林瑜，王兵，韋銘敏，劉雯，覃潔萍*

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧530001; 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西南寧530023)

多西環(huán)素屬于第二代半合成的四環(huán)素衍生物，對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、螺旋體、立克次體、支原體、衣原體等均產(chǎn)生抑制作用，為廣譜抗生素，具有口服生物利用度高、脂溶性高、對組織滲透力強(qiáng)、分布廣泛等特點(diǎn)，廣泛用于人和動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療[1]。據(jù)目前統(tǒng)計(jì)，多西環(huán)素含量測定的方法有高效液相色譜法[2-6]、熒光法[7-10]、紫外分光光度法[11-12]、電化學(xué)法[13-15]等。這些方法中，雖各有優(yōu)點(diǎn)，但也存在一些缺點(diǎn)，如有些儀器昂貴，對實(shí)驗(yàn)人員的操作技術(shù)要求高；有些專屬性不強(qiáng)；有些靈敏度低；有些需要用到有毒的有機(jī)試劑等。

由于多西環(huán)素性質(zhì)不穩(wěn)定，見光易分解，因此對照品和樣品溶液都要現(xiàn)配現(xiàn)用，且操作速度要快，給直接UV-Vis法的準(zhǔn)確測定帶來了一些困擾。又因多西環(huán)素分子結(jié)構(gòu)中含有羥基和氨基，這兩個(gè)基團(tuán)中的O和N都含有孤對電子，在適宜條件下可與金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，形成性質(zhì)穩(wěn)定的六元環(huán)配合物，故可通過間接UV-Vis法對其含量進(jìn)行測定。

本文研究發(fā)現(xiàn)：在pH=5.0醋酸—醋酸鈉緩沖溶液介質(zhì)下，多西環(huán)素能與Al3+反應(yīng)生成在392 nm處有靈敏特征吸收的絡(luò)合物，且絡(luò)合物的吸收強(qiáng)度隨多西環(huán)素濃度增大而增大，具有良好的線性關(guān)系。據(jù)此建立了一種簡單、快速、準(zhǔn)確、成本低、精密度和靈敏度俱佳的利用紫外分光光度法測定多西環(huán)素含量的新方法，將該方法用于實(shí)際多西環(huán)素樣品的測定，結(jié)果令人滿意，且目前尚未見有報(bào)道。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UV-1780型紫外可見分光光度計(jì)(島津儀器(蘇州)有限公司)，HWS-26型電熱恒溫水浴鍋(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)，KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)。

多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，批號：130485-201703，含量：84.7 %)，鹽酸多西環(huán)素片(廣東先強(qiáng)藥業(yè)有限公司，規(guī)格：0.1 g/片)，鹽酸多西環(huán)素片(廣東臺城制藥股份有限公司，規(guī)格：0.1 g/片)，鹽酸多西環(huán)素片(廣東臺城制藥股份有限公司，規(guī)格：0.05 g/片)，其他試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取含量為84.70 %的多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品0.236 1 g于已干燥的小燒杯中，加適量蒸餾水?dāng)嚢枇钇淙芙?，而后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容到刻度并搖勻，得4.50×10-3mol/L多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用時(shí)精密移取10.00 mL到100 mL容量瓶定容稀釋至4.50×10-4mol/L。

Al3+溶液：準(zhǔn)確稱取0.333 2 g十八水硫酸鋁于干燥小燒杯中，加適量蒸餾水等其溶解后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容到刻度并搖勻，得1.00×10-2mol/L的Al3+溶液備用，實(shí)驗(yàn)時(shí)再精密移取4.50 mL至100 mL容量瓶定容，稀釋至4.50×10-4mol/L。

