別按5×104個/L和1×105個/mL的細胞數(shù)量接種于96孔板中，每孔100μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。細胞貼壁后，分別以6.25、12.5、25、50、100、200、400μg·mL-1的重組蛋白對HepG2細胞和MDA-MB-231細胞進行梯度給藥，每種濃度設(shè)6個復(fù)孔，同時設(shè)置對照組，對照組重組蛋白濃度為0μg·mL-1。HepG2細胞置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h，MDA-MB-231細胞則置于無CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48h。終止培養(yǎng)時，每孔加入20μL MTT溶液，培養(yǎng)箱中再孵育4h，然后吸除MTT溶液，加入150μL DMSO，避光振蕩15min后，490nm處檢測吸光度，計算細胞存活率及其半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50），并比較Luffinα重組蛋白對兩種細胞的抑制作用。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 絲瓜籽Luffin-α基因的擴增 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳，發(fā)現(xiàn)一條大小約為800bp的明顯亮帶，與目的基因大小基本吻合。見圖1。該基因經(jīng)過T-A克隆，與pTA2載體相連接并測序，鑒定發(fā)現(xiàn)該基因序列與GeneBank中已報道的Luffin-α基因序列完全相同。

圖1 RT-PCR擴增絲瓜籽Luffin-α基因Fig.1 Amplification of the Luffin-α gene from the seeds of Luffa Cylindrica by RT-PCR

2.2 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 將上述克隆獲得的Luffin-α基因通過酶切、連接方式克隆到pGEX6P-1載體的BamHI和EcoRI位點處。將獲得的重組質(zhì)粒（pGEX6P-1/Luffin-α）進行雙酶切鑒定，1%瓊脂糖電泳檢測結(jié)果顯示，雙酶切（BamHI和EcoRI）產(chǎn)物出現(xiàn)一條大小約為800bp的條帶，與目的條帶大小一致。見圖2。進一步測序驗證后表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒（pGEX6P-1/Luffin-α）雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid（pGEX6P-1/Luffin-α） by restriction enzymatic digestion

2.3 重組蛋白的初步表達鑒定 重組質(zhì)粒pGEX6P-1/Luffin-α轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中進行誘導(dǎo)表達，對細胞裂解后的上清液和沉淀進行SDS-PAGE電泳檢測。第2泳道是pGEX6P-1/Luffin-α轉(zhuǎn)化至大腸桿菌誘導(dǎo)表達后的上清液，發(fā)現(xiàn)有56kD的目標(biāo)蛋白條帶，而沉淀中目標(biāo)蛋白的含量較少。見圖3。由此表明，融合蛋白大多以可溶性形式存在于上清液當(dāng)中。

2.4 絲瓜籽Luffin-α基因可溶性表達的最佳優(yōu)化條件

2.4.1 誘導(dǎo)的最佳IPTG濃度 在誘導(dǎo)溫度為16℃，IPTG終濃度分別為0.3、0.5、0.8、1mmol·L-1的條件下分別誘導(dǎo)20h。SDS-PAGE電泳圖顯示重組可溶性蛋白Luffin-α均有表達， 但IPTG終濃度為0.8、1mmol·L-1的表達量比IPTG終濃度為0.3、0.5mmol·L-1的多，且由于IPTG終濃度為0.8和1mmol.L-1時表達量較為接近。見圖4。 因此，選用0.8mmol·L-1作為誘導(dǎo)Luffin-α基因可溶性表達的最佳IPTG濃度。

圖3 重組蛋白在BL21（DE3）中的表達Fig.3 Expression of recombinant protein in BL21（DE3）

圖4 IPTG濃度對Luffin-α重組蛋白原核表達的影響Fig.4 Effects of IPTG concentrations on prokaryotic expression of Luffin-α recombinant protein

2.4.2 誘導(dǎo)的最佳溫度 在IPTG終濃度為0.8mmol·L-1、誘導(dǎo)溫度為10、16、25、37℃的條件下分別誘導(dǎo)20h后進行SDS-PAGE電泳鑒定。結(jié)果表明，Luffin-α重組蛋白均有表達，但以16℃條件下表達量最多。見圖5。

2.4.3 Luffin-α重組蛋白的可溶性表達 在0.8mmol·L-1IPTG，16℃誘導(dǎo)20h的最佳優(yōu)化體系下可溶性表達Luffin-α重組蛋白，將純化后的蛋白進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示56kD處產(chǎn)生一條特異性條帶，表明帶有GST標(biāo)簽的Luffin-α重組蛋白已成功表達。見圖6。Western blot鑒定發(fā)現(xiàn)純化后的重組蛋白條帶濃集，GST標(biāo)簽含量較少，且重組蛋白反應(yīng)原性較強。見圖7。

圖5 誘導(dǎo)溫度對Luffin-α重組蛋白原核表達的影響Fig.5 Effects of induction temperature on prokaryotic expression of Luffin-α recombinant protein

圖6 重組GST-Luffin-α蛋白的SDS-PAGE檢測Fig.6 SDS-PAGE analysis of recombinant GST-Luffin-α protein

圖7 重組GST-Luffin-α蛋白的Western blot鑒定Fig.7 Western blot analysis of recombinant GST-Luffin-α protein

