何珺珺,時 偉,李 喆,甘廣東
(茅臺學院 釀酒工程系,貴州 仁懷564501)
白酒作為我國傳統(tǒng)蒸餾酒,2019年產(chǎn)量達到785.95萬kL。白酒在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量的酒糟,研究發(fā)現(xiàn),白酒與酒糟的產(chǎn)量比為1∶3[1],預計2019年我國白酒酒糟的年產(chǎn)量可達到約2.4×107t。酒糟作為釀酒產(chǎn)業(yè)副產(chǎn)物,其中含有很多未被利用的粗淀粉、粗蛋白、粗脂肪及有機酸類物質(zhì)。酒糟中粗淀粉含量為6.77%,粗蛋白含量為13.28%,粗脂肪含量為2.51%[2]。酒糟產(chǎn)量大,酸度高,其生化需氧量約為25 000~35 000 mg/L,化學需氧量約為35 000~50 000 mg/L,如果處理或利用不當,易腐爛、變質(zhì)、發(fā)臭,造成環(huán)境污染和資源浪費[3-4]。如何高效利用酒糟是各白酒企業(yè)一直在探索的問題。目前,酒糟再利用的常見方法有生產(chǎn)飼料、作為菌菇類生長載體、生產(chǎn)有機肥、生產(chǎn)沼氣、釀造食用醋、提取蛋白酶等[5-6]。傳統(tǒng)的酒糟利用方法存在附加值低、預處理能耗高、二次污染等問題[7]。利用微生物處理酒糟以生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品(如植酸、丁二酸、洛伐他汀等),有利于提高酒糟的利用價值和增加酒糟循環(huán)利用的經(jīng)濟效益[8-9]。
洛伐他汀是一種聚酮類物質(zhì),有兩種結(jié)構(gòu)形態(tài),分別為酸型和內(nèi)酯型,兩種形態(tài)可相互轉(zhuǎn)化[10-11]。其對膽固醇合成限速酶-3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase,HMG-CoA)具有高效抑制作用,從而具有抑制膽固醇合成,控制高血脂的功效[12-13]。還具有保護內(nèi)皮祖細胞、抗血栓、抑制腫瘤細胞增殖等功能[14]。微生物來源的洛伐他汀主要以紅曲霉或土曲霉為菌種,大米、小米、大豆、青稞、黃精渣、花生、甘蔗渣等為培養(yǎng)基采用固態(tài)或液態(tài)法發(fā)酵生產(chǎn)[15-16]。目前,利用紅曲菌生產(chǎn)洛伐他汀的方法主要有固態(tài)發(fā)酵法和液態(tài)發(fā)酵法[17]。傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵法使用的基質(zhì)為大米[18],其中洛伐他汀的含量可達到14.54 mg/g。也有科研工作者以甘薯、木薯為基質(zhì)生產(chǎn)洛伐他汀[19-20]。
為了研究紅曲霉發(fā)酵酒糟制備洛伐他汀的效果,該研究采用固態(tài)發(fā)酵法,以茅臺醬香型白酒酒糟作為基質(zhì),以紅曲霉為菌種,并利用響應面法對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化,降低了生產(chǎn)成本,有效利用了白酒工業(yè)釀造副產(chǎn)物。1 材料與方法
1.1.1 材料與菌種
醬香型白酒酒糟:茅臺集團;紅色紅曲霉(Monascns ruber)CICC 41649:中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
1.1.2 培養(yǎng)基
活化培養(yǎng)基[21]:5°Bé麥芽汁1 L,瓊脂15 g,pH自然。
馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)斜面培養(yǎng)基:土豆(去皮)200 g,葡萄糖20 g,瓊脂15 g,蒸餾水1 000 mL,pH自然。
種子培養(yǎng)基[22]:葡萄糖60 g/L,蛋白胨25 g/L,NaNO32 g/L,MgSO4·7H2O 1 g/L。
發(fā)酵培養(yǎng)基[23]:干酒糟(含水量12%)84%,麩皮15%,硫酸銨0.5%,KH2PO40.2%,MnSO40.1%,ZnSO40.2%,混勻,調(diào)整初始含水量為40%。