1.3 樣品溶液的處理

取3種市場銷售的鹽酸多西環(huán)素片各20片，分別準(zhǔn)確稱量后研成粉末。再分別稱取相當(dāng)于含多西環(huán)素0.444 4 g的藥粉于干燥燒杯中，加少量蒸餾水超聲處理，待溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，過濾后準(zhǔn)確移取2.00 mL續(xù)濾液100 mL容量瓶定容，得2.00×10-4mol/L樣品溶液。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

依次移取一定量4.50×10-4mol/L多西環(huán)素溶液、1.50 mL 4.50×10-4mol/L Al3+溶液、1.00 mL pH=5.0醋酸—醋酸鈉緩沖溶液于10 mL容量瓶中，用蒸餾水定容搖勻，于50 ℃下水浴10 min，冷卻至室溫后，以試劑空白作為參比，用紫外—可見分光光度計(jì)在392 nm處測定溶液的吸光度A。

2 結(jié)果與討論

2.1 金屬離子的篩選

按“1.4節(jié)”實(shí)驗(yàn)方法，考察Al3+、Ni2+、Mn2+、Co2+、Mg2+等金屬離子與等量相同濃度的多西環(huán)素的絡(luò)合效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Ni2+、Co2+與多西環(huán)素的混合液并沒有生成新的吸收峰，Mn2+、Mg2+與多西環(huán)素的混合液吸收強(qiáng)度小，且峰型不好，而Al3+與多西環(huán)素的混合液有新的特征吸收峰出現(xiàn)，并且在392 nm處有最大吸收，峰型好，故本實(shí)驗(yàn)選擇用鋁離子與多西環(huán)素絡(luò)合開展進(jìn)一步的研究。

2.2 不同溶液的吸收光譜光譜

以蒸餾水為參比空白，用紫外—可見分光光度計(jì)在200～500 nm處分別掃描不同的溶液，其結(jié)果見圖1。由圖1可見：曲線a為多西環(huán)素的吸收情況，分別在λ1=274 nm和λ2=346 nm有特征吸收峰；曲線b為在緩沖介質(zhì)下，多西環(huán)素的吸收情況，兩個(gè)特征峰的位置與峰型的變化不大，幾乎與曲線a重疊；曲線c為在緩沖介質(zhì)下，Al3+與多西環(huán)素混合液的吸收情況，混合液的λ2紅移到了392 nm處，產(chǎn)生了新的特征吸收峰；曲線d、e并沒有明顯的吸收，說明不管是否添加緩沖介質(zhì)，Al3+在250～450 nm處均無明顯的光譜吸收定。

圖1 不同溶液的吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectra of the different solutions

a. 4.50×10-5mol/L多西環(huán)素;b. 4.50×10-5mol/L多西環(huán)素+醋酸-醋酸鈉緩沖溶液;c. 4.50×10-5mol/L多西環(huán)素+4.5×10-5mol/L Al3++醋酸-醋酸鈉緩沖溶液;d. 4.50×10-5mol/L Al3+;e. 4.50×10-5mol/L Al3++醋酸-醋酸鈉緩沖溶液

2.3 酸堿度的優(yōu)化

分別移取1.00 mL 4.50×10-4mol/L Al3+溶液、1.00 mL 4.50×10-4mol/L多西環(huán)素溶液至10 mL比色管中，平行配制多份，再分別用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液和鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值，充分反應(yīng)后測定。結(jié)果顯示：當(dāng)pH≤5.0時(shí)，Al3+-多西環(huán)素配合物的吸光度最大且穩(wěn)定；當(dāng)pH>5.0時(shí)，隨著堿性增大，吸光度逐漸下降，可能部分的Al3+與氫氧化鈉反應(yīng)形成氫氧化鋁被消耗，導(dǎo)致與多西環(huán)素形成配合物的Al3+減少，使配合物的濃度減少。因此選用pH=5.0的醋酸—醋酸鈉緩沖溶液來調(diào)節(jié)溶液的酸堿度。

