慢病毒介導核心結(jié)合因子α1基因感染對人牙齦成纖維細胞成骨特性的影響

陳曉霞，顏世果，孫欽峰，李玉蘭

牙周組織再生是牙周領(lǐng)域研究的熱點，為尋找安全有效的生長因子和種子細胞是多年來研究者們共同奮斗的目標。核心結(jié)合因子α1(core binding factor α1，cbfα1)是成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子和成骨細胞分化的關(guān)鍵因子。研究發(fā)現(xiàn)cbfα1過表達可以誘導非成骨型細胞表達成骨相關(guān)基因[1-2]。說明cbfα1在組織成骨方面起著重要作用。人牙齦成纖維細胞(human gingival fibroblasts, hGFs)在某些因子的誘導下也可表現(xiàn)出一定成骨特性。而cbfα1是否也能夠在一定程度上誘導hGFs成骨，還鮮有研究報道。本實驗用慢病毒作為載體將cbfα1轉(zhuǎn)染人牙齦成纖維細胞觀察其成骨表型轉(zhuǎn)化的可能性，以期為牙周組織再生尋找理想的生長因子和種子細胞奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

慢病毒體系pLenti6.3-Ires-EGFP (pL-E)及包裝質(zhì)粒Mix 購于美國Invitrogen，pCMV5-cbfα1、熒光定量PCR試劑盒由山東省口腔生物醫(yī)學實驗室提供，POLOdelivererTM3000 Transfection Reagent 購于上海銳賽公司，Polybrene 購于上海Sigma公司，cbfα1/Runx2單克隆抗體購于上海abcam公司，辣根過氧化酶標記山羊抗兔IgG、辣根過氧化酶標記山羊抗鼠IgG、兔/鼠SP檢測試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser 購于大連寶生物有限公司、ROCHE LightCycler 480Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR儀購于德國ROCHE。

1.2 方法

1.2.1 重組慢病毒構(gòu)建及包裝 以質(zhì)粒pCMV5-cbfα1為模板設計引物，并在目的基因上下游分別添加酶切位點PacI和AscI，引物設計見表1，通過PCR擴增目的基因,將目的基因PCR產(chǎn)物和慢病毒載體pLenti6.3-Ires-EGFP 進行雙酶切,并回收所需酶切片段，利用T4 DNA ligase連接,置4 ℃冰箱過夜，次日轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)板上，培養(yǎng)過夜，第2天挑取單菌落進行菌落PCR鑒定，將PCR鑒定呈陽性的克隆接到LB液體培養(yǎng)基中搖菌過夜，次日提取質(zhì)粒，進行酶切鑒定。最后將酶切鑒定呈陽性的克隆送測序。將構(gòu)建成功的pLenti6.3-cbfα1-Ires-EGFP (pL-cbfα1)及空載體pLenti6.3-Ires-EGFP (pL-E) 大量提取質(zhì)粒，分別與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞進行病毒包裝，收集病毒液，采用熒光法測定病毒濃度。計算滴度公式如下：感染形成單位=(平均陽性細胞數(shù)/視野)×(視野數(shù)/孔)÷病毒體積(mL)÷稀釋倍數(shù)。

表1 PCR引物設計

1.2.2 細胞培養(yǎng) 人牙齦成纖維細胞取自年輕患者(18～30歲)因手術(shù)切除的健康牙齦組織，經(jīng)過傳代培養(yǎng)，取3～6代細胞用于實驗。

1.2.3 慢病毒感染hGFs 將狀態(tài)良好的hGFs細胞消化制成細胞懸液，以密度1×105個/孔接種到六孔板中，次日換液，根據(jù)查閱文獻及MOI值測定結(jié)果，以MOI=50加入慢病毒pL-cbfα1、pL-E及polybrene(終濃度5 mg/L)，感染24 h后，更換新鮮培養(yǎng)液，72 h后觀察各組細胞狀態(tài)及綠色熒光的表達情況。

1.2.4 hGFs外源基因cbfα1 mRNA表達 慢病毒pL-cbfα1、pL-E轉(zhuǎn)染hGFs 72 h后，Trizol法提取細胞mRNA，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將各組轉(zhuǎn)化成cDNA，采用熒光定量PCR檢測細胞外源基因cbfα1 mRNA表達。引物設計見表2。

表2 實時熒光定量PCR引物

1.2.4 細胞免疫組化 慢病毒感染hGFs 72 h后，用預冷的95%乙醇固定，以正常細胞作對照，用3%H2O2室溫孵育30 min，0.01%PBS洗滌3次，0.3% TritonX-100室溫通透30 min，0.01%PBS洗滌3次，用5%～10%正常山羊血清封閉10 min，再滴加1∶200 cbfα1抗體稀釋液，37 ℃孵育3 h，滴加生物素標記二抗(山羊抗兔，山羊抗鼠)，室溫孵育2 h，0.01%PBS洗滌3次，滴加適量辣根酶標記鏈霉卵白素，室溫孵育15 min，0.01%PBS洗滌3次，DAB顯色劑避光顯色，復染，脫水，透明，封片。