以上培養(yǎng)基均在121 ℃條件下滅菌30 min。
1.1.3 試劑
洛伐他汀(純度≥98%):美國Sigma公司;瓊脂、葡萄糖、蛋白胨(均為生化試劑):國藥集團化學試劑有限公司;硫酸銨、NaNO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、MnSO4、ZnSO4、磷酸(均為分析純):成都科隆化工試劑廠;乙腈(色譜純):美國DIMA公司。
PYX-XHS-40J電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海躍進醫(yī)療器械廠;LS-B50L高壓蒸汽滅菌鍋:上海醫(yī)用核子儀器廠;Waterse2695高效液相色譜(highperformanceliquidchromatography,HPLC)儀:美國Waters公司。
1.3.1 紅曲霉固態(tài)發(fā)酵酒糟
將4 ℃保藏菌種接種到PDA斜面培養(yǎng)基,30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d。挑取孢子接種于種子培養(yǎng)基內(nèi),30 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)3 d作為種子液。
將種子液按20%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基,裝料量20 g/500 mL,30 ℃條件下培養(yǎng)3 d后,25 ℃培養(yǎng)20 d,每3 d扣瓶一次。
1.3.2 紅曲霉固態(tài)發(fā)酵酒糟產(chǎn)洛伐他汀工藝優(yōu)化單因素試驗
采用單因素輪換法,依次考察培養(yǎng)基裝料量(20g/500mL、40 g/500 mL、60 g/500 mL、80 g/500 mL、100 g/500 mL)、接種量(12%、16%、20%、24%、28%、32%)、培養(yǎng)基初始含水量(40%、45%、50%、55%、60%)、分段發(fā)酵溫度(22 ℃、24 ℃、25 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃)、發(fā)酵時間(5~21 d)對紅曲霉產(chǎn)洛伐他汀的影響。
1.3.3 紅曲霉固態(tài)發(fā)酵酒糟產(chǎn)洛伐他汀工藝優(yōu)化響應面試驗
在單因素試驗的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理及姜冰潔[24]的研究,選擇裝料量(A)、接種量(B)、初始含水量(C)為自變量,以洛伐他汀產(chǎn)量(Y)為響應值,利用Design-Expert 8.0.6軟件進行3因素3水平的響應面優(yōu)化試驗,Box-Behnken試驗因素與水平見表1。
表1 紅曲霉固態(tài)發(fā)酵酒糟產(chǎn)洛伐他汀工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for process optimization of lovastatin production from distillers' grains by solid-state fermentation of Monascus
1.3.4 洛伐他汀含量檢測方法
發(fā)酵樣品預處理:取發(fā)酵樣品70~80 ℃烘干后研磨過篩,取0.5 g于50 mL容量瓶中,用體積分數(shù)為70%的乙醇定容至50 mL,55 ℃水浴超聲萃取1 h,待測液經(jīng)有機濾膜過濾后,取上清液,采用HPLC法測定洛伐他汀含量[25]。
HPLC條件:AthenaC18-WP色譜柱(250mm×4.6mm,5μm),柱溫(30±0.5)℃,流動相為乙腈∶0.1%磷酸溶液=65∶35(V/V),流速1.0 mL/min,檢測波長238 nm。根據(jù)洛伐他汀標準品的保留時間進行定性,外標法定量。
1.3.5 數(shù)據(jù)處理
采用Origin 7.5進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,SPSS 23.0和Design-Expert 8.0.6進行數(shù)據(jù)分析。
