肝細胞生長因子對成骨細胞增殖、凋亡及成骨分化的影響

李若涵，佘文婷，華 超，駱 瑜，黃 麗，彭友儉

外傷、腫瘤、炎癥等可能會導致大面積的骨組織缺損，為臨床修復帶來巨大挑戰(zhàn)，缺損的組織修復成為了亟待解決的難題[1]。目前臨床常用的傳統(tǒng)骨修復方法效果通常不甚理想，常規(guī)治療后仍有5%～10%的患者骨缺損不能正常愈合[2]。近年來，干細胞移植和生長因子改性的骨修復材料的出現(xiàn)在極大程度上解決了骨組織再生效果不良的問題。但骨修復材料的研究與應用目前尚處于起步階段，仍需要開展大量相關(guān)的基礎研究，為生物材料的研發(fā)奠定基礎。

肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)作為能刺激肝細胞增殖的物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，是一種來源于間葉組織的細胞外信號分子，由間充質(zhì)細胞分泌，參與上皮-間充質(zhì)相互作用[3]。HGF具有強大的促有絲分裂效應，通過自分泌和旁分泌作用促進肝臟、心臟和肌肉的營養(yǎng)吸收和利用，并促進組織修復[4-6]。骨的愈合過程(包括血管形成、炎癥抑制和間充質(zhì)細胞進入等)由細胞外信號分子介導[7]。血小板衍生生長因子、成纖維細胞生長因子和血管內(nèi)皮生長因子等多種細胞外信號分子均可以促進骨折愈合和骨再生[8]。然而，HGF在骨組織生長發(fā)育過程中的調(diào)控作用尚未探明。因此，本研究擬通過在小鼠成骨細胞前體細胞系(MC3T3-E1)中外源加入HGF以探索HGF對MC3T3-E1細胞增殖、凋亡以及成骨分化和礦化能力的影響，旨在為HGF在骨組織工程領域的應用提供理論依據(jù)，并為新型骨生物材料的研發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

CO2培養(yǎng)箱(Thermo,美國)；離心機(Eppendorf,德國)；PCR儀(Biorad,美國)；HGF(Peprotech，美國)；細胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8, CCK-8)(Dojindo,日本)；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天，上海)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，RT-PCR試劑盒(Takara，日本)；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Runt-related transcription factor 2，Runx2)、成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(osterix，OSX)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH)抗體(ABCAM，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將MC3T3-E1細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，2 d換液，3～4 d傳代，待細胞進入對數(shù)生長期后進行實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測 將MC3T3-E1細胞分為3組，每組設置5個復孔。對照組加入生理鹽水，其他兩組加入HGF溶液至終濃度分別為10 ng/mL、25 ng/mL。培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后在避光處加入配制好的CCK-8液，37 ℃孵育2 h，450 nm檢測其OD值。

1.2.3 TUNEL法檢測 細胞分組及處理如上。培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，加入0.3% Triton X-100的PBS,室溫孵育5 min。加入50 μL TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育60 min。用抗熒光淬滅液封片，在熒光顯微鏡下觀察。隨機選取5個視野，以凋亡細胞數(shù)與總細胞數(shù)的比值作為細胞的凋亡率。

1.2.4 堿性磷酸酶(ALP)和茜素紅染色 將MC3T3-E1細胞分為對照組和實驗組(HGF：25 ng/mL)，成骨誘導培養(yǎng)基(含10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10 nmol/L地塞米松、0.2 mmol/L維生素C)培養(yǎng)7 d后，按照說明進行ALP染色；成骨誘導14 d后，4%多聚甲醛固定1 h,現(xiàn)配的1%茜素紅染液孵育30 min，自然干燥，觀察拍照。

1.2.5 PCR檢測 對照組和實驗組的細胞在成骨誘導7 d后，Trizol法提取總RNA。按照說明書將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應條件為：42 ℃，15 min，共3個循環(huán)，85 ℃，5 s。應用RT-PCR試劑盒檢測成骨相關(guān)基因的mRNA水平，包括ALP、Runx2、OCN、OSX，引物序列見表1。PCR反應條件：預變性：95 ℃，2 min；PCR反應：95 ℃變性15 s，60 ℃退火+延伸60 s，共40個循環(huán)；繪制熔解曲線：95 ℃，5 s。以GAPDH為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

表1 實時熒光定量聚合酶鏈反應目的基因的引物序列

1.2.6 Western Blot檢測 對照組和實驗組的細胞在成骨誘導7 d后，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，離心后收集上清液。利用BCA法檢測蛋白濃度，并將相同量的蛋白加入PAGE凝膠進行電泳分離，濕轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，牛奶室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫搖床孵育2 h，底物化學發(fā)光ECL顯色，凝膠成像儀曝光后進行圖像分析。采用GAPDH作為內(nèi)參，檢測ALP、Runx2、OCN、OSX的表達情況，每組重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 HGF對MC3T3-E1細胞增殖能力的影響

培養(yǎng)24 h時，10 ng/mL和25 ng/mL的HGF組與對照組的OD值無統(tǒng)計學差異。培養(yǎng)48 h時，高濃度組的OD值較對照組明顯升高，提示細胞增殖能力的增強。培養(yǎng)72 h時，10 ng/mL組與25 ng/mL組的OD值與對照組比較差異具有顯著性(P<0.05)，說明10 ng/mL和25 ng/mL的HGF均明顯促進了成骨細胞的增殖(表2)。

表2 肝細胞生長因子對MC3T3-E1細胞增殖活性的影響(OD值)