1.2.5 hGFs骨相關(guān)基因的表達 慢病毒pL-cbfα1、pL-E感染hGFs，72 h后提取細胞mRNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用熒光定量PCR法進行成骨相關(guān)基因Bsp、Opn、ColⅠ、OC檢測。按照熒光定量PCR試劑盒說明書配制各反應體系，引物設計見表3。

表3 實時熒光定量PCR引物

1.3 統(tǒng)計學方法

以上各組實驗至少重復3次，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和t檢驗，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤來表示，P<0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 慢病毒構(gòu)建及包裝

慢病毒pLenti6.3-cbfα1-Ires-EGFP 經(jīng)酶切及測序檢驗其構(gòu)建成功(圖1～2)，通過293T細胞包裝病毒并收集病毒液。采用熒光法檢測病毒滴度(圖3)，按照公式計算pL-cbfα1的滴度為：(13×183)÷(0.1×10-3)=2.3×107ifu/mL，陰性對照pL-E滴度為：1×108ifu/mL。

泳道1：Marker 15000(從上至下分別為15 000，10 000,7 500,5 000,2 500，1 000,750,500,250 bp)；泳道2～3：PacI和AscI酶對重組載體進行雙酶切(目的條帶：9 100 bp + 1 587 bp)

圖2 cbfα1測序圖

圖3 pL-cbfα1感染293T細胞

2.2 重組慢病毒感染hGFs

慢病毒pL-cbfα1及pL-E感染hGFs，72 h后可以觀察到大量的綠色熒光蛋白，轉(zhuǎn)染效率為70%～80%，而細胞死亡率約10%左右，但轉(zhuǎn)染后的慢病毒空載體組和正常細胞組在細胞形態(tài)和生長狀態(tài)方面未發(fā)現(xiàn)明顯差異，結(jié)果如圖4、5、6。

圖4 pL-cbfα1轉(zhuǎn)染hGFs

圖5 pL-EGFP轉(zhuǎn)染hGFs

圖6 正常hGFs

2.3 外源基因cbfα1 mRNA表達

pL-cbfα1感染hGFs后，采用熒光定量PCR法檢測，發(fā)現(xiàn)感染后的hGFs有cbfα1的過表達。實驗組cbfα1的表達量增加7.4倍(P<0.05)，而空載體組和正常組相比無明顯差異(P>0.05)(圖7)。

*： vs. hGFs組和pL-E, P<0.05

2.4 細胞免疫染色

實驗組的hGFs經(jīng)抗cbfα1染色顯示：被感染的細胞核中可見棕褐色顆粒沉著，呈陽性表達，而未感染的正常細胞及空白載體組中呈陰性表達(圖8)。

A:慢病毒pL-cbfα1感染細胞cbfα1陽性染色( ×400);B: 慢病毒pL-E感染細胞cbfα1陰性染色( ×400);C: 正常hGFs中cbfα1陰性染色( ×400)

2.5 成骨相關(guān)基因的表達

實驗組的hGFs可以檢測到成骨相關(guān)基因骨涎蛋白(Bsp)、骨橋蛋白(Opn)、Ⅰ型膠原(ColⅠ)、骨鈣蛋白(OC)的表達。而且實驗組各成骨相關(guān)基因的表達明顯高于正常對照組和空載體組(P<0.05)。對空載體組和正常對照組各成骨相關(guān)基因的表達數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，其結(jié)果顯示無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明空載體組對成骨相關(guān)基因的表達無影響。見圖9。

*：vs. hGFs和pL-E，P<0.05

3 討 論

在誘導種子細胞成骨方面，國內(nèi)外對骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP2)的研究是最多的，因為它是BMP家族成員中活性最強，也是唯一能單獨誘導成骨的因子，并且在牙周組織再生和修復中發(fā)揮重要作用[3-4]。而cbfα1是成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子，它通過調(diào)控多種礦化相關(guān)蛋白，啟動并促進成骨細胞分化，對成骨細胞早期分化起決定作用[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)cbfα1-/-基因敲除小鼠表現(xiàn)為膜內(nèi)骨及軟骨內(nèi)鈣化的完全缺失，即使在BMP2的作用下，小鼠骨髓基質(zhì)細胞在體內(nèi)外均不能誘導為成骨細胞[8]，說明cbfα1較BMPs有更直接的促進成骨作用。Takeuchi 等[9]對8周齡雄性Wistar大鼠左上頜第一磨牙行牙髓切斷術(shù)后覆蓋三氧化物凝聚體(MTA)，在術(shù)后第5天發(fā)現(xiàn)大部分牙髓組織的細胞核中可以檢測到cbfα1,說明cbfα1可能參與牙髓組織修復性牙本質(zhì)的形成。有研究還發(fā)現(xiàn)cbfα1在牙囊和牙乳頭中也都有表達而且隨著牙齒的進一步發(fā)育和牙根、牙周組織的形成，cbfα1的表達更為明顯[10]，這說明cbfα1可能參與牙周組織的發(fā)育。尚淑賢等[11]研究發(fā)現(xiàn)在小鼠牙胚鐘狀期牙囊細胞質(zhì)中cbfα1只有mRNA的表達，而未見蛋白的表達。而且cbfα1蛋白在前期牙本質(zhì)和牙槽骨中有表達，但在成牙本質(zhì)細胞、成釉細胞和牙本質(zhì)中，cbfα1 mRNA和蛋白均未見表達，由此推斷cbfα1是牙齒發(fā)育所必須的轉(zhuǎn)錄因子[12]。因此我們選擇cbfα1作為研究因子，以期其在牙周組織再生方面有進一步的研究。