2.1.1 培養(yǎng)基裝料量對洛伐他汀產(chǎn)量的影響
培養(yǎng)基裝料量對紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀的影響見圖1。
圖1 裝料量對洛伐他汀產(chǎn)量的影響Fig. 1 Effect of charge on lovastain production
裝料量對物料發(fā)酵具有重要影響,裝料量太多影響通氣,不利于紅曲霉孢子絲的生長,同時造成培養(yǎng)基的浪費。裝料量太少不能滿足紅曲霉生長繁殖的營養(yǎng)需要。由圖1可知,隨著裝料量的增加,洛伐他汀產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,當裝料量為40 g/500 mL時,洛伐他汀產(chǎn)量達到最大,為5.573 mg/g。當裝料量>40 g/500 mL后,隨著裝料量的增加,洛伐他汀產(chǎn)量反而降低。原因可能是紅曲霉在代謝過程中產(chǎn)生的熱量影響紅曲霉的次級代謝;也有可能是通氣性較差,影響紅曲霉的生長和繁殖。因此,確定培養(yǎng)基最佳裝料量為40 g/500 mL。
2.1.2 接種量對洛伐他汀產(chǎn)量的影響
接種量對紅曲霉固態(tài)發(fā)酵酒糟產(chǎn)洛伐他汀的影響見圖2。
圖2 接種量對洛伐他汀產(chǎn)量的影響Fig. 2 Effect of inoculum on lovastain production
由圖2可知,隨著接種量的增加,洛伐他汀產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。當接種量<24%時,洛伐他汀產(chǎn)量隨著接種量的增加而增加,原因可能是紅曲霉孢子生長速度快,代謝活動旺盛。當接種量為24%時,洛伐他汀產(chǎn)量達到最大值,為6.247 mg/g。當接種量>24%時,隨著接種量的增加,洛伐他汀產(chǎn)量下降,原因可能是接種量過大,有限的營養(yǎng)物質(zhì)被用于供給紅曲霉孢子的生長,不利于次級代謝和洛伐他汀的合成。因此,確定最佳接種量為24%。
2.1.3 培養(yǎng)基初始含水量對洛伐他汀產(chǎn)量的影響
培養(yǎng)基初始含水量對紅曲霉固態(tài)發(fā)酵酒糟產(chǎn)洛伐他汀的影響見圖3。
圖3 初始含水量對洛伐他汀產(chǎn)量的影響Fig. 3 Effect of initial water contents on lovastain production
水對微生物的代謝活動有較大影響,初始含水量是影響紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的重要因素之一,含水量太低,培養(yǎng)基干燥、松散,不利于菌體的生長;含水量太高,培養(yǎng)基易結(jié)塊,不利于紅曲霉代謝。由圖3可知,隨著培養(yǎng)基初始含水量的增加,洛伐他汀產(chǎn)量先增加后減少,當初始含水量為55%時,洛伐他汀產(chǎn)量達到最大值,為6.527 mg/g。因此,確定最佳初始含水量為55%。
2.1.4 發(fā)酵溫度對洛伐他汀產(chǎn)量的影響
發(fā)酵溫度對紅曲霉固態(tài)發(fā)酵酒糟產(chǎn)洛伐他汀的影響見圖4。
圖4 發(fā)酵溫度對洛伐他汀產(chǎn)量的影響Fig. 4 Effect of fermentation temperature on lovastain production
由圖4可知,發(fā)酵溫度對洛伐他汀產(chǎn)量有較大影響,紅曲霉經(jīng)過30 ℃培養(yǎng)3 d后,在變溫培養(yǎng)過程中,隨著溫度的升高,洛伐他汀產(chǎn)量先增加后減少,當發(fā)酵溫度為28 ℃時,洛伐他汀產(chǎn)量最高,為6.687 mg/g。因此,確定紅曲霉最佳發(fā)酵溫度為28 ℃。
2.1.5 發(fā)酵時間對洛伐他汀產(chǎn)量的影響
發(fā)酵時間對紅曲霉固態(tài)發(fā)酵酒糟產(chǎn)洛伐他汀的影響見圖5。
圖5 發(fā)酵時間對洛伐他汀產(chǎn)量的影響Fig. 5 Effect of fermentation time on lovastain production