當(dāng)V緩沖≤1.00 mL時(shí)，隨著緩沖液用量增多，Al3+-多西環(huán)素配合物的A稍微有所下降，但變化不大；當(dāng)V緩沖>1.00 mL時(shí)，隨著緩沖液用量增多，A下降的程度逐漸增大。為了保證緩沖溶液足夠的緩沖能力，故選擇V緩沖為1.00 mL。

2.4 反應(yīng)溫度的影響

分別移取1.00 mL 4.50×10-4mol/L多西環(huán)素溶液、1.00 mL 4.50×10-4mol/L Al3+溶液、1.00 mL醋酸—醋酸鈉緩沖溶液于10 mL比色管中，在不同溫度下恒溫水浴加熱10 min，考察溫度對多西環(huán)素與Al3+絡(luò)合反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示：當(dāng)T<50 ℃時(shí)，絡(luò)合物的吸光度A隨著溫度的升高而逐漸增大；當(dāng)T=50 ℃時(shí)，A最大且穩(wěn)定；當(dāng)T>50 ℃時(shí)，A隨著溫度的升高而降低，部分配合物可能發(fā)生了分解。故選擇在50 ℃下進(jìn)行水浴。

2.5 加熱時(shí)間的優(yōu)化

固定其他條件不變，考察不同的加熱時(shí)間對多西環(huán)素與Al3+絡(luò)合反應(yīng)的影響。按“1.4節(jié)”實(shí)驗(yàn)方法測定得到：當(dāng)t加熱≤20 min時(shí)，絡(luò)合物的吸光度A最大且穩(wěn)定；當(dāng)t加熱>20 min時(shí)，A隨加熱時(shí)間的增大而減小，絡(luò)合物越可能發(fā)生了分解。故選擇加熱時(shí)間為10 min。

2.6 試劑加入順序的優(yōu)化

在優(yōu)化的條件下，固定試劑用量，改變試劑的加入順序：①多西環(huán)素溶液、Al3+溶液、pH=5.0醋酸—醋酸鈉緩沖溶液；②多西環(huán)素溶液、pH=5.0醋酸—醋酸鈉緩沖溶液、Al3+溶液；③Al3+溶液、pH=5.0醋酸—醋酸鈉緩沖溶液、多西環(huán)素溶液。按“1.4節(jié)”實(shí)驗(yàn)方法測定Al3+-多西環(huán)素配合物的A值，結(jié)果得到：①>②>③。因此，最佳的試劑加入順序?yàn)槎辔鳝h(huán)素溶液、Al3+溶液、pH=5.0醋酸—醋酸鈉緩沖溶液。

2.7 干擾試驗(yàn)

由于鹽酸多西環(huán)素片中含有各種片劑輔料，如硬脂酸鎂、微晶纖維素、糖精鈉、乳糖等，這些輔料有可能對此次實(shí)驗(yàn)的測定產(chǎn)生干擾，因此有必要考察這些共存物質(zhì)對含量測定的干擾情況。在優(yōu)化好實(shí)驗(yàn)條件的情況下，對4.50×10-4mol/L多西環(huán)素溶液進(jìn)行測定，以共存物加入前后對實(shí)驗(yàn)影響的相對誤差不大于±5 %計(jì)算得到：乳糖、糖精鈉對絡(luò)合反應(yīng)的干擾較小；硬脂酸鎂、微晶纖維素二者的干擾相對較大，但硬脂酸鎂與微晶纖維素不溶于水，故配制溶液時(shí)可通過過濾將其除擾。

2.8 絡(luò)合物配位比的探索及其反應(yīng)機(jī)理

本實(shí)驗(yàn)采用摩爾比法測定多西環(huán)素與Al3+在pH=5.0醋酸—醋酸鈉緩沖溶液介質(zhì)下反應(yīng)生成的絡(luò)合物的組成比，固定移取1.50 mL 4.50×10-4mol/L Al3+溶液，改變相同濃度的多西環(huán)素溶液的用量，按照“1.4節(jié)”實(shí)驗(yàn)方法，測定各組溶液的吸光度A，得到結(jié)果如圖2所示。

