劉慶,陳瓊,李化強(qiáng),吳菲菲,彭潔,王美英,胡平

(邵陽(yáng)學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院,湖南 邵陽(yáng),422000)

石榴(punicagrantumL)是屬于落葉類喬木一脈,在我國(guó)南北各地廣泛種植。近年來(lái),隨著石榴加工工業(yè)的發(fā)展,石榴的開(kāi)發(fā)應(yīng)用越來(lái)越廣泛,每年中國(guó)會(huì)產(chǎn)生數(shù)千噸石榴加工副產(chǎn)物,石榴籽質(zhì)量占果實(shí)總質(zhì)量的13%[1-2]。石榴籽提取物中含有多酚、多糖等活性成分,具有抗癌防癌、抗菌、抗氧化、抗衰老、降血壓以及抗腹瀉等生理和藥理活性作用[3-8]。目前,在石榴籽中有效成分的提取過(guò)程中存在提取效率低、有機(jī)溶劑用量大、溶解率低等問(wèn)題。微切助互作技術(shù)是在高強(qiáng)度的剪切力作用下,導(dǎo)致原料微粉的細(xì)胞壁和細(xì)胞器破碎,使原料微粉與固態(tài)助劑接觸的表面積增大,增大目標(biāo)提取物的溶解度,進(jìn)而提高了提取效率[9]。本課題組對(duì)微切助互作技術(shù)已有深入研究,并在刺五加、湘玉竹、龍牙百合、柑橘皮等物質(zhì)的提取試驗(yàn)中取得顯著效果[9-14]。本文以石榴籽為研究對(duì)象,利用微切互助技術(shù)粉碎,測(cè)定不同溶劑提取物的抗氧化活性,以便為石榴籽的應(yīng)用以及后續(xù)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：SZM-20磨介式超微粉碎機(jī)(上?？评鹂?；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司)；UV-1780紫外分光光度計(jì)(日本島津公司),ZN-1000A中草藥粉碎機(jī)(中南制藥機(jī)械廠)等。

試劑：DPPH(美國(guó)Sigma公司)；抗壞血酸(VC)、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸、卵磷脂、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、無(wú)水氯化鈣等(分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠)；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

新鮮的石榴籽經(jīng)漂洗烘干后,利用中草藥粉碎機(jī)進(jìn)行粗粉碎,時(shí)間為20 s,次數(shù)為3次,過(guò)100目篩(0.150 mm),密封冷藏備用[11]。然后稱取1 kg石榴籽粗粉于容器中,再與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的無(wú)水氯化鈣混合均勻,放入SZM-20型超微粉碎機(jī)中,研磨時(shí)間為15 min，研磨棒108根,制備石榴籽粉微切助粉,保存于密封容器內(nèi),備用。

1.2.2 樣品的制備

參照文獻(xiàn)[15],將10 g石榴籽粉末放入500 mL錐形瓶中,液料比為20 mL/g,分別加入蒸餾水和體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇進(jìn)行提取,充分搖勻,置于水浴鍋中,提取溫度為60 ℃,浸提時(shí)間為2 h,離心取上清液,進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,于50 ℃烘干至恒重備用。分別稱取0.1 g石榴籽水提物和石榴籽醇提物,加入蒸餾水和體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇配置成10 g/L的樣品溶液,然后進(jìn)行稀釋得到質(zhì)量濃度梯度為2，4，6和8 g/L的樣品溶液,密封冷藏備用。

1.2.3 抗氧化測(cè)定

1)DPPH·清除能力測(cè)定。參照文獻(xiàn)[16-18],以VC溶液作陽(yáng)性對(duì)照,檢測(cè)不同質(zhì)量濃度石榴籽提取物的DPPH·清除能力,按照下式計(jì)算DPPH·清除率:

式中:A0為DPPH與提取溶劑混合的吸光度；Ai為DPPH與樣品反應(yīng)后的吸光度；Aj為樣品與無(wú)水乙醇混合液的吸光度。

2)·OH清除能力測(cè)定。采用鄰二氮菲法[19-21],以VC溶液作陽(yáng)性對(duì)照,檢測(cè)不同質(zhì)量濃度石榴籽提取物的·OH清除能力,按照下式計(jì)算·OH清除率:

