黎李俊，楊國(guó)輝

1貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng) 550001 2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)科ICU，貴陽(yáng) 550001

膿毒癥是指由感染引起的機(jī)體器官功能障礙并且伴有多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的誘導(dǎo)、合成和釋放的綜合征[1]，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，病理生理過(guò)程復(fù)雜，致使膿毒癥在臨床上的病死率達(dá)到30%，而且其導(dǎo)致的多器官功能障礙(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的病死率高達(dá)50%[2- 3]。因此，建立適宜的膿毒癥多器官功能障礙動(dòng)物模型對(duì)研究膿毒癥的病理生理機(jī)制，指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。目前使用的大鼠膿毒癥模型包括腹腔注射脂多糖模型、腹腔注射細(xì)菌模型以及經(jīng)典的盲腸結(jié)扎穿刺(cecal ligation and puncture，CLP)模型[4]。CLP模型有類似于膿毒癥患者的臨床表現(xiàn)，并且對(duì)膿毒癥病理生理過(guò)程有很好的模擬性，作為最廣泛使用的膿毒癥模型，被認(rèn)為是研究膿毒癥的金標(biāo)準(zhǔn)[5]。然而，在實(shí)際操作過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)該模型仍不能達(dá)到研究要求，發(fā)生多個(gè)器官功能損害不是特別明顯，死亡率低，且不符合膿毒癥的臨床預(yù)后[6]。據(jù)此，本研究嘗試以CLP模型為基礎(chǔ)，改進(jìn)并建立更符合腹腔感染致膿毒癥誘導(dǎo)的MODS動(dòng)物模型，為進(jìn)一步研究膿毒癥引起的MODS的發(fā)病機(jī)制及預(yù)防奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

動(dòng)物與分組健康SPF級(jí)雄性SD大鼠，96只，8～10周齡，體質(zhì)量250～300 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(黔)2018- 0001]，采用隨機(jī)數(shù)字分組法分為假手術(shù)組、置管組、CLP組、CLP+置管組，每組24只。實(shí)驗(yàn)于貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行[SYXK(黔)2018- 0001]，本研究經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(IACUC1900648)。

主要試劑與材料戊巴比妥鈉(Sigma公司，美國(guó))，10%甲醛(南昌雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司，中國(guó))，蘇木精、伊紅(貴州吉?jiǎng)?chuàng)生物科技有限公司，中國(guó))，2 ml EDTA-K2抗凝管和2 ml肝素鈉管(山東華博醫(yī)療器械有限公司，中國(guó))，留置導(dǎo)管(5.5號(hào)靜脈采血針套管)，普通離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，全封閉式組織脫水機(jī)ASP300(Leica公司，德國(guó))，全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)RM2255(Leica公司，德國(guó))，全自動(dòng)染色封片一體機(jī)CV5020(Leica公司，德國(guó))，組織包埋機(jī)EG1150H(Leica公司，德國(guó))，恒溫烤箱DRP- 9082(上海培因?qū)嶒?yàn)儀器有限公司，中國(guó))，光學(xué)顯微鏡CX31[奧林巴斯(中國(guó))有限公司，日本]，全自動(dòng)五分類血液細(xì)胞分析儀BC6800(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，中國(guó))，BS- 380全自動(dòng)血液生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，中國(guó))，白細(xì)胞介素(interleukin，IL)- 6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)檢測(cè)試劑盒(eBioscience公司，美國(guó))，血?dú)夥治鰞xABL 80 FLEX(Radiometer公司，美國(guó))，血?dú)夥治鲈噭┖蠥BL 80 SC80(Radiometer公司，美國(guó))，4℃電冰箱(青島海爾電器有限公司)，-80℃超低溫冰箱(SANYO公司，日本)，低速離心機(jī)(安科生物科技有限公司，中國(guó))。