2.5 重組蛋白的抗腫瘤活性實驗 Luffin-α重組蛋白對HepG2細胞和MDA-MB-231細胞具有不同程度的抑制作用。作用HepG2細胞24、48、72h后，細胞存活率見圖8，IC50分別為182、100.04、87.85μg·mL-1。 作用MDA-MB-231細胞24、48h后，細胞存活率見圖9，IC50分別為278.53、208.94μg·mL-1。隨著Luffin-α蛋白濃度的增加和作用時間的延長，細胞存活率顯著下降，呈現(xiàn)一定的濃度-時間依賴性。 400μg·mL-1Luffin-α重組蛋白對HepG2細胞和MDA-MB-231細胞均具有較好的抑制效果。見圖10、11。分別對HepG2細胞和MDA-MB-231細胞的24、48h給藥組進行比較，兩者只有50、100、200μg·mL-1組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖12。由此表明低濃度的Luffin-α重組蛋白對兩種細胞的增殖抑制作用較為相似，而高濃度則呈現(xiàn)一定的差異。

3 討論

RIPs是廣泛存在于不同植物細胞中并能抑制真核細胞蛋白質(zhì)合成的一類毒素蛋白[8]，現(xiàn)已從350余種植物中篩選到110多種RIPs。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)的不同可以分為3型：Ⅰ型RIPs為單鏈蛋白，只含有單一的RNA N-糖苷酶結(jié)構(gòu)域，其代表是天花粉蛋白（trichosanthin，TCS）[9]、 苦瓜蛋白 （momoridica anti-HIV protein，MAP30）、絲瓜蛋白（Luffin）等，因其具有良好的抗腫瘤、抗病毒活性，特別是具有抗艾滋病毒的活性而引起廣泛關(guān)注[10]；Ⅱ型RIPs含有一個具有RNA N-糖苷酶活性的A鏈和一個具有糖基識別活性的B鏈[4]，例如蓖麻毒素[11]、相思豆毒素等；Ⅲ型RIPs只有一條多肽鏈且不具備RNA N-糖苷酶活性，該類RIPs并不多見。

圖8 Luffin-α重組蛋白對HepG2細胞增殖的影響Fig.8 Effects of Luffin-α recombinant protein on HepG2 cell proliferation

圖9 Luffin-α重組蛋白對MDA-MB-231細胞增殖的影響Fig.9 Effects of Luffin-α recombinant protein on MDA-MB-231 cell proliferation

圖10 Luffin-α重組蛋白對MDA-MB-231細胞的抑制作用（100×）Fig.10 The inhibition of 400μg·mL-1Luffin-α recombinant protein on MDA-MB-231 cell （100×）

圖11 Luffin-α重組蛋白對HepG2細胞抑制作用（100×）Fig.11 The inhibition of Luffin-α recombinant proteinon HepG2 cell（100×）

絲瓜籽中存在—組單鏈RIP，包括Luffin-α、Luffin-β、Luffin-S等，其中Luffin-α是迄今為止分離到的毒性最強的RIP之一[12]。RIPs對腫瘤細胞的殺傷作用遠高于對正常細胞的影響，而且由于I型RIPs缺乏B鏈，所以這類毒素對完整的細胞幾乎沒有毒性[13]，而對單細胞系統(tǒng)中的蛋白生物合成則具有強烈的抑制活性，因此它是—種很有效的抗腫瘤蛋白[14-15]。

圖12 Luffin-α重組蛋白作用于HepG2和MDA-MB-231的細胞毒性分析Fig.12 Cytotoxicity analysis of Luffin-α recombinant protein on HepG2 and MDA-MB-231

鑒于Luffin-α顯著的抗腫瘤活性，本實驗構(gòu)建了Luffin-α的GST標(biāo)簽融合蛋白，但作為重組蛋白其在大腸桿菌中的表達較為復(fù)雜。通常情況下，融合蛋白的可溶性受到培養(yǎng)條件和表達載體的影響。大腸桿菌表達系統(tǒng)具有操作簡便、成本低廉的優(yōu)點，但在表達過程中極易形成不溶性的包涵體，影響可溶性蛋白的表達[16]。為盡可能增加Luffin-α重組蛋白在上清液中的含量，本實驗從IPTG濃度和誘導(dǎo)溫度兩方面進行考察，期望能盡量減少低溫誘導(dǎo)過程中蛋白質(zhì)的不正確折疊。 結(jié)果表明，IPTG終濃度為0.8mmol·L-1、16℃下誘導(dǎo)20h能最大程度地獲得Luffin-α重組蛋白，并用于下一步細胞毒性實驗研究。將Luffin-α重組蛋白分別作用于HepG2和MDA-MB-231兩種腫瘤細胞，由于不同細胞對藥物的敏感度存在差異，所以Luffin-α重組蛋白對兩種細胞顯示出不同程度的抑制作用。針對MDA-MB-231細胞的IC50明顯高于HepG2細胞，可能是因為與HepG2細胞比較，MDA-MB-231細胞對Luffin-α重組蛋白的吸收能力較差。而高濃度Luffinα重組蛋白對兩種細胞均顯示出較高的抑制作用，表明進入細胞內(nèi)的Luffin-α重組蛋白均能夠發(fā)揮較強的抗腫瘤活性。

本實驗對絲瓜籽Luffin-α基因進行了成功的克隆和原核表達，并通過SDS-PAGE和Western blot驗證了重組蛋白的純度和反應(yīng)原性，進一步通過細胞增殖抑制實驗，初步鑒定了重組Luffin-α蛋白對腫瘤細胞的毒性作用，為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了新思路。但由于其腫瘤細胞靶向性不強[17]，一定程度上需要增加給藥濃度，無可避免地增強了其毒性，下一步將考慮將其與腫瘤導(dǎo)向肽結(jié)合，增強其針對腫瘤細胞的導(dǎo)向性[18-19]，從而達到靶向治療的目的。