式中:A0為空白對(duì)照吸光度；Ai為測(cè)定樣品吸光度；Aj為測(cè)定本底吸光度。

式中:A0為緩沖液與鄰苯三酚的吸光度；Ai為樣品待測(cè)液、緩沖液及鄰苯三酚的吸光度；Aj為樣品待測(cè)液與緩沖液的吸光度。

4)抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力測(cè)定。采用硫代巴比妥酸法[25-27],以VC溶液作陽(yáng)性對(duì)照,檢測(cè)不同質(zhì)量濃度石榴籽提取物的抗脂質(zhì)過(guò)氧化(lipid peroxidation,LPO)能力,按照下式計(jì)算LPO抑制率:

式中:A0為不加樣品時(shí)的吸光度；Ai為加入樣品后的吸光度。

1.2.4 IC50值的計(jì)算

IC50是指清除率為50%時(shí)所需要的樣品濃度,根據(jù)樣品的清除率曲線以及利用SPSS軟件進(jìn)行分析得出。所需的樣品濃度越低,表明抗氧化效果越好[11]。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所得數(shù)據(jù)為3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值,用Origin繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑提取物的DPPH·清除能力分析

不同溶劑提取物的DPPH·清除率見(jiàn)圖1。從圖1可以看出,在質(zhì)量濃度為2～10 g/L時(shí),VC對(duì)照組對(duì)DPPH·清除能力明顯遠(yuǎn)高于石榴籽提取物的清除能力,清除率保持在90%左右,此結(jié)果與汪洪濤[28]的結(jié)果相似；而當(dāng)質(zhì)量濃度為5 g/L時(shí),石榴籽醇提物與水提物的DPPH·清除能力分別為40%與20%,汪洪濤[28]得出的DPPH·清除能力都低于20%,其原因是微切助互作技術(shù)有效地破碎了石榴籽細(xì)胞壁,促進(jìn)了抗氧化活性成分的暴露與釋放,增大了與提取溶劑的接觸面積,提高了抗氧化活性成分的溶出率[29-30]。在2～10 g/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),石榴籽醇提物對(duì)DPPH·清除能力明顯強(qiáng)于石榴籽水提物,并且二者隨著質(zhì)量濃度的增加,DPPH·清除能力逐漸增加。

圖1 不同溶劑提取物和VC對(duì)DPPH·清除作用

2.2 不同溶劑提取物的·OH清除能力分析

不同溶劑提取物的·OH清除率見(jiàn)圖2。由圖2可知,VC、石榴籽醇提物和水提物對(duì)·OH都有一定的清除能力,其清除率隨質(zhì)量濃度的增加逐步增大,但是VC對(duì)·OH清除能力明顯比石榴籽醇提物和水提物的強(qiáng)；在2～10 g/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),石榴籽醇提物對(duì)·OH清除率略高于石榴籽水提物的清除率。

圖2 不同溶劑提取物和VC對(duì)·OH清除作用

2.3 不同溶劑提取物的清除能力分析

圖3 不同溶劑提取物和VC對(duì)清除作用

2.4 不同溶劑提取物的抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力分析

不同溶劑提取物的抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力見(jiàn)圖4。由圖4可得,在2～10 g/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),隨著VC、石榴籽醇提物和水提物質(zhì)量濃度的增加,抑制率隨之增加,石榴籽醇提物的LPO抑制率明顯比VC以及石榴籽水提物的高,其抑制率可達(dá)80.62%；石榴籽水提物與VC的LPO抑制率相差不大,其抑制率范圍分別為24.86%～69.83%和20.79%～64.61%。

圖4 不同溶劑提取物和VC對(duì)LPO的抑制作用

2.5 不同溶劑提取物的抗氧化能力比較

根據(jù)“相似相溶”原理,提取液中的活性成分物質(zhì)與提取溶劑有直接關(guān)系[31]。由表1可以看出,石榴籽醇提物的抗氧化活性整體高于石榴籽水提物,出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是蒸餾水的極性比95%乙醇的極性強(qiáng),與水提相比,在95%乙醇中石榴籽中抗氧化活性成分更容易被提取出來(lái)。

表1 石榴籽醇提物、石榴籽水提物和VC的抗氧化活性的比較

3 結(jié)果