模型制作以2%戊巴比妥鈉按50 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，麻醉滿意后大鼠無(wú)翻正反射，以碘伏常規(guī)消毒腹部區(qū)域，鋪無(wú)菌洞巾，沿腹正中線作一長(zhǎng)約1.0 cm縱行切口，用無(wú)菌鑷探查并拖出暴露盲腸。假手術(shù)組：僅把盲腸拉出腹腔，然后還納腹腔。置管組：把盲腸拖出腹腔，再還納腹腔后在盲腸處橫行置入5.5號(hào)靜脈采血針套管一根。CLP組：在距盲腸盲端2 cm處用無(wú)菌4號(hào)絲線結(jié)扎盲腸，用20 G套管針將盲腸盲端貫通穿孔2次，避免損傷腸系膜及盲腸血管，擠出少許糞便后回納腹腔，逐層縫合腹壁切口。CLP+置管組：在盲腸末端1/2處用無(wú)菌4號(hào)絲線將5.5號(hào)靜脈采血針套管一并緊緊結(jié)扎在盲腸上，使其與盲腸呈“十”字型，然后用20 G套管針將盲腸貫通穿孔2次，避免損傷腸系膜及盲腸血管，擠出少許糞便后回納腹腔，逐層縫合。術(shù)后各組大鼠均行皮下注射預(yù)熱生理鹽水5 ml補(bǔ)充手術(shù)中丟失的體液，并將其置于熱墊上直至麻醉蘇醒后送回飼養(yǎng)室正常飼養(yǎng)。

生存試驗(yàn)動(dòng)態(tài)觀察4組大鼠術(shù)后的病死率，觀察時(shí)間為24 h[7]。

形態(tài)學(xué)檢查4組大鼠均于術(shù)后24 h經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉后，常規(guī)開(kāi)腹觀察腹腔狀況。取大鼠心尖部、左下肺、左肝中葉、左腎上極，除去大血管和結(jié)締組織，分別取0.5 mm3各臟器組織投入10%甲醛中固定，各組織依次行脫水、透明、包埋、切片、蘇木精-伊紅染色后光鏡下觀察。

各臟器病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

心肌組織損傷病理評(píng)分：包括炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及壞死面積<25%計(jì)1分，25%～50%計(jì)2分，50%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分。

肺組織損傷病理積分：共7項(xiàng)指標(biāo)：(1)肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血；(2)肺泡腔內(nèi)水腫液；(3)肺間質(zhì)水腫；(4)炎細(xì)胞浸潤(rùn)支氣管；(5)肺泡壁增厚變寬(炎細(xì)胞浸潤(rùn)或者纖維化)；(6)肺間質(zhì)出血；(7)肺泡腔內(nèi)見(jiàn)紅細(xì)胞；每項(xiàng)指標(biāo)積分為無(wú)病變計(jì)0分，<25%計(jì)1分，25%～50%計(jì)2分，50%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分。

肝組織損傷病理積分：共5項(xiàng)指標(biāo)：(1)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；(2)肝細(xì)胞水樣變形；(3)肝細(xì)胞脂肪變性；(4)肝細(xì)胞壞死；(5)肝竇擴(kuò)張充血；每項(xiàng)指標(biāo)積分為：正常、輕度視野范圍≤25%計(jì)1分，中度視野范圍25%～50%計(jì)2分，重度視野范圍≥50%計(jì)3分。

腎組織損傷病理積分：共6項(xiàng)指標(biāo)：(1)腎小管內(nèi)皮細(xì)胞變性壞死；(2)腎小管上皮細(xì)胞水腫、空泡變性或顆粒變性；(3)腎小管擴(kuò)張；(4)腎小球萎縮；(5)腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；(6)腎間質(zhì)出血；每項(xiàng)指標(biāo)積分為無(wú)病變計(jì)0分，損傷面積<25%計(jì)1分，損傷面積25%～50%計(jì)2分，損傷面積50%～75%計(jì)3分，損傷面積>75%計(jì)4分。

血白細(xì)胞和血小板檢測(cè)經(jīng)2%戊巴比妥麻醉大鼠后，開(kāi)腹取下腔靜脈血1 ml置于EDTA-K2抗凝管中，用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀行血細(xì)胞分析檢測(cè)血白細(xì)胞(whole blood cells，WBC)和血小板(platelet，PLT)值。

IL- 6、TNF-α檢測(cè)取下腔靜脈血1.5 ml，離心后取上層血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清IL- 6和TNF-α水平，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