2.2 HGF對MC3T3-E1細胞凋亡的影響

培養(yǎng)24 h和48 h時，10 ng/mL組細胞的凋亡率與對照組無統(tǒng)計學差異，而在72 h時，10 ng/mL組明顯低于對照組(7.67%vs. 10.05%，P<0.05)。25 ng/mL組細胞的凋亡率在24 h、48 h及72 h均低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表3)。

表3 肝細胞生長因子對MC3T3-E1細胞凋亡率的影響

2.3 HGF對MC3T3-E1細胞礦化能力的影響

在對MC3T3-E1細胞進行成骨誘導7 d后，ALP染色可見細胞質(zhì)呈紫色，實驗組的染色明顯深于對照組。細胞成骨誘導14 d后，茜素紅染色顯示紅色鈣結(jié)節(jié)形成，實驗組鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量與顏色均高于對照組(圖1)。

A、C：對照組ALP和茜素紅染色結(jié)果；B、D：實驗組ALP和茜素紅染色結(jié)果

2.4 HGF對成骨相關(guān)因子mRNA和蛋白表達水平的影響

相較于對照組，實驗組細胞中成骨相關(guān)因子ALP、Runx2、OCN、OSX的mRNA表達水平顯著升高，相對表達量分別為1.78±0.17、3.49±0.26、1.60±0.04和1.82±0.17，以上差異較對照組均具有統(tǒng)計學意義(圖2)。Western Blot結(jié)果顯示，HGF也明顯促進了成骨相關(guān)因子ALP、Runx2、OCN、OSX的蛋白表達(圖3)。這些結(jié)果表明，HGF可促進MC3T3-E1細胞的成骨向分化。

與對照組比較，**：P<0.001

圖3 MC3T3-E1細胞成骨相關(guān)蛋白的表達水平

3 討 論

成骨細胞作為骨形成的主要功能細胞，參與骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化，從而調(diào)節(jié)骨形成和重建[9]。MC3T3-E1細胞具有高水平的成骨細胞分化特性，經(jīng)誘導后形成礦化良好的細胞外基質(zhì)，特異性表達成骨相關(guān)因子，可作為成骨細胞來進行研究[10]。因此，本研究應用MC3T3-E1細胞探究HGF對成骨細胞增殖、凋亡和成骨分化的影響。

HGF的生物學作用包括促有絲分裂、運動、形態(tài)發(fā)生和抗凋亡活性等，不僅作用于肝臟組織，也可作用于多種間葉來源的組織細胞[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，HGF可以顯著促進MC3T3-E1細胞的增殖，也對細胞凋亡具有明顯的抑制作用，而且高濃度(25 ng/mL)的HGF相較于低濃度(10 ng/mL)作用更強。需要注意的是，HGF對破骨細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞同樣具有促生長的作用[13-15]。這意味著，HGF對于骨再生和重建都具有重要作用，可能在骨缺損愈合過程中能夠吸收愈合不良的異位骨痂，重建新生骨，從而維持良好骨穩(wěn)態(tài)。因此，HGF在已發(fā)生不良愈合的骨再生環(huán)境中可能具有特異性的應用前景。

已有研究發(fā)現(xiàn)，骨髓瘤細胞可以合成HGF，并且HGF在多發(fā)骨髓瘤病人的骨髓中維持較高濃度[16]。鄭彥文等[17]發(fā)現(xiàn)了HGF可以趨化誘導骨髓間充質(zhì)干細胞定向遷移，表明HGF在成骨分化過程中具有重要作用。在本研究中，ALP染色可見HGF處理后的MC3T3-E1細胞礦化結(jié)節(jié)染色陽性比例明顯升高，茜素紅染色也顯示出鈣結(jié)節(jié)數(shù)量的增加，表明了HGF對MC3T3-E1細胞礦化結(jié)節(jié)形成具有明顯的促進作用。

ALP作為反映成骨細胞分化和骨基質(zhì)形成能力的標志物[18]，在實驗組中mRNA和蛋白表達水平顯著高于對照組，表明HGF促進了MC3T3-E1的早期分化。OCN是成骨細胞的特異性生化指標，只表達于硬組織中，能夠調(diào)節(jié)礦物質(zhì)形成的速度和方向[19-20]。Runx2是成骨分化過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，是骨形成過程中最早和最具特征性的標志[21]。OSX是存在于Runx2下游的轉(zhuǎn)錄因子，僅在成骨細胞中特異性表達，主要在成骨分化晚期發(fā)揮作用[20]。通過對這些成骨相關(guān)因子的檢測，發(fā)現(xiàn)高濃度(25 ng/mL)的HGF可以顯著提高MC3T3-E1細胞中OCN、Runx2和OSX的mRNA和蛋白表達水平,與Wen等[22]對于骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的研究一致。成骨相關(guān)因子表達水平的升高意味著HGF促進了MC3T3-E1細胞的成骨分化，展現(xiàn)了HGF在骨組織再生領域的應用潛力。

綜上所述，HGF能夠促進體外培養(yǎng)的小鼠MC3T3-E1細胞的增殖，抑制其凋亡，并且能夠促進MC3T3-E1礦化誘導過程中成骨相關(guān)基因及蛋白的表達，提升細胞的成骨分化和礦化能力，在成為骨生物材料改性因子方面具有極大的潛力和發(fā)展前景。本研究為HGF在骨組織再生中的應用提供了重要的理論依據(jù)，為新型骨生物材料的研發(fā)提供了新的思路。