洛伐他汀的產(chǎn)量是一個積累的過程。由圖5可知,從發(fā)酵第5天開始,洛伐他汀產(chǎn)量快速增加;發(fā)酵10 d后,洛伐他汀產(chǎn)量的增長速度變慢;發(fā)酵17 d時,洛伐他汀產(chǎn)量達到峰值,為6.777 mg/g;發(fā)酵17 d以后,洛伐他汀產(chǎn)量減少。因此,確定洛伐他汀的最佳培養(yǎng)時間為17 d。
2.2.1 模型的建立及方差分析
在單因素試驗的基礎(chǔ)上,確定分段發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時間17 d,選擇影響較大的因素培養(yǎng)基裝料量(A)、接種量(B)、初始含水量(C)3個因素為變量,洛伐他汀產(chǎn)量(Y)為響應值,進行3因素3水平的響應面分析試驗,試驗設(shè)計及結(jié)果見表2,方差分析結(jié)果見表3。
表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments
表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model
利用Design-Expert8.0.6軟件對表2的試驗結(jié)果進行二次線性回歸擬合,得到多元二次回歸方程:Y=6.80+0.71A+0.66B+0.68C+0.31AB+0.13AC+0.021BC-1.97A2-2.32B2-1.79C2。
由表3可知,回歸模型的P值<0.000 1,極顯著,失擬項P值=0.065 8,不顯著,說明所構(gòu)建的模型合適。該模型的校正決定系數(shù)R2Adj=0.980 4,表示能較好地預測實際發(fā)酵情況,可用該模型來預測紅曲霉發(fā)酵酒糟制備洛伐他汀。一次項A、B、C及二次項A2、B2、C2對洛伐他汀產(chǎn)量的影響極顯著(P<0.01),其他項對結(jié)果影響不顯著(P>0.05)。通過F值可知,3個因素對洛伐他汀產(chǎn)量影響的主次順序為A>C>B,即裝料量>初始含水量>接種量。
2.2.2 響應面分析
利用Design-Expert8.0.6軟件得到裝料量、初始含水量及接種量間交互作用的響應面和等高線,結(jié)果見圖6。
圖6 各因素間交互作用對洛伐他汀產(chǎn)量影響的響應面及等高線Fig. 6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on lovastain production
由圖6可知,接種量、裝料量和初始含水量3個因素之間兩兩交互作用的響應曲面呈凸面,說明存在最高點;等高線趨于圓形,說明這些因素之間的交互作用不顯著。從等高線圖中軸向等高線變化密集程度可知,裝料量對洛伐他汀產(chǎn)量的影響>初始含水量,接種量對洛伐他汀產(chǎn)量的影響最小,與方差分析結(jié)果一致。
2.2.3 最優(yōu)發(fā)酵工藝的確定及驗證
通過對回歸方程進行分析,響應面優(yōu)化紅曲霉固態(tài)發(fā)酵酒糟制備洛伐他汀的最優(yōu)條件為裝料量44.90 g/500 mL,接種量24.51%,初始含水量56.05%,在此條件下30 ℃發(fā)酵3d后,28℃發(fā)酵17d,洛伐他汀產(chǎn)量的理論值達到6.981mg/g??紤]到實際操作可行性,將最優(yōu)發(fā)酵工藝修訂為裝液量45 g/500 mL,接種量25%,初始含水量56%。在此最優(yōu)發(fā)酵工藝下進行重復驗證試驗,洛伐他汀產(chǎn)量實際值為(6.97±0.05)mg/g,與預測值接近,證明響應面優(yōu)化得到的發(fā)酵工藝條件合理可靠。
本研究采用紅曲霉固態(tài)發(fā)酵酒糟生產(chǎn)洛伐他汀,在單因素試驗的基礎(chǔ)上,通過響應面試驗優(yōu)化得到紅曲霉發(fā)酵酒糟制備洛伐他汀的最優(yōu)條件為裝料量45 g/500 mL,接種量25%,初始含水量56%,分段發(fā)酵溫度28 ℃,發(fā)酵時間17 d,在此優(yōu)化條件下,洛伐他汀產(chǎn)量為(6.97±0.05)mg/g,是優(yōu)化前的1.3倍。本研究為酒糟等工業(yè)廢棄物的資源化利用提供參考。