血?dú)夥治鋈「怪鲃?dòng)脈血2 ml置于肝素鈉管中，在血?dú)夥治鰞x上檢測(cè)PaO2、pH及乳酸(lactic acid，LAC)水平，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)采下腔靜脈血2.5 ml，經(jīng)3000 轉(zhuǎn)/min(轉(zhuǎn)子半徑15 cm)離心7 min，取上層血清用血液生化分析儀檢測(cè)肌鈣蛋白T(troponin T，cTnT)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)和肌酐(creatinine，CREA)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)后均不滿足參數(shù)檢驗(yàn)的應(yīng)用條件(正態(tài)性和方差齊性)，因此本研究中的數(shù)據(jù)分析均采用多組獨(dú)立樣本比較的秩和檢驗(yàn)，即Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義后(P<0.05)，用Bonferroni法校正顯著性水平進(jìn)行組與組之間的兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；本研究所有分析在SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件下完成。

結(jié) 果

膿毒癥病死率術(shù)后24 h，假手術(shù)組和置管組24只大鼠均存活，無(wú)病死率；CLP組19只大鼠存活，病死率20.8%；CLP+置管組11只大鼠存活，病死率54.2%。CLP+置管組病死率明顯高于CLP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。

一般情況假手術(shù)組：大鼠清醒后可正?；顒?dòng)，12 h后未出現(xiàn)明顯不良癥狀，少數(shù)大鼠出現(xiàn)豎毛，飲食正常，活動(dòng)正常，無(wú)嗜睡，無(wú)蜷縮等；24 h后仍未出現(xiàn)病態(tài)癥狀，排尿約14 ml，排便排尿相比手術(shù)前24 h無(wú)減少；解剖發(fā)現(xiàn)腹腔未見(jiàn)明顯滲液，腸管未見(jiàn)擴(kuò)張，腹壁傷口處有網(wǎng)膜包裹，余臟器無(wú)明顯改變。置管組：大鼠清醒后活動(dòng)如常，12 h后未出現(xiàn)不良癥狀，近半數(shù)大鼠出現(xiàn)豎毛、飲食減少，活動(dòng)如常，無(wú)嗜睡，無(wú)蜷縮等；24 h后仍未出現(xiàn)病態(tài)癥狀，排尿約14 ml，排便排尿較術(shù)前24 h無(wú)減少；解剖發(fā)現(xiàn)腹腔少許滲液，腸管無(wú)明顯擴(kuò)張，套管及腹壁傷口處有網(wǎng)膜包裹，余臟器無(wú)明顯病變。CLP組：大鼠清醒后可正?；顒?dòng)，12 h后出現(xiàn)攝食減少、嗜睡、蜷縮、豎毛、活動(dòng)減少等；24 h后多數(shù)大鼠存活，排尿約12 ml，排便排尿相較手術(shù)前24 h有所減少；解剖觀察見(jiàn)腹腔少量滲液，輕微惡臭，腸管輕度擴(kuò)張，結(jié)扎端盲腸腫脹明顯，被網(wǎng)膜包被，與附近腸道黏連形成包塊，大部分大鼠出現(xiàn)單個(gè)臟器(如肝臟、肺臟、腎臟)輕度充血，余臟器無(wú)明顯改變。CLP+置管組：大鼠清醒后能正常活動(dòng)，但未到12 h即出現(xiàn)逐漸加重的病態(tài)癥狀，活動(dòng)減少，受刺激后無(wú)明顯躲避動(dòng)作，無(wú)進(jìn)食，嗜睡、蜷縮、豎毛、腹脹顯著，12 h內(nèi)偶有死亡，12 h后死亡大鼠增多，排尿約9 ml，糞便稀薄，排尿較前明顯減少；剖腹探查示腹腔內(nèi)有大量膿性滲出物，惡臭，腸道明顯擴(kuò)張，結(jié)扎末端盲腸發(fā)黑并腫脹，有膿苔包裹，與周圍肝、腎、小腸、膀胱、網(wǎng)膜等組織黏連成團(tuán)，肺臟可見(jiàn)充血，肝表面可見(jiàn)出血點(diǎn)，多數(shù)大鼠見(jiàn)兩個(gè)以上臟器充血出血。