圖2 絡(luò)合物中多西環(huán)素與Al3+的配比Fig.2 Ratio between doxycycline and Al3+ in complex

多西環(huán)素分子結(jié)構(gòu)中含有羥基和氨基(圖3)，這兩個(gè)基團(tuán)中的O和N都含有孤對電子，可在一定條件下與Al3+發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，生成穩(wěn)定的六元環(huán)配合物，Al3+-多西環(huán)素配合物的結(jié)構(gòu)如圖4所示。

圖3 多西環(huán)素結(jié)構(gòu)式Fig.3 Struction of doxycycline

圖4 Al3+-多西環(huán)素絡(luò)合物結(jié)構(gòu)式Fig.4 Complex struction of doxycycline with Al3+

2.9 線性關(guān)系的考察

固定其他溶液的加入量，加入不同體積的多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液，以試劑空白為參比，按“1.4節(jié)”測定得到圖5。結(jié)果顯示：Al3+-多西環(huán)素配合物的吸光度A隨多西環(huán)素溶液濃度C的增加而升高，且呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，在7.50～22.50 μg/mL內(nèi)，A=0.031 6C+0.011 9，r=0.999 7，檢出限為1.8 μg/mL，RSD為0.24 %。

圖5 不同濃度的多西環(huán)素溶液與Al3+絡(luò)合的吸收光譜Fig.5 Absorption spectra of the complex between the different concentrations of doxycycline and Al3+1. Cdoxycycline=7.50 μg/mL; 2. Cdoxycycline=11.25 μg/mL; 3. Cdoxycycline=15.00 μg/mL; 4. Cdoxycycline=18.75 μg/mL; 5. Cdoxycycline=22.50 μg/mL;

2.10 樣品的測定

分別取“1.3節(jié)”的3種樣品溶液各1.00 mL于10 mL容量瓶中，加入1.50 mL 4.50×10-4mol/L Al3+溶液、1.00 mL pH=5.0醋酸—醋酸鈉緩沖溶液，按照“1.4節(jié)”操作，測得各樣品溶液吸光度，然后利用線性回歸方程，計(jì)算出樣品中多西環(huán)素的含量，結(jié)果見表1。

表1 多西環(huán)素樣品的含量測定Tab.1 Determination of content fordoxycycline samples n=3

另外，分別在10 mL容量瓶中準(zhǔn)確加入“1.3節(jié)”配制的3種樣品溶液1.00 mL，然后分別加入相當(dāng)于樣品含量80 %、100 %、120 %的多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液(n=3)，再加入1.50 mL 4.50×10-4mol/L Al3+溶液、1.00 mL pH=5.00醋酸—醋酸鈉緩沖溶液，按“1.4節(jié)”操作，測定絡(luò)合物的吸光度，計(jì)算方法的加標(biāo)回收率，測定結(jié)果如表2所示。加樣回收率在101.2 %～104.9 %。RSD為0.63 %～1.2%，說明該方法準(zhǔn)確可靠。

表2 加樣回收實(shí)驗(yàn)Tab.2 Additive sample recovery experiment n=3

3 結(jié)論

由于多西環(huán)素性質(zhì)不穩(wěn)定，見光易分解，給直接UV-Vis法的準(zhǔn)確測定帶來了一些困擾。利用在酸性條件下，多西環(huán)素可與Al3+按1∶1反應(yīng)生產(chǎn)配合物的特點(diǎn)，本文建立了一種間接UV-Vis法對多西環(huán)素的含量進(jìn)行測定。Al3+-多西環(huán)素配合物的性質(zhì)穩(wěn)定，且測定配合物的靈敏度比多西環(huán)素本身要高，該方法線性范圍寬、檢出限低、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性高，而且環(huán)保無毒，可有效地作用于實(shí)際樣品的含量測定。