牙齦成纖維細胞作為牙周組織的組成成分，其來源豐富、容易獲得、具有很強的生長和自我繁殖能力，在適當?shù)拇碳は驴梢员磉_成骨細胞表型[13]，也因此牙齦成纖維細胞越來越受研究者們的關(guān)注。董廣英等[14]研究發(fā)現(xiàn)hBMP2基因轉(zhuǎn)染的人牙齦成纖維細胞，能夠表達hBMP2的相關(guān)分子，并具有成骨細胞活性。而對細胞的增殖特性無明顯影響。儲慶等[15]通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)正常牙齦成纖維細胞不表達Bsp,其Opn的表達也低于牙周膜成纖維細胞，而通過轉(zhuǎn)染人轉(zhuǎn)化生長因子β1基因(TGF-β1)可提高細胞Bsp、Opn和OC的表達。說明牙齦成纖維細胞在相關(guān)因子的刺激下有一定的成骨表型。

本實驗設計采用慢病毒作為載體是因為考慮到它對于分裂和非分裂細胞均具有感染能力，尤其對一些較難轉(zhuǎn)染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化細胞等，能大大提高目的基因轉(zhuǎn)染效率[16]，又很少引發(fā)免疫反應，而且經(jīng)過構(gòu)建后的慢病毒載體可以攜帶大約5 kbp，甚至更長的目的基因，當然隨著目的基因長度的增加，其病毒滴度也隨之下降[17-22],這在本實驗中也得到證實。

我們在之前的實驗中發(fā)現(xiàn)人牙齦成纖維細胞中cbfα1在mRNA水平上有表達，而在蛋白水平上無表達[23]，提示cbfα1對牙齦成纖維細胞的分化可能具有一定的調(diào)控潛能。本次實驗將外源性基因cbfα1轉(zhuǎn)染到hGFs后，采用熒光定量PCR檢測到cbfα1 mRNA的表達比未感染組增強了7.4倍(P<0.05)，通過免疫細胞化學染色發(fā)現(xiàn)被感染的細胞胞核中有棕色顆粒沉著，呈陽性表達，說明慢病毒介導的外源基因cbfα1能夠成功感染hGFs并表達相應基因。由于cbfα1刺激成骨特異性基因表達是通過和骨特異性順式作用元件2(OSE2)結(jié)合來實現(xiàn)的，而多種成骨細胞相關(guān)基因的啟動子區(qū)存在OSE2，如OC、ColⅠ、Bsp、Opn等[24]。我們通過實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后的hGFs成骨相關(guān)因子Bsp、Opn、OC及ColⅠ的表達，結(jié)果顯示各成骨相關(guān)因子均有不同程度增強。說明人牙齦成纖維細胞在外源基因cbfα1的誘導下也可以表現(xiàn)出一定的成骨能力。但是我們看到代表成骨細胞晚期的表達標志物OC的表達量較少，這可能是由于cbfα1只在成骨細胞分化的早期起作用[25]的緣故。因為在之前的研究中能發(fā)現(xiàn)cbfα1可上調(diào)不成熟成牙本質(zhì)細胞中牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP)的表達，同時還可下調(diào)成熟成牙本質(zhì)細胞中DSPP的表達[26]。而過表達cbfα1能顯著增強成牙骨質(zhì)細胞分化的早期標記基因的表達[27]。并且可以促進牙乳頭細胞向成牙本質(zhì)細胞分化，但卻抑制成牙本質(zhì)細胞的最終分化成熟[28]。說明cbfα1在牙齒發(fā)育過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用。我們推測如果用cbfα1基因轉(zhuǎn)移到因牙周炎而導致牙槽骨缺損的部位，或許可以誘導其周圍牙齦成纖維細胞表型發(fā)生改變，從而實現(xiàn)牙周組織的再生，這將是我們研究的方向，本實驗為進一步研究該基因在牙周組織再生工程中的作用奠定了基礎(chǔ)。