臟器組織形態(tài)學(xué)變化及病理學(xué)評(píng)分

心臟：假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列整齊，血管無(wú)擴(kuò)張充血，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；置管組心肌細(xì)胞排列整齊，未見(jiàn)血管擴(kuò)張充血，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；CLP組心肌細(xì)胞排列尚齊，可見(jiàn)毛細(xì)血管充血，部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；CLP+置管組心肌細(xì)胞排列紊亂，毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張充血，纖維變性壞死，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)。假手術(shù)組評(píng)分的中位數(shù)為2(n=24)，置管組為3(n=24)，CLP組為5(n=19)，CLP+置管組為6(n=11)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=57.770，P=0.000)；其中，假手術(shù)組和置管組的病理學(xué)評(píng)分均低于CLP組及CLP+置管組(P均=0.000)；假手術(shù)組與置管組、CLP組與CLP+置管組的病理學(xué)評(píng)分差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000，P=0.694)。

肺臟：假手術(shù)組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；置管組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)無(wú)異常，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；CLP組肺泡周圍血管腔明顯擴(kuò)張充血，纖維間隔增厚，部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；CLP+置管組肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞，肺泡擴(kuò)張融合，纖維間隔明顯增厚，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2)。假手術(shù)組評(píng)分的中位數(shù)為1(n=24)，置管組為1(n=24)，CLP組為14(n=19)，CLP+置管組為24(n=11)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=62.983，P=0.000)；其中，假手術(shù)組和置管組的病理學(xué)評(píng)分均低于CLP組及CLP+置管組(P均=0.000)；假手術(shù)組與置管組、CLP組與CLP+置管組的病理學(xué)評(píng)分差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000，P=0.884)。

肝臟：假手術(shù)組大鼠肝小葉及肝細(xì)胞形態(tài)正常，匯管區(qū)未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；置管組大鼠肝小葉形態(tài)正常，匯管區(qū)無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；CLP組少數(shù)大鼠肝細(xì)胞水腫，氣球樣變性，肝竇變狹，匯管區(qū)見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；CLP+置管組多數(shù)大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)不清，肝細(xì)胞廣泛水腫，氣球樣變性明顯，肝竇明顯狹窄，匯管區(qū)見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3)。假手術(shù)組評(píng)分的中位數(shù)為5(n=24)，置管組為7(n=24)，CLP組為9(n=19)，CLP+置管組為11(n=11)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=62.827，P=0.000)；其中，假手術(shù)組的病理學(xué)評(píng)分低于置管組、CLP組及CLP+置管組(P均=0.000)；置管組的病理學(xué)評(píng)分低于CLP+置管組(P=0.001)；置管組與CLP組、CLP組與CLP+置管組的病理學(xué)評(píng)分差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.078，P=0.688)。

腎臟：假手術(shù)組腎小球結(jié)構(gòu)正常，腎小管管腔完整，未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；置管組腎小球結(jié)構(gòu)正常，腎小管管腔完整，腎間質(zhì)未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；CLP組少數(shù)大鼠腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，灶性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；CLP+置管組腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血，腎小管上皮細(xì)胞水腫、空泡變性，可見(jiàn)腎皮質(zhì)及間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4)。假手術(shù)組評(píng)分的中位數(shù)為1(n=24)，置管組為1(n=24)，CLP組為9(n=19)，CLP+置管組為13(n=11)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=63.934，P=0.000)；其中，假手術(shù)組和置管組的病理學(xué)評(píng)分均低于CLP組及CLP+置管組(P均=0.000)。

大鼠WBC和PLT水平

WBC水平：假手術(shù)組分別與CLP組(P=0.000)、CLP+置管組(P=0.000)比較，置管組分別與CLP組(P=0.000)、CLP+置管組(P=0.000)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；假手術(shù)組與置管組(P=0.391)、CLP組與CLP+置管組(P=0.458)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

CLP：盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)

A.假手術(shù)組；B.置管組；C.CLP組；D.CLP+置管組

A.假手術(shù)組；B.置管組；C.CLP組；D.CLP+置管組

A.假手術(shù)組；B.置管組；C.CLP組；D.CLP+置管組

PLT水平：假手術(shù)組分別與CLP組(P=0.000)、CLP+置管組(P=0.000)比較，置管組分別與CLP組(P=0.000)、CLP+置管組(P=0.000)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；假手術(shù)組與置管組(P=1.000)、CLP組與CLP+置管組(P=0.259)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 4組大鼠血白細(xì)胞和血小板水平比較(中位數(shù)，G/L)

大鼠血清IL- 6、TNF-α水平

IL- 6水平：假手術(shù)組分別與CLP組(P=0.000)、CLP+置管組(P=0.000)比較，置管組分別與CLP組(P=0.001)、CLP+置管組(P=0.000)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而假手術(shù)組與置管組(P=0.346)、CLP組與CLP+置管組(P=0.484)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

TNF-α水平：假手術(shù)組分別與置管組(P=0.003)、CLP組(P=0.000)及CLP+置管組(P=0.000)比較，置管組分別與CLP組(P=0.009)、CLP+置管組(P=0.000)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CLP組與CLP+置管組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.484)(表2)。

表2 4組大鼠血清白細(xì)胞介素- 6、腫瘤壞死因子-α水平比較(中位數(shù)，pg/ml)

血?dú)夥治龅淖兓?/p>

pH水平：假手術(shù)組分別與置管組(P=0.023)、CLP組(P=0.025)比較，置管組分別與CLP組(P=0.000)、CLP+置管組(P=0.000)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；假手術(shù)組與CLP+置管組(P=0.121)、CLP組與CLP+置管組(P=1.000)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

PaO2水平：假手術(shù)組分別與置管組(P=0.043)、CLP組(P=0.002)、CLP+置管組(P=0.000)比較，置管組分別與CLP組(P=0.000)、CLP+置管組(P=0.000)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CLP組與CLP+置管組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.501)(表3)。

LAC水平：假手術(shù)組分別與CLP組(P=0.000)、CLP+置管組(P=0.000)比較，置管組分別與CLP組(P=0.000)、CLP+置管組(P=0.000)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，假手術(shù)組與置管組(P=1.000)、CLP組與CLP+置管組(P=0.487)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3 4組大鼠血?dú)夥治霰容^(中位數(shù))

大鼠血生化結(jié)果

CK-MB含量：假手術(shù)組分別與置管組(P=0.008)、CLP組(P=0.000)、CLP+置管組(P=0.000)比較，置管組分別與CLP組(P=0.006)、CLP+置管組(P=0.000)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。

cTnT含量：假手術(shù)組分別與置管組(P=0.009)、CLP組(P=0.000)、CLP+置管組(P=0.000)比較，置管組分別與CLP組(P=0.005)、CLP+置管組(P=0.000)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。

ALT含量：假手術(shù)組分別與CLP組(P=0.000)、CLP+置管組(P=0.000)比較，置管組分別與CLP組(P=0.000)、CLP+置管組(P=0.000)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。

AST含量：假手術(shù)組分別與置管組(P=0.002)、CLP組(P=0.000)、CLP+置管組(P=0.000)比較，置管組分別與CLP組(P=0.011)、CLP+置管組(P=0.000)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。

TBIL含量：假手術(shù)組分別與置管組(P=0.002)、CLP組(P=0.000)、CLP+置管組(P=0.000)比較，置管組分別與CLP組(P=0.012)、CLP+置管組(P=0.000)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。

BUN含量：假手術(shù)組分別與置管組(P=0.007)、CLP組(P=0.000)、CLP+置管組(P=0.000)比較，置管組分別與CLP組(P=0.006)、CLP+置管組(P=0.000)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。

CREA含量：假手術(shù)組分別與置管組(P=0.001)、CLP組(P=0.000)、CLP+置管組(P=0.000)比較，置管組分別與CLP組(P=0.012)、CLP+置管組(P=0.000)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。

表4 4組大鼠血生化功能分析比較(中位數(shù))

討 論

膿毒癥是機(jī)體對(duì)感染的反應(yīng)失控而導(dǎo)致危機(jī)生命的器官功能障礙的全身性疾病，臨床死亡率居高不下[8]。根據(jù)膿毒癥的發(fā)病因素、病理生理過(guò)程以及臨床特點(diǎn)，膿毒癥動(dòng)物模型必需具備以下基本要素：(1)具有高排低阻血流動(dòng)力學(xué)以及高代謝狀態(tài)的典型膿毒癥表現(xiàn)；(2)存在多個(gè)器官功能障礙[9]；(3)具有較高的自然死亡率，要求動(dòng)物模型的自然死亡率達(dá)到50%～70%；(4)膿毒癥是嚴(yán)重感染引起機(jī)體炎癥反應(yīng)過(guò)度激活而引起的自我損傷，不是細(xì)菌和內(nèi)毒素對(duì)機(jī)體的直接傷害，因此，從膿毒癥模型制備到出現(xiàn)器官功能障礙和動(dòng)物死亡需要一定的時(shí)間[10]。如果器官功能障礙或死亡在造模后6～12 h后發(fā)生，一般是由全身炎癥反應(yīng)引起[11]。

CLP模型雖然被許多學(xué)者認(rèn)為是研究膿毒癥的金標(biāo)準(zhǔn)，但是也存在一些問(wèn)題有待解決，如采取CLP法造模后大鼠全身炎癥反應(yīng)不重，未出現(xiàn)MODS[12]。大部分大鼠盲腸穿刺處被網(wǎng)膜和周圍組織包被黏連成團(tuán)塊，盲腸的穿刺孔常因?yàn)槊つc水腫被堵塞，這些都不能有效地造成持續(xù)性腹腔感染狀態(tài)，無(wú)法達(dá)到膿毒癥動(dòng)物模型的要求。而且盲腸的結(jié)扎長(zhǎng)度對(duì)模型的預(yù)后有重要影響[13]。傳統(tǒng)的CLP模型是由多種病原微生物感染引起的膿毒癥模型，可引起與人類膿毒癥相似的早期高動(dòng)力性(高排低阻)及晚期低動(dòng)力型(低排高阻)的血流動(dòng)力學(xué)變化[14]。而腹腔持續(xù)置管引流模型模仿的是腸瘺的過(guò)程，腹腔內(nèi)持續(xù)漏出腸內(nèi)容物，但沒(méi)有明顯的缺血壞死病灶，其嚴(yán)重程度與支架的直徑密切相關(guān)，但不足之處在于血流動(dòng)力學(xué)反應(yīng)特點(diǎn)不明顯[15]。據(jù)此，本研究在CLP模型的基礎(chǔ)上加入腹腔留置套管，通過(guò)將5.5號(hào)靜脈采血針套管結(jié)扎在盲腸上，使其與盲腸呈“十”字型，可有效減少盲腸穿刺處被網(wǎng)膜和周圍組織黏連包裹的狀態(tài)，防止穿刺孔被堵塞，使盲腸內(nèi)糞便可有效地流入腹腔造成持續(xù)性腹腔感染，而不致于糞便過(guò)少導(dǎo)致大鼠腹腔感染被局限化。本研究通過(guò)CLP模型加置管后即保留了傳統(tǒng)CLP模型的血流動(dòng)力學(xué)變化特點(diǎn)，也具備了腹腔持續(xù)置管引流模型有更強(qiáng)的炎癥因子反應(yīng)和更多的血液細(xì)菌數(shù)的特點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，CLP組大鼠腹腔內(nèi)感染病灶大多形成局部的炎性包裹，臟器水腫不明顯，而CLP+置管組大鼠除了形成彌漫性腹腔膿腫以外，整個(gè)腹腔臟器都充血水腫明顯。CLP+置管組大鼠腹腔感染更重，心肺肝腎組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，出血更明顯，CLP+置管組各臟器組織損傷病理積分均高于CLP組、假手術(shù)組和置管組；CLP+置管組血WBC、IL- 6和TNF-α均較CLP組升高，而PLT較CLP組下降；CLP+置管組PaO2低于CLP組，但LAC、pH均高于CLP組；CLP+置管組CK-MB、cTnT、ALT、AST、TBIL、CREA和BUN水平均較CLP組顯著增高。表明CLP+置管組改良造模后大鼠全身炎癥反應(yīng)嚴(yán)重，出現(xiàn)心肺肝腎等重要臟器合并損傷，基本上出現(xiàn)多器官功能障礙，病死率高，符合膿毒癥致多器官功能障礙綜合征的病理生理過(guò)程及臨床特點(diǎn)。

綜上，本研究顯示雖然兩組模型均較好地模擬了膿毒癥的病理生理機(jī)制，但CLP+置管組發(fā)生了明顯的多器官功能障礙。運(yùn)用CLP+置管組可以復(fù)制出更接近臨床實(shí)際的腹腔感染誘發(fā)的膿毒癥引起的多器官功能障礙的動(dòng)物模型。但本研究?jī)H關(guān)注造模后24 h膿毒癥大鼠的情況，有待進(jìn)一步動(dòng)態(tài)觀察不同時(shí)間點(diǎn)膿毒癥大鼠炎性因子水平和臟器功能的變化，以明確其不同時(shí)期變化的原因。